流式细胞仪的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开总地涉及流式细胞术的技术领域，并且更具体地，涉及改进的流式细胞仪 连同包括在其中的各个独立的组件的结构和操作。
【背景技术】
[0002] 流式细胞术是在细胞计数、分选、生物标志物检测和蛋白质工程中采用的生物物 理学技术。在流式细胞术中，悬浮于液流中的细胞通过电子检测设备。流式细胞术允许每 秒对高达数千个细胞同时进行物理和/或化学特性的多参数分析。
[0003] 流式细胞术具有包括在分子生物学、病理学、免疫学、植物生物学和海洋生物学领 域中的多项应用。流式细胞术在医学中（尤其是在移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、产前 诊断、遗传学和用于性别预选的精子分选中）也具有广泛的应用。在海洋生物学中，光合作 用浮游生物的自体荧光特性可被流式细胞术用于表征个体密度和群落组成。在蛋白质工程 学中，流式细胞术与酵母展示和细菌展示结合使用，以便识别具有所需性质的在细胞表面 展示的蛋白质变异体。流式细胞术的一种常见变型是基于粒子的性质对粒子进行的物理分 选，从而纯化所关注的群体。
[0004] 整个流式细胞仪系统包括下列主要部件。
[0005] 1.流通池，通常称为鞘流、鞘液体或鞘流体的液流通过流通池，携载细胞或粒子并 将细胞或粒子流体动力学地对准，使得细胞或粒子单行通过流通池。
[0006] 2.测量子系统，其耦连到流通池，检测通过流通池的细胞或粒子，且通常是下述之
[0007] a.阻抗或电导率测量子系统；或
[0008] b.光学照射子系统连同光学感测子系统。
[0009] 3.转换子系统，其用于将来自测量子系统的输出信号转换成计算机可处理的数 据。
[0010] 4.计算机，其用于分析由转换子系统所生成的数据。
[0011] 光学照射子系统提供准直而后聚焦的光束，通常为单一波长的激光，其入射到通 过流通池的被流体动力学地聚焦的液流上。因此，流式细胞仪系统可具有一个或多个光源， 其可以包括：
[0012] 1. 一个或多个灯，例如汞灯或氙灯；
[0013] 2. -个或多个高功率水冷式激光器，例如氩、氪或染料激光器；
[0014] 3. -个或多个低功率风冷式激光器，例如氩（488纳米）、HeNe (红-633纳米）、 HeNe (绿）和 HeCd (UV);和 / 或
[0015] 4. 一个或多个二极管激光器（蓝、绿、红和紫）。
[0016] 光学感测子系统包括一个或多个检测器，其瞄准聚焦的流液通过所述光速的地 方。这种检测器可包括：
[0017] 1.与光束方向一致的检测器（前向散射器或FSC);
[0018] 2.垂直于光束的检测器（侧向散射器或SSC);和
[0019] 3.荧光检测器。
[0020] 通过光束的各悬浮粒子对该光进行散射，并且由入射光激发的存在于粒子中或附 着于粒子的荧光材料发射比入射光波长更长波长的光。在每个检测器（针对每个荧光发射 峰各有一个）处检测和分析散射光和荧光的组合的亮度变化允许推导出有关每个独立粒 子的物理和化学结构的各类信息。FSC与细胞容积有关。由于光被散射离开细胞的内部部 件，SSC取决于粒子的内部复杂度（即，细胞核的形状、胞质颗粒的数量和类型或细胞膜的 粗糙度）。有些流式细胞仪省去荧光检测器而只检测散射光。其它流式细胞仪形成每个细 胞的荧光、散射光、以及透射光的图像。
[0021] 流式细胞仪系统的转换子系统通常包括一个或多个模拟-数字转换器（"ADC"） 用于将测量子系统的输出信号转换成随后由计算机进行处理的数据，所述转换子系统可包 括可为线性或对数的一个或多个放大器。
