快速测量细胞层的方法

专利名称：快速测量细胞层的方法
技术领域：
本发明涉及快速测定离心分离的物质层的体积的方法。本发明的方法特别适用于对抗凝全血的离心分离血样进行血组分的计数测量。
在科学文献中早已报导过对抗凝全血的离心分离血样进行血细胞计数测量的方法，并且，在Stephen C.Wardlaw等人的美国专利No.4027660(1977，6，7)中也公开过可方便地测量某些血细胞和其它组分层的方法。在该专利提出的方法中，抗凝全血血样被装在一个含有塑料浮子的精密毛细管中进行离心分离。该浮子使某些细胞层和血小板层发生线性膨胀。
在实施上述专利的方法时，试样以12,000转/分进行离心分离约5分钟，然后测量血细胞层和血小板层的膨胀长度。这种方法的问题之一是要获得可靠的浓聚层特别是血小板层必须采用相当高的离心分离转速。如果组分层浓聚不完全或者浓聚层不均匀，采用这种方法所得到的结果便不准确。要达到上述高的离心分离转速需要有昂贵的离心装置，而且管子破裂的危险性增大。另一个问题是必须要有至少五分钟的离心分离时间，这是许多医疗场合所不希望的。这种方法的又一个问题是操作者必须从离心台上取下管子，再把它放入阅读器中。由于这一操作必须在离心分离后限定的时间内完成，故操作者必须密切注视试样，这不仅是一种低效率的工作，而且还可能要操作者与有潜在危险的试样相接触。
最好能在短的时间内、以较低的离心转速来测量血组分层，并且/或者减少试样管的转移次数。
本发明提出一种能在可重力分离的混合物试样例如抗凝全血试样的离心分离过程中快速测定各物质层体积的装置。此外，本发明还涉及一种能在离心分离工步完成之前、就在抗凝全血试样的离心分离过程中测定出血组分体积和进行血组分计数的方法。本发明的方法采用一种能够进行离心分离和读出数据的综合离心分离装置与读出器的装置，从而使上述美国专利中所公开的测量物质层的操作加以简化。本发明的方法是一种对血细胞浓聚层的动态分析方法。根据本发明的原理，能够以较低的离心分离转速，例如约8000～10000转/分定量地分析白血细胞和血小板层(当然，也可采用较高的离心速度，如12000转/分)。
在抗凝全血试样离心分离时重力形成血细胞层的过程中，有两种反作用力起作用，即血细胞和血样中形成的其它组分的向外浓聚和血样中的血浆的向内渗滤。由于离心分离过程中血细胞和血样中形成的其它组分层的沉积作用，使各组分层浓聚而减小层的高度。与此同时，血样中的液态组分(血浆)则通过浓聚层而渗滤。
为了使细胞发生浓聚，液态组分必须移动，但由于细胞层连续地浓聚，使液态组分的渗滤通道越来越曲折。细胞层的浓聚起初快速发展，但随着浓聚度的增加和渗滤作用的越发困难，使细胞的浓聚越来越慢。因此，浓聚速率是非线性的。由于液体粘度和/或其它因素的差异，不同血样间浓聚速率相差很大，故在细胞层完全浓聚前读出的细胞层的单一读数不能用来外推求出最终的细胞层浓聚程度。因此，完全浓聚的细胞层的厚度(高度)不能由在离心分离过程中读出的细胞层的厚度(或高度)的单一读数来确定。这就是传统方法确定最佳离心转速和时间的依据，因此，细胞层的厚度只有在确认细胞层不再进一步浓聚之后才测量。这一“完全浓聚”的离心分离时间被认为是在测量任何离心分离的抗凝全血组分层之前所需的最短时间。
本发明人发现，血细胞层的最终浓聚程度固有的不可预测性可以由这样的方法来克服，即在进行离心分离过程中，测出细胞层厚度的几个独立的初始数据，然后将所得到的数据与可预测完全浓聚细胞层厚度的非线性数学规则相拟合。这种方法不要求物质层最大浓聚，实际上，完全浓聚的细胞层厚度可以在仅仅测出4或5个初始细胞层厚度之后用数学方法预测出来。此外，本发明的方法可以在较大的离心转速范围内准确地算出血细胞层的最大浓聚程度，从而得出充分浓聚的细胞层的厚度。因此，可由在低速离心分离抗凝全血试样的过程中测出的细胞层的多个厚度数据准确地预测出在很高的离心转速(例如现有技术所要求的转速)下进行较长时间的离心分离工步所得出的细胞层的最大浓聚度。
