Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学研究领域，尤其涉及一种Dickkopf-I与细胞凋亡在激素性股骨 头缺血性坏死中作用的研究方法。
【背景技术】
[0002] 激素性股骨头缺血坏死（Steroid-induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH)是指因长期使用或短期大量使用肾上腺皮质激素（以下简称激素）后造成股 骨头活性成分的死亡所引起的病理过程。早在20世纪50年代就已发现，大量使用激素可 以导致股骨头坏死。目前由于临床上对糖皮质激素的广泛应用，致使SANHl的临床病例数 大幅度增加。SANHlS非创伤性股骨头坏死中发病率最高的一种类型。SANHl主要累及中青 年人群，多为双侧性，其坏死率和致残率远高于一般的特发性股骨头缺血坏死。2003年"非 典"以后，又涌现出大量SANFH病例。激素引起的SANFH是一个非常复杂的生物学过程，具 体的发病机制仍然不是很清楚，因此，探明SANHl的发病机制，仍然是该领域的研究重点。
[0003] 虽然自上个世纪60年代开始，许多学者就开始致力于对SANHl发病机制的研究， 但到目前为止仍未得到确切结论，现存在诸多比较分散的学说，比较具有代表性的有脂肪 代谢紊乱、血管内凝血、激素的细胞毒作用、骨内压增高等。但是，其确切病理生理学机制并 未明确。近年，相关基因学研究表明，SANFH与细胞凋亡、血液系统相关基因以及遗传易感 性等因素有关。随着分子生物学的发展，细胞凋亡理论已成为研究器官组织损伤和衰老发 生机制的重要研究方向，受到众多国内外学者的重视。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动 死亡，是多种细胞有机体为维护内环境稳定、调控机体发育进行的程序化细胞死亡，为细胞 衰老自然死亡的主要方式之一。虽然细胞凋亡是一种生理过程，但或多或少都会引起疾病 发生。细胞凋亡的发生主要与氧化应激、线粒体损伤及钙稳态失衡等有关；凋亡信号转导 通路受基因调控及许多诱导因素（如激素和生长因子的失衡等）的影响。近年来已有许多 学者开始初步探讨骨细胞和成骨细胞的凋亡在SANHl中的作用，对其发病机制有了新的认 识。但遗憾的是，这些研究还尚未深入到对骨细胞、成骨细胞凋亡机制的研究中。而亦有研 究表明在其他疾病里如肝癌、胃癌等Wnt信号途径与细胞凋亡有密切关系，但在骨细胞内 尚未研究方法，而且有大量研究表明激素虽对Wnt受体LRP表达的影响甚微，但可显著增加 Wnt诘抗分子Dickkopf-I的表达。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种Dickkopf-I与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死 中作用的研究方法，旨在探索Dickkopf-I与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中的作 用，为进一步探讨激素性股骨头缺血性坏死提供新的思路。
[0005] 本发明是这样实现的，一种Dickkopf-I与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死 中作用的研究方法通过收集经全髋置换术取下的SANHl的股骨头标本作为实验组，股骨颈 骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察 骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色 法检测Dickkopf-I的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-I与 细胞凋亡在SANFH中的作用。
[0006] 进一步，Dickkopf-I与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法的 具体步骤如下：
[0007] 步骤一、收集全髋置换手术后取下的股骨头，-80°C冰箱保存。SANHl例作为实验 组，新鲜股骨颈骨折标本作为对照组，对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好 及服用激素史；
[0008] 步骤二、标本制作：
[0009] 将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨骨块，用4%多聚甲醛固定 12小时（含0. 1 % DEPC)后，13%乙二胺四乙酸（EDTA PH7.0)脱钙，脱钙完全后，常规石蜡 包埋；
[0010] 步骤三、光镜下组织形态学观察：
