用于检测胃癌相关代谢小分子的核磁共振模型及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及恶性肿瘤胃癌检测领域，利用一种核磁共振模型及其制备、应用方法，在体外对胃癌进行的发现和检测，其准确率为70.8%、敏感度为81.6%、特异度为60.0%。
【背景技术】
[0002]胃癌是我国发病率较尚的癌症之一，胃癌病人多数无明显症状，少数人有恶心、呕吐或溃疡类似病症的上消化道疾病的症状。胃癌的发病具有地域性。研究发现，亚洲地区，如中国、日本、韩国等具有较高的发病率。其次，胃癌的发病原因较为复杂，目前，已经报道的研究发现，胃癌的诱因与日常饮食因素、胃溃疡疾病、胃息肉疾病以及幽门螺旋杆菌感染有关。根据最新的2012年的统计，我国胃癌发病率为3.314人/万人，死亡率为每万人
2.434人/万人，远远高于世界上其他国家(发病率为2.309人/万人，死亡率为1.639人/万人)，位居恶性肿瘤第2位。通过不断的研究发现，提高胃癌诊断效果从而提高胃癌病人五年生存率的根本策略是对胃癌的诊断，达到早发现早治疗的目的。对于胃癌的诊断，开展较好的国家，如日本，其胃癌诊断的比例已经超过全部诊断胃癌病例的一半以上，而我国对于胃癌的诊断仅为全部胃癌诊断病例的5-15%。胃癌在诊断以后进行治疗，病患的五年生存率可以达到90%，原因超过进展期胃癌的治疗效果(五年生存率仅为16.6%)。目前，对于胃癌的诊断方法，主要集中在内窥镜手段、影像学诊断和分子生物学诊断。其中，影像学手段包括钡餐造影、螺旋CT成像；分子生物学手段即使对与癌症相关的基因、蛋白质的标志物进行筛查，例如，张力蛋白同源磷酸酶基因、survivin基因、Livin基因、CA72-4蛋白、CA19-9蛋白等。钡餐造影、内窥胃镜的方法，对于胃癌的诊断准确率较高，但是由于这些方法检测过程复杂，对病人的在生理上造成一定的伤害；对与基因和蛋白质标志物的筛查，检测过程复杂，需要大型的仪器，同时，诊断的准确率仍然处于较低的水平，在我国的普及率相对较低。
[0003]肿瘤标志物是由肿瘤细胞合成并且分泌到体液中的活性物质，存在与组织液、血液、唾液、尿液等体液中。1978年，在国立癌症研究所召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断会议”上，由美国学者Herberman首次提出肿瘤标志物(Tumor marker, TM)这一概念。肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生及增殖过程中，由肿瘤细胞自身的特殊性所表达并合成，最后分泌到细胞间及体液中的物质，或者，病人由于对肿瘤出现各种不同的生理或病理反应，从而自身正常细胞分泌到组织或体液中的物质，如某些蛋白质、小分子等等，统称为肿瘤标志物。使用肿瘤标志物，可以实现对对肿瘤的检测，并在诊断过程中起到辅助作用。依据其产生原理，肿瘤标志物分为两类，一类是有肿瘤自身分泌的；另一类是肿瘤与机体相互作用产生的。按其产生原理，我们把能反映恶性演变各个阶段中表型及基因型的特征或特性的物质，均称为肿瘤标志物。代谢组学是1999年英国帝国理工大学Jeremy Nicholson教授提出的，定性定量的分析生物体内代谢小分子物质的研究方法。对胃癌的代谢组学的研究，可以发现与胃癌有关的代谢小分子物质。通过胃癌的标志性小分子代谢物，有利于胃癌的早发现，早治疗，从而提高胃癌病人的生存质量。较早关于胃癌代谢组学的研究是2009年发表于Cancer Res的文章，而后又有多篇文章对胃癌的代谢组学进行阐述，通过对胃癌的研究，科学家发现了很多胃癌所导致的产生差异调节(包括上调和下调)的代谢小分子物质，例如:乳酸，苹果酸，尿酸，棕榈酸，丁酸，丙酸，嘧啶，甘油，丝氨酸，谷氨酸，鸟氨酸，脯氨酸等。
[0004]核磁共振波谱法(NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy，缩写为 NMR)，是对各种有机和无机物的成分、结构进行定性分析的工具。其原理主要是:在强磁场中，某些元素的原子核和电子能量本身所具有的磁性，被分裂成两个或两个以上量子化的能级。吸收适当频率的电磁福射，可在所产生的磁诱导能级之间发生跃迀。在磁场中，这种带核磁性的分子或原子核吸收从低能态向高能态跃迀的两个能级差的能量，会产生共振谱，可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置。尽管核磁共振波谱法在肿瘤代谢物检测中有所应用，但是迄今为止尚未见通过核磁共振波谱法构建的模型能够用于胃癌检测，且准确率达到85%以上的报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的是为了克服已有对胃癌相关代谢小分子标志物检测技术的不足之处，提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型及其制备方法。