本发明的方法包括使用一个离心分离装置；一个荧光染色剂激发光源；一个光测器和一个用于控制上述装置的工作并收集来自该装置得出的读数的数据的微处理机控制器。上述的光源最好是一种能定期地照亮血样管中正在离心分离的血样的脉冲光源。当血样管中的血样被照亮时，便会使某些血细胞组分发出荧光，并使红细胞层发光，结果，光测器便能识别出在离心分离过程中试样管中重力浓聚的各种细胞层。通过对光源和光测器设置适当的滤光器，便能测出由物质层反射出来的光和荧光。而且，如果将光源设置在与光测器相对的地方，或者在毛细管的后面设置反射镜，也能测出透过毛细管的光。光源的脉冲与离心分离时试样管的位置是同步的，因此，试样管在经过光测器时便被照亮。实施本发明方法所用的光学仪器和滤光器大致与S.C.Wardlaw的美国专利No.4558947(授权日为1985.12.17)中所公开的相似，故将该专利的内容结合作为本发明的参考。
如果采用上述的动态方法分析血样，可在离心分离过程中定期地截取几个血样组分层的浓聚程度的图象，并将连续的组分层图象贮存在本装置的微处理机控制器中。在截取并贮存了足够数目的图象(约4个或5个图象)之后，微处理机控制器便能计算出被测量的一个或多个组分层的最大浓聚度，并显示出其计算值。至此，试样的离心分离便告结束。微处理机控制器根据指令按下面步骤控制上述装置的工作开始离心分离；监控离心转速；使光脉冲与过程中的离心转速同步；控制光测器的工作；接收和贮存组分层的读数；计算组分层浓聚的最大浓聚度，并显示组分的计数值或分析值；和关闭离心装置。因此，操作者仅需要将血样管放到离心台上并开始操作本装置即可。为了方便操作并保证操作者的安全，血样管可放入在本发明的共同未决的美国专利申请USSN 08/755363(申请日为1996.11.25)中所述的一般类型的专用盒子中。
另一方面，如果要测定经过固定的离心分离时间后最终的细胞浓聚程度，可在固定的离心分离时间后，在连续的离心分离过程中截取一个或多个图象，并由此分析组分层的厚度。因此能体现不需要从离心台将血样管转移到独立的阅读器上便可测出细胞层浓聚度的优点。
为此，本发明的一个目的是提供一种在实际达到最终的层厚之前便能测出离心混合物中最终的物质层的厚度的方法。
本发明的另一个目的是提供一种可在经过固定的离心分离时间后，于试样仍处在离心分离状态的同时读出物质层的厚度的方法。
本发明的又一个目的是提供一种方法，其特征在于，所分析的混合物是一种抗凝全血试样。
本发明的再一个目的是提供一种方法，其特征在于，在混合物的离心分离过程中检测并贮存多个连续的初始层的界面位置的数据，并由所获得的界面数据计算最终的层厚。
本发明的又一个目的是提供一种方法，其特征在于，可从初始的层厚测定值算出试样离心分离过程中多个物质层的最终厚度。
从下面结合附图对本发明的详细说明中将会更明了本发明的上述的及其它的目的和优点，附图中

图1是盛装混合物试样的管子在离心分离时的简单视图；图2是混合物在离心分离过程中以层厚对离心分离时间作出的层浓聚的动态曲线图；图3是表示在血样以两种不同的转速进行离心分离的特殊情况下如何计算血小板层的最终高度、并由血小板层高度对离心分离时间的倒数作出的曲线图；图4是用于实施本发明方法的血样测试装置的简单透视图；图5是设计用于本发明的离心台板和传动机构的最佳实施例的透视图；图6是用于实施本发明方法的试样管的夹持机构和转动机构的局部透视图7是用于实施本发明方法的试样管转动机构的剖视图。
