专利名称：粪便样品中幽门螺杆菌的免疫测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法。
幽门螺杆菌是一种在人的胃肠道上部发现的细菌，已经发现它与胃十二指肠疾病如消化性溃疡、胃炎和其它疾病有关。按来源把该细菌分在弯曲杆菌属，然后根据有关它的超微结构和脂肪酸组分方面更详细的资料再分在螺杆菌属。
许多不同的技术，如侵入性诊断技术和非侵入性诊断技术已用于测定幽门螺杆菌。侵入性诊断技术包括胃活组织的检查和培养物。非侵入性诊断技术包括脲呼吸试验，其中用饮料的方式给患者用C-13或C-14标记的脲，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)中的抗原测定血清中的幽门螺杆菌的抗体。在Aleonohammad的美国专利5,262,156和Blaser的欧洲专利申请0 329 570中能够发现后一种技术的例子。
目前已经鉴别出了好几种主要的抗原并用于测定幽门螺杆菌抗体的免疫测定法中。但是，这些测定法在血清学诊断方面不具有特异性和敏感性。Newell，D.G.，等，Serodian.Immunother.Infer.Dis，.31-6(1989)。这些免疫测定法的一个问题是交叉反应性。对幽门螺杆菌中的主要抗原，尤其是分子量为60Da的假鞭毛蛋白的研究表明这些抗原中的一些对幽门螺杆菌不是特异的并且也在其它细菌如空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌中发现。在设计对幽门螺杆菌的免疫测定法中遇到的第二个问题是菌株的变异。在不同的幽门螺杆菌菌株中已经发现在抗原方面有许多差异。这些问题排除了用单一抗原设计一种测定法。它们也排除了使用单克隆抗体。人们已经尝试改良对幽门螺杆菌抗体免疫测定法的特异性和选择性的一种途径是使用来自不同幽门螺杆菌菌株抗原的混合物，该混合物是用特定的抗原片段富集的。测定血清中幽门螺杆菌抗体的一种酶联免疫吸附试验在商业上能够从Meridian Diagnostics得到。这种测定法使用了一种细菌全细胞溶解产物作抗原。
使用一种用抗原测定幽门螺杆菌抗体存在的ELISA有一些缺点。具体是，在治疗感染后人血清中的抗体效价在较长时期内(一些情况是6个多月)仍保持较高。所以，用这种ELISA的阳性试验并不意味着患者目前被感染和需要治疗幽门螺杆菌的感染。当遇到阳性ELISA时，治疗医生通常要求作胃活组织检查来确认在开始抗生素治疗前存在该细菌。所以，以抗原为主的ELISA不能消除对侵入性诊断技术步骤的需求。相反，如果能够设计一种免疫测定法测定幽门螺杆菌抗原替代抗体，由于在患者治疗期间一般测定不到抗原，所以能够显著性地减少对胃活组织检查确认感染的需求。这样，就对测定幽门螺杆菌抗原的ELISA有一种需求，更具体地说，对直接从粪便样品中测定幽门螺杆菌的ELISA有一种需求。
尽管人们已知测定粪便样品中微生物如Campylobacter difficile和腺病毒的ELISA，但是，在对幽门螺杆菌呈阳性的患者的胃活组织检查的研究中，该细菌一般不能被培养和从粪便样品中分离出来。这一点和交叉反应性和菌株变异的问题使得可能设计一种对幽门螺杆菌特异并对从粪便样品中直接可靠地测定幽门螺杆菌抗原足够敏感的ELISA更值得怀疑。
发明概述本发明提供了一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的一种粪便样品悬浮于样品稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用一种检测剂进行标记；和(e)测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。
在本发明的优选实施方案中，把第一种抗体结合在了一种载体上并用一种酶标记第二种抗体。也提供了三步三明治的测定法。
该免疫测定法将以试剂盒的形式提供，其中试剂盒包括涂有抗体孔的板，样品稀释液，标记的抗体，如酶-抗体结合物，洗涤缓冲液和在ELISA时，一种底物溶液。