[0022] 现代流式细胞仪通常包括多达四（4)个激光器和数个荧光检测器。增加激光器和 检测器的数量允许以若干不同的抗体来标记细胞，并且可以通过其表型标志物来更精确地 识别目标群体。某些仪器甚至可以捕获独立细胞的数字图像，从而允许对细胞内或细胞表 面上的荧光信号的位置进行分析。
[0023] 试样照射
[0024] 在大多数的仪器中，诸如血细胞或微球的受关注的粒子由利用流体动力学聚焦 的鞘流携载到小杯或喷射流内部的观察区内，并于该处由聚焦的激光束进行照射。该技 术提供了准确地识别受关注的粒子并对所述粒子计数的一种手段，而不会被在注册时间 窗之外出现的背景噪音所淹没（实用流式细胞术，Howard M. Shapiro,威利（2003) ISBN 0471411256)。为了提高检测灵敏度，聚焦激光束的横截面通常是椭圆形的，其中短轴沿着 流动方向。为了保持阈值完整性，激光轮廓必须具有沿着流动方向的平滑或钟形轮廓。用 于产生这种光束的一种常见方法是，利用由棱镜或柱面透镜对所制成的扩束器沿着流动方 向将几乎准直的圆形高斯光束细长化，然后用球面透镜对光束进行聚焦。因为光束在焦点 处的形状是光束在远场处的空间傅立叶变换，这产生高斯形椭圆光斑，其中短轴沿着流动 方向。
[0025] 传统激光器价格昂贵、体积大且耗电。最近，激光二极管（"LD"）已经可以使用。 与传统激光器不同，新一代LD具有成本效益、结构紧凑且节能，并为新一代紧凑型生物医 学仪器展现了巨大前景。LD发射具有椭圆形横截面的光，其中经常被称为快轴的椭圆长轴 垂直于LD的接头，而经常被称为慢轴的椭圆短轴平行于LD的接头。遗憾的是，典型LD的 特别是沿其快轴的光束质量可谓非常不理想，从而使其无法在流式细胞术的应用中被广为 接受。
[0026] 原则上，LD光束的质量可通过空间滤波显著改善。如果小型针孔或单模光纤位于 透镜的焦点处，使得其只能接受最低阶的空间模式，则通过针孔或单模光纤的光束将是近 似完美的高斯形状。序号为5, 788, 927的美国专利公开这样的光束可在流动通过细胞仪的 方向上被准直并扩展，并最终聚焦成椭圆形高斯光束，其中短轴沿着流动方向。遗憾的是， 台式仪器的尺寸将针孔的直径限制到小于5微米。可见光波长单模光纤的纤芯大小也具有 类似的尺寸。制备精密空间滤波器及其维持它的长期稳定性的挑战不仅增加了基于LD的 激光系统的成本，而且还降低了其可靠性。
[0027] 最近，在致力于减少因准直透镜的有限数值孔径的边缘效应所导致的可能的旁 波瓣的过程中，序号为6, 713, 019的美国专利（"'019专利"）公开了将LD旋转过90度 (90° )，使得其慢轴平行于流动方向。然后将诸如凹面柱面透镜的光束漫射区段引入，以 便在垂直于流动的方向上漫射该准直光束，随后引入诸如球面聚焦透镜的光束光斑形成区 段，以便在细胞仪的粒子观察区内形成椭圆形光斑。如在' 019专利中详细描述的那样，在 光斑形成区段之后的激光束是非常像散性的。具体地，在垂直于流动方向上的在观察区处 的光束宽度可与流量通道的宽度相当或大于所述流量通道的宽度。这不仅降低了入射到粒 子上的激光能量的量并因此降低信号强度，同时也增加了来自液流细胞界面的非预期的背 景散射。取代旋转LD，序号为7, 385, 682和7, 561，267的美国专利公开了使用大数值孔径 非球面透镜来用于LD准直。但是这样的设计不能校正LD光束轮廓中固有的边缘效应。因 此，目前对适于在流式细胞仪中使用的基于LD的简单光学系统存在需求，其能够可靠地产 生沿其短轴具有近高斯形状并且沿其长轴具有一定宽度的聚焦椭圆形光束。
[0028] 观察区
