专利名称：将生物物质固定在基物上的方法
技术领域：
本发明关于将生物物质固定在带有Si3N4表面的基物(Unterlage)上的方法，生物物质通过键合剂与Si3N4表面以共价键键合。
生物物质的固定对于生物活性的充分利用，特别是在流体接触中具有重大意义。它不仅在工艺过程，也在分离操作过程的分析以及对于生物功能的重复利用中起重要作用。其他令人感兴趣的领域为医药领域及环境技术。
已知有许多实验试图将生物物质固定在不同的表面上，包括无机物类、如玻璃的表面，一般来说玻璃要先进行硅烷化。
在分子催化杂志(J.Mol.Catal.)43(1988)293-301中，塔米亚(E.Tamiya)等介绍了将脲酶固定在备有薄银层的石英晶体上的方法，在石英晶体表面上镀有氮化硅层。这样处理后的晶体在空气中放置24小时，洗涤并在空气中干燥。随后先用γ-氨基-丙基三乙氧基硅烷蒸镀，再用戊二醛蒸镀。这样制得的厚约100埃的薄有机表面膜被称为是低孔隙的。未确切地观察到硅烷与醛的键合。由水溶液附着到薄膜上的酶其活性相对于游离状态脲酶仅为2.25％。这种固化方法不能令人满意。
本发明的任务是一种生物物质固定的新型方法，它所采用的操作步骤少，并以可重复的方式制备较稳定的产品。
本发明的将生物物质固定在前述种类基物上的方法，其特征基本在于首先在固定基物预备带有键合活性NHX基团的Si3N4表面，然后使一方面带有NH2-反应性的醛基、酯基、卤素基团、环氧基、亚氨基或异氰酸酯基、另一方面带生物质-反应性基团的杂双官能(heterobifunktioneller)交联剂与键合性NHX-基团反应，随后再使生物物质与生物物质反应性基团偶合。
本发明其他特点见权利要求书。
本发明适用于将酶、微生物、细胞、抗体、抗原、细胞器、组织切片等固定于诸如半导体基物、箔、壁面、颗粒、建筑构件、特别是无机类等基物上，可用于前述应用范围。
氮化硅表面可例如通过CVD技术由SiH4/NH3混合物中沉积(见A.Garde et al.ESSDERC 1994-11.-15.Sept.1994 Ed.C.Hill&P.Ashburn)。它在空气中吸收氧，并在湿气作用下易水解形成Si-OH、Si-NH及Si-NH2基团。这些基团可用作反应活性官能团使生物物质通过交联剂连接到氮化物表面上。
在本发明的方法中，特别有利的是使用经稀的氢氟酸处理而脱氧化物的Si3N4表面，并用两个步骤进行酶的共价键合，其中选择交联剂，并使交联剂的一个官能团首先与氮化物表面上的NH2-基团或NH-基团反应，再让第二个官能团接着与蛋白质反应。或者亦可让交联剂首先与蛋白质反应，再使产物与Si3N4表面反应。
作为交联剂的NH2-反应活性基团有特别是醛基、卤素基团、环氧基、亚氨基或异氰酸酯基等官能团。许多可与氨基反应的基团还可见US-PS5234820。为便于实用，皮尔斯(Fa.Pierce)早已在1992/3的“免疫技术目录及手册”(Immuno Technology Catalog&Handbook)中列出了各种化合物。
为与生物物质反应，利用交联剂官能团，它可通过酶的官能团形成共价键，特别是与末端羧基或侧链基团，如-SH、-COOH或-OH，或芳环键合。因此，按发明，生物物质键合至氮化物表面上要利用杂双官能团交联剂，其中杂双官能团交联剂应理解为这样的交联剂它具有两个化学性质基本相似的官能团，但两者对于不同的反应对象反应活性不同。
杂双官能团交联剂以分步的方式与Si3N4-表面反应，再与蛋白质反应。下面详细介绍的氨基特异性反应在室温于中性至弱碱性pH值进行。升温或升高pH值可使反应速度提高，但亦促使交联剂水解速度加快。所用缓冲液应不含有交联剂的官能团可能与之反应的胺或其他化合物。
N-羟基琥珀酰亚胺酯可特异性地与伯胺反应。裂解N-羟基琥珀酰亚胺的同时，在伯胺与所用的酯残基之间形成酰胺键。若不使用水溶性类似物，则带有这些官能团的交联剂必须先溶于少量有机溶剂(如DMSO)中，然后再用含水缓冲液稀释至最终浓度。缓冲液的离子强度不宜太高，以免出现盐析效应。弱碱性pH值(7-9)可保证伯胺处于非质子化状态。