下面说明实施本发明的具体实施例。
参见图1，图中示出一个具有透明侧壁4且底部封闭的管子2。管子2中充满了悬浮在液态组分6中的粒子组分的混合物。图1中分别以箭头A和B表示当粒子组分与液态组分混合物在离心作用下的粒子浓聚和液体渗滤的动力学。当进行离心分离时，粒子组分将按照重量分析规律与液态组分6分离，并在某一时刻形成一个界面8。当继续进行离心分离时，界面8继续下降，越来越离开液态组分6的上表面7。应当明白，根据试样种类的不同，在试样进行离心分离时，可以形成一个以上的界面8。
业已发现，当要在整个分离过程中对粒子组分/液体的位置(或者说不同组分间的界面)8进行监控时，界面的顺序位置可按图2所示的典型函数曲线10表示，从曲线10可以看出，界面位置的初始变化较快，但随着粒子组分的逐渐浓聚，界面位置的移动明显减慢。在某一时刻，粒子组分停止浓聚，此时，粒子组分与液态组分的分离宣告完成。在本发明的内容中，将这种粒子组分停止浓聚的现象称之为“最大”的浓聚，这在图2中以虚线11表示。
应当注意，当对悬浮在液体中的多种粒子组分的复杂混合物(例如抗凝全血)进行离心分离时，也会出现同样的现象。在这种情况下，会按重量分析规律形成多个粒子组分层，而液态组分6则渗滤到离心管2的上部。血就是这样一种复杂的粒子组分混合物的例子，因为血中的红细胞根据密度的减小依次重于粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板，并且，血样中的所有细胞都比血样中的血浆重，当对抗凝全血试样进行离心分离时，各种细胞/细胞和细胞/血浆的界面将以如图2所示的相同的普通方式通过血样而下降。应当注意，在某种情况下，在复杂的物质混合物(例如全血)中，中间层的厚度可能实际上比浓聚层厚。这种情况在目标组分从混合物中分离的速度超过该层的浓聚速度时便会产生。但是，在所有的情况下，都可对其进行同样的数学分析和外推分析，并且，其结果与对厚度减小的层所进行的分析一样。
由试样离心分析时任何粒子组分界面位置(也就是该组分层的厚度)的变化速度作出的曲线基本上是一种双曲线。这一点可以用于数学预测离心试样中粒子组分层的最大浓聚程度，从而预测粒子组分层或多个粒子层的最大厚度或最大体积。
应该明白，细胞层的浓聚不是从时间为零开始便立即按双曲线函数发展的。要确定界面的移动何时才到达遵循双曲线函数的点，从而计算出最大的浓聚度，只需定期监测界面位置或层厚并连续计算斜率值s＝dp/(1/t)，式中，S为变化的斜率；dp为界面位置(或层厚)的变化；t为自开始离心分离所经过的时间。当s的连续值不再发生变化时，便可收集随后的几个初始数据点，并由此计算出最大的粒子层浓聚度。
图3示出以两种不同的速度(即8,000转/分和12,000转/分)进行离心分离的同一种抗凝全血试样的具体实施例，其中，图2所示的双曲线斜率由于以连续的离心分离时间的倒数对不同的两种离心速度下浓聚血小板层界面8的连续的厚度测量值作图而呈线性关系。直线14大体代表以高的离心速度(12,000转/分)对试样进行离心分离时血小板层厚的变化速率；而直线12则大体代表以低的离心速度(8,000转/分)对试样进行离心分离时血小板层厚的变化速率，后者的离心力G仅为前者的40％。
为了确定斜率的变化速率，连续测出一系列的初始血小板层厚16，并计算出最小二乘拟合值，从而得到初始层厚数据点16中的最佳轨迹18。为了计算最大的浓聚层厚，将回归函数外推到一个最长的离心分离时间(在这种情况下，离心分离时间为无穷大时其倒数值为0)。在这一点上，y轴上层厚变化速度曲线的截距便代表最大的浓聚层厚度。应该注意，尽管离心速度有所不同。但最终结果是相同的，并且，只需花极短的时间，例如2～3分钟(现有技术要花5～10分钟)便能得到所需读数。可以在连续进行离心分离的同时，获取初始测量值。