[0029] 显微镜物镜
[0030] 现代的流式细胞仪包括空间滤波器，其通常为机械针孔或大纤芯光纤，位于物镜 的图像位置处以防止非预期的背景光进入到细胞仪的检测器内。由于粒子停留在细胞仪的 观察区内几微秒，因此必须使用具有大数值孔径的显微镜物镜以最大化集光效率。为了支 持在流式细胞仪中的多个空间上分离的激发用激光束，如在序号为4, 727, 020的美国专利 中所公开的那样，也希望使用具有较大视野的物镜。为了实现这些目标，序号为6, 510, 007 和7, 110, 192的美国专利公开了一种物镜设计，作为最靠近试样的光学元件，其利用了具 有凝胶耦连或环氧树脂粘结的接近半球透镜的修正的复消色差透镜，，接着为多个凹凸透 镜。虽然这种显微镜物镜提供令人满意的数值孔径和视野，但它们显著牺牲了图像质量，由 此：
[0031] 1.限制了空间滤波器的有效使用；以及
[0032] 2.表现出欠佳的背景光识别力。
[0033] 此外，这种折射型显微镜物镜体积大，制备成本昂贵，并通常表现出严重的色差。 为了克服这些限制，公布的序号为WO 01/27590的专利合作条约（"PCT"）专利申请公开了 基于球形凹面镜的替代性物镜设计。该设计提供了大数值孔径以及沿着光轴的良好图像质 量。然而，由于其较差的离轴特性，这样的设计并不适用于具有多个空间上分离的激光束的 流式细胞仪。
[0034] 鞘液体供应
[0035] 流式细胞仪的性能关键取决于稳定的液体鞘流。具体地，具有多个空间上分离的 激发用激光束或执行液滴分选的流式细胞仪依赖于液体鞘流的恒定速度以便定时同步。如 序号为5, 245, 318的美国专利中所公开，传统的流式细胞仪通过使用气密式的流体系统提 供稳定的液体鞘流，该系统：
[0036] 1.在鞘液体储槽内施加恒定的空气压力以将流体推动通过所述流通池；或
[0037] 2.使用真空泵通过流通池从鞘液体储槽抽取流体。
[0038] 这些系统体积大，制备成本昂贵，并容易出现故障。最近，序号为8, 187,888的美 国专利公开了包括鞘液体子系统和废鞘液体泵，所述鞘液体子系统将液体鞘流从鞘液体储 槽泵入到观察区内，所述废鞘液体泵将废鞘液体从观察区泵入到废液槽内。虽然看起来所 公开的鞘液体子系统从未在速度关键流式细胞仪中使用，但是该专利报告，所公开的鞘液 体子系统通过下述来克服传统鞘液体流稳定性的大多数缺陷：
[0039] 1.通过定位下述装置来阻尼泵脉动：
[0040] a.鞘液体泵和流通池之间的一个流体电容器；以及
[0041] b.流通池和废液泵之间的另一个流体电容器；以及
[0042] 2.泵控制器，其操作对压力传感器作出响应，所述压力传感器测量所述流通池的 入口和出口之间的压力差。
[0043] 所公开的鞘液体子系统具有其它限制。例如，位于所述流通池出口附近的压力传 感器可能是潜在的污染源。
[0044] 蠕动泵
[0045] 试样液体供应
[0046] 蠕动泵是容积泵，其中一组线性地或圆形地移动的辊逐步压缩可压缩管以将流体 推压通过管。蠕动泵尤其被广泛用于泵送洁净的/无菌性或腐蚀性流体，以避免外露的泵 组件的交叉污染。
[0047] 传统的蠕动泵在辊每次滚离泵出口附近的管时呈现脉动，其由压缩管膨胀回其原 始形状时管容积的暂时性增加所导致。脉动在需要平稳流动的应用中是非预期的。在过去 已经进行了许多尝试来减少脉动。例如，序号为3, 726, 613和3, 826, 593的美国专利介绍 了凸轮操作的推杆，其将外部压力同步地施加到管上以补偿管的扩张。在序号为4, 834, 630 的美国专利中，安装在分段辊上的多根管通过T形联接器在泵入口和出口处接合在一起， 从而来自各个管的脉动会通过平均而被减少。序号为7, 645, 127的美国专利提出了一种泵 送管，其在入口附近具有稍大的内径，使得泵出口附近的管的减压由入口附近的较大容积 的管的压缩来补偿。各种方法或显著地增加蠕动泵的复杂性，或在降低脉动效应上的效用 有限。