[0011] 取石蜡包埋组织块，制成厚5 μπι切片，HE染色，将染色后的切片分别置于100倍 及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；
[0012] 步骤四、透射电子显微镜观察：
[0013] 在股骨头坏死区切取骨块，2. 5%戊二醛液前固定，10% EDTA脱钙，1%饿酸后固 定，环氧树脂包埋，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，电镜观察；
[0014] 步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；
[0015] 步骤六、免疫组织化学法检测Dickkopf-I ;
[0016] 步骤七、统计学处理。
[0017] 进一步，HE染色的具体方法为：
[0018] 第一步、60 °C烤箱脱蜡30分钟；
[0019] 第二步、二甲苯I脱蜡10分钟；
[0020] 第三步、二甲苯II脱蜡5分钟；
[0021] 第四步、无水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分钟；
[0022] 第五步、95%乙醇2次，每次1分钟；
[0023] 第六步、90 %乙醇1分钟；
[0024] 第七步、85 %乙醇1分钟；
[0025] 第八步、自来水洗去乙醇5分钟；
[0026] 第九步、苏木素着色4分钟；
[0027] 第十步、自来水冲1分钟；
[0028] 第十一步、1 %盐酸酒精分化20秒；
[0029] 第十二步、自来水洗1分钟；
[0030] 第十三步、1 %稀氨水返蓝30秒，蒸馏水洗1分钟；
[0031] 第十四步、伊红染色20秒，0、85%酒精脱水20秒；
[0032] 第十五步、90 %酒精脱水30秒；
[0033] 第十六部、95 %酒精脱水1分钟；
[0034] 第十七步、95 %酒精脱水1分钟；
[0035] 第十八步、无水乙醇I脱水2分钟；
[0036] 第十九步、无水乙醇II脱水2分钟；
[0037] 第二十步、二甲苯I 2分钟；
[0038] 第二^^一步、二甲苯II 2分钟；
[0039] 第二十二步、二甲苯III 2分钟；
[0040] 第二十三步、中性树胶封片。
[0041] 进一步，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的具体方法为：
[0042] 第一步、标本的处理：（a)玻片预先用APES进行处理；(b)细胞涂片和冰冻切片： 必须马上固定，用4%的多聚甲醛PH为7. 0-7. 6，在室温固定35分钟，0. 0IM PBS液洗2次， 每次2分钟，蒸馏水洗涤2次每次2分钟。（c)组织：立刻固定，10%中性缓冲甲醛液固定5 小时，石蜡包埋，切片脱蜡干净后入水；
[0043] 第二步、制备新鲜的3 %的H2O2，在室温下处理10分钟，蒸馏水洗涤3次，每次2分 钟；
[0044] 第三步、标本片加0· OlM TBS 1 : 200的新鲜稀释Proteinase K 37°C消化15分 钟，0.0 lM的TBS液洗3次，每次2分钟；
[0045] 第四步、每张标本片加标记缓冲液20 μ 1，以防止切片干燥，将TdT和DIG-d-UTP各 1 μ 1与18 μ 1标记缓冲液混和滴与切片上。甩掉其上多余的液体再滴标记液，每片20 μ 1。 将样品放在37°c湿盒里2小时；
[0046] 第五步、0.0 lM的TBS液洗涤3次，每次2分钟；
[0047] 第六步、每片滴封闭液50 μ 1，室温下30分钟后，甩去封闭液；
[0048] 第七步、将1 : 100的抗体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀，每片标本滴 50 μ 1，放在37°C湿盒里反应30分钟，用0.0 lM TBS洗涤3次，每次2分钟；
[0049] 第八步、用抗体稀释液1 : 100稀释SABC :将SABC 10 μ 1加入1ml的抗体稀释液， 混匀，每片滴50 μ 1。37°C反应30分钟，0. 0IM TBS洗涤4次每次5分钟；
[0050] 第九步、DAB显色：在DAB试剂盒的A、B、C试剂中各加入一滴蒸馏水，混匀，滴到标 本片上，显色20分钟，显微镜下观察着色情况后水洗；
[0051] 第十步、苏木素轻度复染；0.0 lM TBS洗，蒸馏水洗；脱水，透明，封片；光学显微镜 下观察且记录实验数据；TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡 的细胞；在光镜下，随机在每张玻片上找5个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，