下面参见图4，图中示出了离心分离部分和读数器相结合的组件(总的以标号1示之)的简图。组件1含有一个带有用来夹持透明的毛细管9的凹槽5的离心台板3。毛细管9可以直接放入凹槽5内，或者夹在一个在未决专利申请USSN 08/755363(申请日1996.11.25)中所述的那种盒子(未示出)中。无论采用哪一种方法，毛细管9至少要有一个表面是透光的，以便采集管子中所含物质的所需的光学信息。离心台板3由马达13带动旋转，该马达13由来自微处理机控制器组件17的输出线路21控制。马达13的转动速度由控制器17通过线路19监控，以便调节马达的转速从而调节离心台板3的转速。当离心台板3的转速达到其预定的工作速度(可以是约8,000～12,000转/分)时，控制器17将根据所要求的分析种类而动作。最好按一定的离心分离时间读出物质层的浓聚数据，而控制器17则按所需的固定时间间隔使马达13供电，而后，在连续进行离心分离的同时，读取层浓聚数据。
另一方面，如果需要动态地测定物质层的浓聚度，则应读出毛细管9中重力浓聚血细胞层高度的多个顺序读数。当台板3转动时，台板3侧面上的分度器15从传感器23旁边经过并与其互相感应，该传感器23通过线20将信号传到可编延迟器22处。分度器15可以是永久磁铁的，而传感器23则可以是一种霍尔效应传感器。此外，分度器15也可以是一种位于台板3边缘的反射件，而传感器23则可以是一种红外线发射-接收对。另外，传感装置还可以包括一个设在驱动马达13内的传感器(只要台板3可刚性地固定到驱动马达13的轴上)。
在控制器17接收到来自邻近的传感器23的信号经过预定时间后，闪光驱动器24便触发闪光管26发出一个极短的光脉冲(其延续时间最好少于约50微秒)，并由滤光器与透镜组件28将来自闪光管26的所需波长的光聚焦到毛细管9上。如果闪光管26位于台板3之下方，则台板3在试样管9与闪光管26和滤光器透镜组件28之间设有一个开口3’。由于由控制器17通过线路19精确控制台板3的转速、而且分度器15与毛细管9位置间的圆周距离是固定的，故可由控制器17确定适时激励闪光管26所需的延迟时间并由数据总线30表达出来以便控制闪光驱动管24的工作。
当毛细管9由闪光管26照亮时，由细胞层反射的光或者由细胞层发出的荧光由透镜组件32通过滤光器组34聚焦在线性析象管36上，该析象管36最好是一种具有至少256单元(最好是5000个单元)的电荷耦合器件(CCD)，以便获得最佳的光学分辨率。借助于由控制器17通过线路40控制的致动器38(例如螺线管或步进马达)可选择合适波长的光，故致动器38能够根据控制器17选定的光波长而从滤光器组34中选出合适的滤光器。另外，也可使用可变滤波器来提供合适波长的光，或者用带有多个传感器的多个CCD(每个CCD分别带有自己特定的滤光器)。合适的可变滤波器可从剑桥研究与仪器公司(Cambridge，MA.)购得。合适的CCD可从索尼、日立和其它公司购得，并且CCD是一种通用的仪器元件。
在接收来自闪光管26之闪光前的瞬间，由控制器17通过线路42打开CCD36中的电子光闸。闪光之后，立即将来自CCD36的数据读入能将来自每个CCD单元的模拟信号转变成数字信号的数字器44中。然后，通过数据总线46将数字化的数据传到控制器17中，这样，便能立即被分析或者贮存起来，以便在控制器17中作进一步的处理。因此，便可在离心分离过程的所需任一时刻，采用同时提交的专利申请“快速测量细胞层的组件”中所公开的组件收集和分析来自试样管9的光学信息，并由控制器17进行上述的用以获得“最大浓聚”的数学计算。