[0048] 多色荧光检测
[0049] 在多种多色荧光检测仪器诸如流式细胞仪（实用流式细胞术，Howard M. Shapiro， 威利（2003) ISBN 0471411256)中，从受关注的对象发出的荧光：
[0050] 1.由显微镜物镜收集；
[0051] 2.通过小型针孔或多模光纤而重新成像；
[0052] 3.随后准直化并分离成多个有色带；并且
[0053] 4.最后由诸如光电倍增管（PMT)、PIN光电二极管或雪崩光电二极
[0054] 管（APD)的光检测器检测。
[0055] PMT实质上是一种特殊类型的电子管。这种"前-半导体年代"的装置体积大且 昂贵。此外，其具有较差的量子效率和比基于硅系半导体检测器更少的可再现性的频谱响 应，特别是在生物学上重要的红光至近红外光频谱区尤其如此。尽管有缺陷，PMT仍具有优 异的噪声特性。例如，典型的13毫米PMT (例如，来自日本Hamamatsu公司的R9305)的暗 电流仅约InA。相比而言，即使其有源区减少到PMT有源区的二十分之一，APD的暗电流将 为PMT暗电流的10倍以上。因此，PMT已经成为实际上在许多商业荧光检测流式细胞仪中 的低水平光检测器。只有在事件发生率较低以及暗电流可通过昂贵的光子计数技术区别的 某些科学应用中，PMT才由APD检测器替代。（参考，高通量流式细胞术DNA片段的尺寸制 订，A. V. Orden，R. A. Keller,和 W. P. Ambrose, Anal. Chem.，2000, 72 (I)，p37-41)。最近，也 提出用盖革模型AH)阵列作为PMT的替代品。（例如，日本Hamamatsu Photonics的多像素 光子计数器以及爱尔兰SensL Inc.的固态光电倍增管）。但是这些检测器也有高的暗电流 和在高事件率下为非线性的缺陷。
[0056] APD被广泛接受的唯一行业是在光通信中。已知的是，如果APD的有源区减小到 小于1_2,则相应的暗电流会降低到与PMT相同的水平。在光通信中，光是出自单模光纤 的激光束。这种光束可被容易地准直然后聚焦到比1_2小得多的区域。应当指出的是，在 荧光检测仪器中使用的分色装置（如在序号为6, 683, 314的美国专利和其中的参考文献所 描述的那样）在功能和结构上几乎与广泛应用于光通信中的波分多路复用器（WDM)相同， 如在序号4, 482, 994和5, 786, 915的美国专利中所述的那样。阻止在荧光检测仪器中使用 小面积AH)的基本理由是公知的光学扩展量守恒定理：通过针孔或多模光纤的荧光是扩展 光源，其具有的光学扩展量比出自单模光纤的激光束的光学扩展量大数百倍。因此，如图 26中所示，除非光束直径被显著扩展，否则其就不能在延长的距离下准直。遗憾的是，光束 直径越大，则将光束聚焦到一个小光斑的技术挑战越大。由于只能以经准直光束经济地完 成有效分色，因此小面积的Aro对多色荧光检测应用被认为是不可行的。显然，能够在延长 的距离下准直较大光学扩展量的光束而不显著地扩展光束直径的技术将是非常理想的。这 种技术将使得类似WDM的装置能够用于荧光检测，具有与低噪声半导体检测器相媲美的特 性。
【发明内容】
[0057] 本公开提供了改进的流式细胞仪连同包括在其中的各种改进的组件。
[0058] 本公开的目的是提供一种简单而可靠的基于二极管激光器的光学系统，其能够传 送椭圆形截面的