详细描述本发明的免疫测定法使用了幽门螺杆菌的多克隆抗体。这些抗体能够从致敏动物的血清中获得。把抗原注射到产生抗体的样品一般是哺乳动物并优选兔子、山羊或牛来完成致敏作用。一般给一个起始量的注射，接着依次是增强剂量的注射使反应达到最大。理想的注射方法是以多倍剂量形式给白色新西兰兔子。所注射的抗原量必须足以能够引出可测定的足够量的抗体。用试验出血法和间接荧光测定法可证实抗体的产生。
现在已经发现ATCC菌株43504的幽门螺杆菌特别适用于产生多克隆抗体。如上所述，已经在幽门螺杆菌中观察到了大量菌株的变异。在不同地理区域以及饮食群中也观察到了有机体的差异。尽管如此，已经发现用菌株43504的细胞致敏得到的抗体用于测定地理区域和饮食群的有机体。如果必要的话，例如，如果发现ELISA在测定特定人群中的有机体无效的话，可把来自一种以上的幽门螺杆菌菌株细胞用于产生抗体。
在已知免疫测量方法中所用的相同标记物能够用于标记本发明所用的多克隆抗体。在这些标记物中可以提到如美国专利3,940,475所述的用于荧光测定法测定的荧光标记物，如美国专利3,654,090所述的酶标记物和放射性同位素如碘-125。最常用的酶标记物之一是辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶。下列实施例3详细描述了用HRP标记的抗体。
用于从被试验的粪便样品中提取抗原物质的方法所用的未标记的多克隆抗体能够固定在任何一种免疫测定法中常用的支持物上。在这些支持物中可使用的是滤纸、塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯或其它适当的试管。把抗体结合在这类物质上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。
为了制备用于该测定法的粪便样品，把样品分散在以蛋白质为主的样品稀释液中。把该稀释液配制好并将其缓冲使其交叉反应性最小。作为样品稀释液的例子，能够提到的是胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白(BSA)。现已发现一份粪便样品和四份稀释液的稀释液是可用的。除了使用蛋白质为主的附加剂外，加入清洁剂和增加或降低pH值或稀释缓冲剂的离子强度也能减少交叉反应度。例如，许多样品稀释液以0.05％到2％之间范围浓度含有TritonX-100和/或Tween 20。加0-2.9％ NaCl可改变缓冲体系的离子强度。这些变化通过降低形成中的弱的或非特异性反应来导致较好的特异性。
在用于测定法中的抗体溶液和洗涤液的配制中也能体现交叉反应度。该抗体能够在缓冲液中结合上述提到的一种蛋白脲而被提供。通过加入盐和表面活性剂来控制交叉反应度能够配制和缓冲该测定法中所用的洗涤液。降低交叉反应度的优选洗涤液是磷酸盐缓冲溶液。
通过下列非限定性的实施例更详细地说明抗原的配制、多克隆抗体的生产和ELISA。
实施例1幽门螺杆菌抗原的制备在用5％去纤维蛋白的羊血补加的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上划线分离幽门螺杆菌(ATCC菌株43504)。在37℃微需氧量的环境下把平皿温育6-7天。用克隆形态学、脲酶、过氧化氢酶氧化酶反应和革兰氏染液评估所得到的细菌生长。把可接受的生长传代培养到四个有羊血的琼脂平皿上并在37℃微需氧量的环境下生长3-4天。
用5ml的0.85％NaCl浸没每个平皿并用一台平皿涂布器收集细菌生长。在2-8℃下以10,000xg把细菌离心分离15分钟。把各个粒状沉淀再悬浮于3ml的0.85％NaCl中并汇集在一个离心容器中。在2-8℃下以10,000xg把细菌悬浮液离心分离15分钟。如上把粒状沉淀再悬浮和离心。把最后的粒状沉淀再悬浮于初始总体积的3％的20mM磷酸盐缓冲液中。把该细菌细胞转入一个冰冻的容器中并在不产生泡沫的最大设置下超声处理5次各3分钟，在两次循环之间静置30秒。在2-8℃下以57,000xg把超声处理的细菌细胞离心分离15分钟。收集细菌上清液并除去粒状沉淀。