下面参见图5，图中示出用于将图4所示的闪光源26和数字器44放到台板3之上或之下的离心台板3的最佳实施例。上述的台板3通常是圆盘形的，并带有一个外凸缘50和一个基板52。有一个中央毂环54固定在台板的基板52上，该毂环54由盖子56封闭。毂环54上做出一对径向相对的孔口58。样品管9安装在台板3上，其一端插入到毂环54的一个孔口中，而其另一端则向下插入到安装在台板凸缘50上的支块62中形成的槽60中。台板的基板52带有一个由透明板64盖住的开口(未示出)。在透明板64的径向相对的两侧设有平衡块66，用于动态地平衡台板3。设置透明板64便可分别在台板基板52的上面或下面安装光源和传感器，而且也可使组件1利用反射光、荧光或透射光对试样进行测试而获取所需的结果。图5和6示出采用单根毛细管的具体实施例，但是，也可在台板3上的径向相对的位置上各安装一个试样管，采用组件1并改变从变址到闪光的时间进行多根试样管的分析，分别获得多根管中各试样的读数。上面所述的离心马达13的传动轴以标号13’示之。
图6和7示出马达的传动轴13’与台板3以及试样管9与台板毂环54的具体连接方法。马达的传动轴13’固定在位于毂环54内部的传动盘68上。传动盘68上固定有一对传动销70，该传动销70从毂环54的开口58伸出来。它们是马达传动轴13’与台板3之间唯一的传动接触。马达传动轴13’带动传动盘68转动时，便促使传动销70与毂环开口58侧面相接合从而使毂环54和台板3随传动盘68一起转动。杆72可转动地安装在毂环54上，它的一端带有一个接纳试样管9的一端部的套环74。该套环74的里面放入一个可夹住该试样管9的一端的弹性密封圈(未示出)。杆72上还安装有一个带齿的棘轮76，该棘轮76在工作上可按下述方式使套环74和试样管9进行步进式的选择性转动。在传动盘68上安装有一个由弹簧偏压与棘轮接合的棘爪78，而在毂环盖56上则安装有一个与棘轮相接合的片簧80。当马达13带动离心马达传动轴13’转动时，传动盘68的转动便推动棘瓜78与棘轮76的一个齿相啮合，并使片簧80向下移动而与棘轮76中与上述齿的径向相对的齿相啮合，如图7所示，为了使棘轮76和试样管9进行选择性的转动，按一定时间间隔间断地向离心马达13供电，以便短暂地减慢传动轴13’的转速。台板3的动量使它本身及其毂环54短暂地以快于传动盘68的转速转动，以便使棘爪78与棘轮76脱开并使传动销70与台板毂环54脱开。在这一短暂地脱开的过程中，棘爪78与棘轮齿脱开而移到与相邻的下一个棘轮齿相啮合的位置。然后，马达13再接通电流而达到全速，从而使传动销70与毂环54重新接合，并使棘爪78带动棘轮76和试样管9顺时针转动一步。因此，当棘爪78带动下一个相邻的棘轮齿时，棘轮76的转动又引起片簧80与棘轮76上径向相对的下一个相邻齿相啮合，从而使棘轮76和试样管9稳定在一个新的转动位置上，因此试样管9的步进转动可使析象管36在试样管进行离心分离时“看见”管子9中的试样的整个圆周表面，并使该系统考虑下降的试样组分界面8位置的圆周变化。上述的棘爪与棘轮式管旋转机构是Becton Dickinson and Company的Michael R.Walters的发明，在本申请中进行说明是为了满足专利法规定的“最佳模式‘的要求。