醛具有强还原性羰基。它与伯胺反应脱水。
伯胺与亚氨基酯的反应在pH8-9进行。此时酯分解，同时伯胺同亚氨基形成胍基化合物。
键合到蛋白质上现在借助于交联剂第二个仍自由的官能团进行。它们可特异性或非特异性地同蛋白质的巯基、羧基或碳水化合物(Carbohydrate)基团反应。
若交联剂具有巯基特异性基团，如马来酰亚胺，活化的卤化物或吡啶基二硫化物作为第二个官能团末端，则欲键合的蛋白质必须具有自由的硫羟基(一般来自半胱氨酸残基)。如果无这些的话，亦可由还原蛋白质二硫化物制得。也可以通过对蛋白质的伯胺进行改性来得到硫羟基供使用(Trauts试剂)。为避免此基团氧化，所用的缓冲液必须脱气。加入络合剂EDTA可避免溶液中可能存在的金属造成的氧化。
马来酰亚胺在弱酸至中性(pH6.5-7.5)介质中反应，而对卤化物和吡啶基二硫化物来说，建议pH等于或大于7。
糖解的(Glycolysierte)蛋白质可通过羟基而与糖侧链交联。若使用碳水化合物活性的具有例如酰肼作为官能团的交联剂，则蛋白质的碳水化合物基团必须首先氧化成醛(例如用NaIO4)，形成的羰基随后与酰肼反应生成半卡巴腙。
通过与碳化二亚胺反应，有可能在羧基和氨基之间产生直接键合。在酸性(pH4-5)条件下，碳化二亚胺将羧基转化成活化的酯键。它与伯胺反应生成酰胺键并裂解脲。
在使用其中的非氨基特异性官能团末端具有可光活化基团(如叠氮基苯基)的交联剂时，整个固定过程应使用红光在暗室中进行。叠氮基苯基中的叠氮基将被波长265-275nm的光照射活化。
本发明适用于将不同生物物质键合至最常见的基物或载体。它将具体通过青霉素传感器的例子加以验证，故下面的叙述涉及此。这里涉及到几个图。这些示意性地示出
图1传感器原理(测定装置)，图2浓度范围10-4-10-1M青霉素的典型测定曲线，和图3本发明传感器的校正曲线实施例在P-或P+掺杂的硅片(1mOhmcm-30Ohmcm)上，首先通过热干燥氧化法在700至1200℃(此处1000℃)在扩散炉中制得厚度5-100nm的不导电SiO2层。然后通过在气相化学沉积(PECVD)制得同样不导电的氮化硅层，厚度10-100nm。反应气体中SiH4/NH3比例为2∶1，基物温度200-500℃(此处300℃)，沉积时压力为1-3Torr(此处为1.5Torr)。在N2中退火(700-1000℃中5-60分钟)。最后在基物未经打磨的一面设欧姆接触(如10-1000nm Al，Au)。所使用的物质在基准压＜10-5毫巴进行真空热蒸镀而涂上。沉积速度在0.1～10nm秒/之间。接着将硅片在RTA-炉中于150-500℃(此处400℃)在N2气氛中退火。
在酶固定过程即将开始之前，将硅片在丙酮、2-丙醇和蒸馏水中在超声浴中清洗，用稀氢氟酸(1-10％HF)浸蚀10-60秒(此处30s)。
使用杂双官能团交联剂ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)时，先将其溶于少量DMSO中，然后用0.2M三乙醇胺缓冲液(pH5～9)稀释至终浓度0.5～10mM。将溶液涂至Si3N4表面上，并在室温保持5-40分钟。在更低温度时则必须保持更长时间。未键合在氮化硅表面的分子用三乙醇胺缓冲液(TEA)冲洗掉。然后将酶(青霉素酶I型，Bacillus Cereus，Sigma P 0389)溶于不含氨基的缓冲液(如TEA，特别是不是TRIS-或甘氨酸缓冲液)中，(1000-5000单位/ml)，然后置于已用交联剂处理过的氮化硅表面上。在4-60℃温度，特别是室温保持1-240分钟(此处15分钟)后，用波长320-350nm的光引发酶分子键合到交联剂中仍自由的官能团上。固定操作结束后，将适用的青霉素传感器用0.1M TRIS一缓冲液(pH7-8)及蒸馏水冲洗，并在空气或N2或惰性气体中干燥至少10分钟。