实施例2兔多克隆的生产用等份的弗氏完全佐剂(总免疫原是1.0ml)等份稀释实施例1中所得到的细菌上清液使得每毫升含1×108个细胞。把该溶液完全混合并将该溶液0.2-0.5ml肌内注射到右后腿，把该溶液0.1-0.25ml皮下注射到背部8到10个部位。一个月后用弗氏完全佐剂连续注射，注射部位限定在背部皮下。
三个月后取试验血液。在第三次注射后一周从耳中央静脉取血。在2-8℃把该血液温育过夜。第二天在室温下以5,000xg把该血离心分离15分钟。收集上清液并去掉粒状沉淀。用间接荧光测定法(IFA)测试该上清液。把10μl幽门螺杆菌悬浮液放在玻片上并加热固定进行IFA。用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭该玻片5分钟，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)和0.5％Tween 20(PBS/Tween洗液)冲洗。加入50μl用含有叠氮钠的磷酸缓冲盐水(PBSA)稀释为1∶10的试验血和作为对照的正常兔血清并在潮湿环境下温育30分钟。用PBS/Tween洗液冲洗后，用PBSA把偶联到FITC(异硫氰酸荧光素)的山羊抗兔稀释为1∶10并每孔中加入50ul。在黑暗潮湿的环境下把玻片温育30分钟。再冲洗玻片。加入荧光测定封固剂和盖玻片并用一台荧光显微镜观察。然后把证实血清荧光稠度读数在4+的兔放出一定量的血。
除了从各只兔子中取50ml外，得到与试验血相似的血量。将作为试验血的该血温育并离心。
测定血清总体积并加入等量的磷酸缓冲盐水(PBS)。进行40％硫酸铵沉淀反应除去不需要的蛋白质并在2-8℃温育24小时。把该混合物转入一只离心试管并在室温下以10,000xg离心分离30分钟。把粒状沉淀再悬浮于PBS中使其大约是原始容量的三分之一。在2-8℃用总上清液容量200倍的pH6.5的0.0175M的磷酸钾透析该悬浮液。透析后，在室温下以10,000xg把悬浮液离心分离20分钟。收集上清液并除去粒状沉淀。
在室温下用pH6.5的0.0175M磷酸钾平衡DEAE(二乙氨乙基纤维素)柱。把该上清液放在柱上并收集流出物的馏分。测定蛋白浓度(OD280)并集中大于0.200的全部馏分。用ELISA测定所集中的抗体。
实施例3辣根过氧化酶的偶联偶联使用了10mg的DEAE纯化的兔抗幽门螺杆菌的抗体。通过浓缩方法或加入pH9.6的10mM的碳酸氢钠的方法使抗体的最终体积为2.5ml。用pH9.6的10mM的碳酸氢钠平衡PD-10柱(Pharmcia)。向柱上加入该抗体并取九种馏分各1.0ml。测定各馏分的蛋白浓度(OD280E.O.＝1.4)并集中读数在0.200以上的馏分。
用pH4.3的1mM三水醋酸钠平衡分离用PD-10柱。对每1mg抗体来说所用的辣根过氧化酶(HRP)的最小量是1.172mgHRP。称量1-1/2倍的最小计算量HRP并加入1.0ml的去离子水。进行蛋白浓缩(OD403E.O.＝2.275)并用去离子水把HRP稀释到10mg/ml。以每4mgHRP的0.2ml浓度加入0.1M的间过碘酸钠。在室温轻微摇动下使该反应进行20分钟。以每ml的HRP用4mg的量加入50ul的2M乙二醇来终止反应。用pH4.3的1mM的三水醋酸钠把HRP通过PD-10柱洗脱。
偶合率为1mg抗体比1.172mgHRP。用10mM碳酸氢钠调节该抗体的pH为9.6和用1mM的三水醋酸钠调节HRP的pH为4.3。在专用烧瓶中合并这两部分并用0.2M的碳酸氢钠调节pH使其从9.6到9.6。避光保护，在室温85-95rpm的旋转器上把该混合物温育两小时。两小时后，向每8mg抗体中加入0.1ml的4mg/ml的硼氢化钠。把新混合物在4℃的旋转器上温育两小时。使该偶联物通过用PBS平衡的PD-10柱并收集含有该偶联物的馏分。汇集该馏分并浓缩到大约1.0ml。把该浓缩物放在流速为10ml/小时的用PBS平衡的Sephracryl S-200柱上。收集2.0ml馏分并对抗体和HRP进行蛋白浓缩。汇集在OD280和OD403处具有相同峰的馏分并浓缩到大约1.0mg/ml。