试样管中物质层的浓聚度可在离心分离和试样管的转动过程中由读出的多个浓聚数据算出，或者在足以完全浓聚要测量的物质层的预定的旋转时间后，于试样管的旋转过程中，在继续进行离心转动的情况下由读出的顺序读数算出。在任一种情况下，试样均不必从离心分离装置转移到独立的读出仪器上，因此，可节约时间并可限制操作者与试样直接接触。可获得同样读数的装置的另一个实施例包括使用在读出读数时打开的强烈连续光源，例如卤素灯。为了使阅读速度快到足以稳定高速旋转的试样管中的图象，在试样管与光学部分对准时，CCD上的电子光闸仅仅打开一个极短的瞬间，例如千分之一、二秒左右。上面谈到的分度器可以用来代替闪光光源而使CCD电子光闸同步打开。这种装置的一个优点是不需要闪光管及其有关的电路。但是，为了使上述的第二实施例正确地工作，离心分离速度必须减慢至约1,000转/分，以便使管子的图象清晰。
由于本发明所公开的实施例可在不违背本发明的概念的情况下作多种改动和改变，故不应以上述实施例限制本发明，本发明应由所附权利要求书所限定。
权利要求
1.一种测定盛装于透明管子内的生物液体试样中目标组分的重力浓聚层厚度的方法，该方法包括下列步骤(a)将上述管子置于高心台板上；(b)高速转动台板，使管子中的目标组分发生重力浓聚而成可以识别的组分层；(c)在管子随台板进行离心转动的同时，读出目标组分层的厚度；和(d)记录下该层的厚度读数。
2.一种测定盛装于透明管内的生物液体试样中目标组分的重力浓聚层的最大厚度的方法，该方法包括下列步骤(a)将上述管子置于离心台板上；(b)高速转动台板，使管子中的目标组分发生重力浓聚而成可以识别的组分层；(c)在管子随台板高速旋转的同时以及管子中的目标组分连续形成可识别的浓聚层时，读出目标组分的多个连续的初始层厚度；(d)记录下初始层的厚度读数；和(e)由记录下来的多个初始层的厚度读数计算出目标组分层的最大厚度。
3.一种测定与血样组分光照反应剂一起盛装于透明管子内的抗凝全血试样中目标组分含量的方法，该方法包括如下步骤(a)将上述管子置于离心台板上；(b)高速旋转台板，使管子中的目标组分发生重力浓聚而成可识别的组分层；(c)在管子随台权高速旋转的同时读出目标组分层的厚度读数；(d)记录下上述的层厚读数；(e)将上述记录下的层厚读数换算成血样中目标组分含量的定量数据。
4.一种测定盛装于透明管子内的抗凝全血试样的目标组分含量的方法，该方法包括如下步骤(a)将上述管子置于离心台板上；(b)高速旋转上述的台板，使目标组分发生重力浓聚而成可识别的组分层；(c)在上述的管子随离心台板高速旋转的同时，以及管子中的目标组分连续浓聚成可识别的层时测出目标组分层的多个连续的初始厚度值；(d)记录下上述的多个初始层厚的测量值；(e)由上述记录下的多个初始层厚读数计算出目标组分层的最大厚度；f)将上述算出的最大层厚换算成血样中目标组分含量的定量值。
5.一种测定生物液体试样中目标组分的重力浓聚层的厚度的方法，该方法包括下列步骤(a)将至少一部分试样置入管子中；(b)将上述的管子置于离心台板上；(c)高速旋转上述的台板，使管子中的目标组分发生重力浓聚而成可识别的层；(d)在管子随台板高速旋转的同时读出目标组分层的厚度读数；和(e)记录下上述层厚的读数。
全文摘要
定量测定被离心分离的物质层的体积。上述的物质层最好由一种或多种与要分析的试样相混合的荧光染料使其有差别地显示出来。在进行不同血细胞和血小板计数时,采用动态定量方法尤为有用。血样在频闪光灯照亮的同时进行离心分离。至少采用闪光测定一次光度细胞层浓聚测量,以便记录试样离心分离时的细胞层浓聚度。在某些情况下,作出浓聚曲线,并在达到细胞层的最大浓聚度之前算出细胞层的最大浓聚度。
文档编号G01N33/48GK1206832SQ9810608
公开日1999年2月3日 申请日期1998年3月9日 优先权日1998年3月9日
发明者S·C·沃德罗 申请人:S·C·沃德罗