随后用按此法制得的场效应传感器在水溶液中进行青霉素浓度测定。
图1示出测定装置图解。本发明所制得的场效应传感器由硅基物1，绝缘层2(SiO2和氮化硅)、交联剂层3和酶层(青霉素层)4组成，并合至一个测试元件中。测试元件充满含水的测试溶液，所含青霉素G的浓度为10-5至1M。在测试溶液6中加入参比电极(如Ag/AgCl)7。在参比电极7和硅基物上的接触电极8之间测电势。
图2为典型测定曲线图，它以CONCAP(恒容)方式给出青霉素浓度范围10-4-10-1M的情况。青霉素G钠盐(Sigma P3032)为此溶于10mMTRIS-HCl缓冲液，pH为7。随着青霉素浓度增加，所产生的青霉烯酸(Penicilloinsaure)的浓度也在增加，由此紧靠起pH-传导器作用的氮化硅面的氢离子浓度亦随之增加。这会导致氮化硅/电解质边界层电势变化，电压值变正或变负。随着时间变化可观察到酶反应中浓度依赖性的电势变化。在所标明的时间内测试液发生变化。
图3是由图2得到的化学转换特性曲线。它给出本发明方法制备的场效应传感器的校正曲线。此曲线线性范围部分符合能斯特方程，即在此范围内，青霉素浓度与其相应的电位存在对数关系，这样得出测量电位式的化学或生物传感器的灵敏度。本发明所制传感器的该范围为p[青霉素G]2.3～3.3，对应于0.5至5mM。灵敏度为每10个单位50mV。
线性测量范围的准确位置及绝对灵敏度基本上取决于缓冲液组成、浓度，即缓冲能力和pH值。通过适当选择这些参数可以按需要调整测量所需的测量范围。例如，在使用咪唑缓冲液(pH7)时，线性测量范围在2至20mM青霉素，而对于HEPES-缓冲液，线性范围为约1-10mM。增加pH值则校正曲线线性范围的位置向青霉素高浓度区移动，而降低pH值则线性范围相应下降。
按本发明制得的传感器显示出高于140天的高稳定性。其灵敏度为50mV每10个青霉素单位。
也可制造场效晶体管(Feldeffekttransistor)，它在栅区具有与本发明所述的电容层结构相同的构造。
权利要求
1.将生物物质固定在具有Si3N4表面的基物(Unterlage)上的方法，生物物质通过键合剂以共价键方式键合到Si3N4表面上，其特征在于，在固定基物上配备具有键合活性NHX-基团的Si3N4表面，使一方面带有NH2-反应活性的醛基、酯基、卤素基团、环氧基、亚氨基或异氰酸酯基，另一方面具有生物物质反应活性的基团的杂双官能团的交联剂与键合活性的NHX基团反应，生物物质与生物物质反应活性的基团偶联。
2.按权利要求1的方法，其特征在于交联剂的生物物质反应活性的基团或官能团是可与蛋白质末端或侧链官能团反应的基团。
3.按权利要求1或2的方法，其特征在于选用带有这样的生物物质活性基团的交联剂，所述生物物质活性基团与羧基、硫羟基或羟基反应或与芳环键合。
4.按前述权项要求之一的方法，其特征在于，在固定基物上通过CVD法由Si3H4/NH3混合物沉积厚度为10-1000nm的Si3N4层，并通过水解表面净化法配设具有键合活性的NHX-基团。
5.按前述权利要求之一的方法，其特征在于作为生物物质，将酶、微生物、细胞、抗体、抗原、细胞器或组织切片固定在半导体基物、箔，壁面或颗粒，特别是无机物基物上。
6.权利要求1的改进方法，其特征在于，为利用交联剂进行键合，首先使交联剂与生物物质反应，然后再与Si3N4表面键合。
全文摘要
为将生物物质，例如酶、微生物、细胞、细胞器等，固定在带有具有键合活性NH
文档编号G01N33/543GK1166204SQ95196190
公开日1997年11月26日 申请日期1995年9月30日 优先权日1994年10月8日
发明者M·瑟斯特, M·J·斯科宁, J·弗特, U·B·科普, P·科多斯, H·露思 申请人:于利奇研究中心有限公司