下列实施例4说明一种称作“向前”测定法，其中把结合在支持物上的抗体首先与被测试的样品接触通过形成一种抗体/抗原复合体并把该复合体与一种已知量的标记抗体接触的方法来从样品中提取抗原。但是，本领域普通技术人员也能想到用称作“同时”或“反向”测定法进行免疫测定。同时测定法包括同时把结合到固体支持物上的抗体和标记的抗体加到被测试的样品中的单一温育步骤。完成温育后，冲洗固体支持物除去残余样品和未复合标记的抗体。然后测定与固体支持物相连的标记抗体的存在。反向测定法包括先把标记的抗体溶液加到粪便样品中，接着加入结合在支持物上的未标记的抗体的步骤。温育一秒钟后，用常规的洗液冲洗该支持物使其不含残余的样品和未反应的标记抗体。
实施例4ELISA试验用PBS连续稀释抗体在20ug/ml和2.5ug/ml之间。把0.100ml等份的各稀释液加到Immunlon-II试纸(Dynatech)，覆盖并在室温下温育过夜。用PBS/Tween洗液把平皿冲洗一次。在室温下用1％BSA/PBS将其封闭1小时。再用PBS/Tween洗液冲洗一次。用0.1％BSA/PBS把几个阳性和阴性样品稀释到1∶5。把各样品(0.100ml)加入试纸的孔中，覆盖并在室温下温育1小时。用Meriflor C/G洗液把平皿冲洗5次。把上述得到的偶联到辣根过氧化酶的兔抗幽门螺杆菌稀释到10ug/ml并向各孔加入0.100ml。遮盖平皿并在室温下温育1小时。再用PBS/Tween洗液冲洗五次，然后在室温下用0.100ml三甲基苯塞啶(trimethylbensidine)(TMB)溶液展开10分钟。用0.050ml 2NH2SO4终止并在两分钟后读数。选择能够产生最大信号和最低背景的稀释液作理想的稀释液。
通过把标记抗体的测定值与从含有已知量的抗原的校准样品所得到的测定值比较来进行定量测定。下列表1显示了当通过该测定法进行每个含有预定量数目有机体的四种样品测定时所得到的光密度。
表1有机体的数目每ml OD450/6303×1072.5471.9×1070.6624.6×1060.1821.1×1060.038经过该测定法操作六种临床样品的结果显示在表2中。
样品OD450/630结果1 0.301 阳性2 0.713 阳性3 0.284 阳性4 0.005 阴性5 0.033 阴性
6 0.008 阴性按照本发明称作三明治的测定法也能够用于测定粪便样品中的幽门螺杆菌。现有技术中已知三步测定法并且该基本方法能够用于测定粪便样品中的幽门螺杆菌。三步测定法一般是这样进行的把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便样品分散到一种最小交叉反应度的样品稀释液中并把稀释的样品加入到一种已经从第一种产生抗体的动物中得到的幽门螺杆菌的固相抗体中。把该样品温育形成抗体-抗原复合物。冲洗固相支持物上的过量样品后，把一种从第二种产生抗体动物中所得到的并作为初级抗体的已知幽门螺杆菌抗体加入该抗体-抗原复合物中并温育来形成一种抗体-抗原-抗体复合物。在形成该复合物并除去未反应的抗体后，把该复合物与一种作为二级抗体的已知抗体反应，其中的二级抗体是一种产生二级抗体种类如抗-(兔、牛或山羊)的免疫球蛋白。用常规方法(一般用酶)标记二级抗体并与抗体-抗原-抗体复合物温育来形成三抗体复合物或三明治。在除去未反应的二级抗体后，用常规方法测定抗原。在使用酶标记中，把一种底物加入该抗原和三种抗体的复合物中并控制底物与连接酶的反应来测定存在于样品中的抗原量。在这种作为基础测定法的三明治测定法中，如果必要的话，配制或缓冲洗液和抗体溶液来控制交叉反应度。
经过详细描述本发明和通过参考优选实施方案，在不超出下列权利要求中所限定的范围内可能的改良和变化对本领域普通技术人员都将是显而易见的。
权利要求
1.一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于一种样品稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用一种检测剂进行标记；和(e)测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。