[0006]本发明的第一个发明目的是提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型，其特征在于利用核磁共振波谱仪测定胃癌患者和健康人血浆样本的代谢小分子，并筛选出相应的胃癌相关代谢小分子标志物，其中所述的胃癌相关代谢小分子标志物包括:beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸。
[0007]本发明的第二个发明目的是提供一种上述用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型的制备方法，包括以下步骤:
[0008]步骤一:收集多例II/III期胃癌患者血浆和健康人的血浆分别作为病例组和对照组血浆样本，进行低温冷冻备用；
[0009]步骤二:对所述血浆样本进行核磁共振波谱前预处理；
[0010]步骤三:对预处理过的两组血浆样本进行核磁共振波谱检测，并收集数据；
[0011]步骤四:对于核磁共振波谱检测到的代谢小分子，使用百分比差异度(rov)进行评估，找出百分比差异度得分最大的代谢小分子；
[0012]步骤五:步骤五:以百分比差异度得分最大的代谢小分子的浓度作为聚类分割值，所述聚类分割值具体为利用正常血浆样本中该小分子浓度的均值，计算方法为将正常样本中该小分子的浓度加和，并除以正常样本的数目得到；因此，将全部样本分为2个子类，命名为Ml子类和M2子类，并通过ROC曲线比较聚类前后的曲线线下面积；
[0013]步骤六:应用Mann-Whitney U test检验方法对所述Ml子类和所述M2子类中的代谢小分子进行差异性检验，得到所述Ml子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子，以及得到所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子，其中一部分代谢小分子在病例组中表达量过高，而另一部分代谢小分子的表达量在病例组中过低；
[0014]步骤七:将所述Ml子类和所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的所述代谢小分子作为胃癌相关代谢小分子标志物，建立用于胃癌相关代谢小分子标志物检测的核磁共振模型。
[0015]百分比差异度(rov)评估，以及百分比差异度得分最大的代谢小分子的浓度的石角定，详见参考文献 8 (Cheng, S.L., B.F.Lian, J.Liang, T.Shi, L.Xie, and Y.L.Zhao, Siteselectivity for protein tyrosine nitrat1n:1nsights from features of structureand topological network.Molecular B1systems, 2013.9(11):p.2860-2868.)0
[0016]在本发明的核磁共振模型中，步骤五中百分比差异度得分最大的代谢小分子是脯氨酸；步骤六中得到所述Ml子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子是beta-D-葡萄糖、肌酸酐、乙醇、组氨酸和脯氨酸；步骤六中得到所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子是乳酸、肌酸、肌酸酐、亮氨酸、缬氨酸和组氨酸；其中乳酸、乙醇、亮氨酸、脯氨酸都在病例组中表达量过高，而beta-D-葡萄糖、肌酸、肌酸酐、缬氨酸、组氨酸的表达量在病例组中过低；作为胃癌相关代谢小分子标志物是beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸。
[0017]进一步地，其中所述步骤一包括将从所述病例组和所述对照组取得的全血样本离心，去血细胞，保留血浆，得到血浆样本，进行低温冻存备用。
[0018]进一步地，其中所述步骤一还包括将得到的所述血浆样本以I倍到5倍体积的生理盐水稀释低温冻存备用。
[0019]进一步地，其中所述步骤二包括将所述血浆样本与Na+/K+缓冲液混匀后离心取上清液，以备核磁共振波谱检测用。
[0020]进一步地，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为15?25ppm，等待时间为I?3s，90°脉宽为10?12 μ s，采样点数为28?34K，FID累加次数为60?68次，回波演化时间为300?400us，回波循环为90?110，总回波时间为60?80ms。
[0021]在一个较佳的实施方案中，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为20ppm，等待时间为2s，90°脉宽为11.6 μ S，采样点数为32K，FID累加次数为64次，回波演化时间为350us，回波循环为100，总回波时间为70ms ο
[0022]本发明的第三个发明目的是提供所述的代谢分子标志物组成的核磁共振模型，或者上述方法所制备的核磁共振模型，在检测胃癌中的应用。其中，所述的应用包括所述胃癌相关代谢小分子标志物组成的核磁共振模型，在胃癌诊断或监测中的应用。
[0023]在一种所述的核磁共振模型的应用中，使用最近邻算法，所述最近邻算法是对于每一