2.根据权利要求1的方法，其中把第一种抗体结合在一种固体载体上，用一种检测剂标记第二种抗体。
3.根据权利要求1的方法，其中用一种检测剂标记第一种抗体，把第二种抗体结合在一种固体载体上。
4.根据权利要求1的方法，其中的样品稀释液是一种以蛋白质为主的稀释液。
5.根据权利要求1的方法，其中的多克隆抗体是通过用幽门螺杆菌细胞把一种产生抗体的哺乳动物致敏得到的。
6.根据权利要求4的方法，其中的样品稀释液含有选自于由胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白组成的一种蛋白。
7.根据权利要求1的方法，其中把该复合体暴露给第二种抗体之后，用一种能够降低交叉反应度的缓冲液或能够改善该测定法特异性的其它缓冲液洗涤该复合体。
8.根据权利要求5的方法，其中的细胞是来自多种幽门螺杆菌菌株的细胞。
9.根据权利要求3的方法，其中的检测剂选自于碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶辣根过氧化酶。
10.根据权利要求7的方法，其中的洗涤用磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求5的方法，其中的细胞是来自ATCC菌株43504的细胞。
12.一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于样品稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)测定标记的抗体量并反过来测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。
13.一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于样品稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与产生第一种抗体的样品所产生的幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把步骤(b)中形成的抗体-抗原复合体与从产生第二种抗体的样品中获得的幽门螺杆菌抗原的初级多克隆抗体接触以产生一种抗体-抗原-抗体复合体；(e)除去这种初级抗体，使其不存在于步骤(d)的复合体中；(f)把步骤(d)中形成的抗体-抗原-抗体复合体与二级抗体接触，所述的二级抗体是产生第二种抗体的样品的一种抗体，由此，该二级抗体与抗体-抗原-抗体复合体形成了复合体；和(e)测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。
14.一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的试剂盒，它包括已结合有幽门螺杆菌的多克隆抗体的多孔板，以蛋白质为主的样品稀释液，幽门螺杆菌的酶多克隆抗体的偶联物，洗涤缓冲液和底物溶液。
全文摘要
一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀凝含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于样品的稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用检测剂进行标记；和(e)测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。
文档编号G01N33/569GK1165299SQ9710311
公开日1997年11月19日 申请日期1997年3月12日 优先权日1996年5月9日
发明者C·V·拉卡, C·S·A·伊, K·J·科扎克 申请人:默里迪恩诊断公司