一种彩色超分辨成像装置及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及显微成像技术领域，尤其涉及一种彩色超分辨成像装置及方法。
【背景技术】
[0002] 当前，在结构光照明技术中，为了实现超分辨显微成像，需要对待测样品进行多次 的图像采集，并在采集之后进行复杂的图像重建过程才能还原出待测样品的超分辨图像。 可见，传统的超分辨显微成像做法不仅耗时，而且多次采集也会进一步增加样品光漂白的 几率。
[0003] 而目前，出现了一种二次扫描超分辨显微技术，它是一种新型的结构光照明超分 辨显微技术，其基本原理可以如图1所示。其中，二次扫描超分辨显微系统中有两套振镜， 其中SMl的作用是对待测样品面进行点扫描，使激发光分别激发待测样品产生荧光信号。 而SM2的作用是对激发的荧光信号进行二次扫描。在图1右侧的B部分中，M值表征的意 Mh 义为系统对待测样品的放大率Mcib,和对激发光斑放大率Mspcit的比值（即M = f )。当 lVI- Spot M = 1时，激发光从左往右依次扫过荧光团激发出荧光信号，由于两个荧光分子距离较近， 导致其发出的荧光信号在空间上有部分的重叠，无法区分出两个荧光分子。但是当M = 2 时，由于系统对样品的放大率大于激发光斑的放大率，导致两个荧光分子的像之间的距离 增加，使得系统能够分辨出这两个原本发光信号重叠的荧光分子，由此突破了系统的极限 分辨率。这种超分辨技术最大的优势在于，它摒弃了传统结构光照明技术中的多次激发和 后期复杂的数据重建，而是利用纯光学的方式，仅通过一次信号采集即可实现超分辨显微 成像。紧随其后，Hari ShofT等人将双光子与二次扫描技术相结合，进一步的提升了二次 扫描系统的信噪比和成像深度。另外，当前出现了将超分辨成像与荧光光谱成像相结合的 技术，在荧光光谱成像部分，其通过光纤光谱仪来采集每个图像像素点上的光谱，最终通过 线性光谱解混，来实现对样品中不同荧光物质的区分。
[0004] 然而，上述的二次扫描技术，虽然在图像的分辨率上有所提高，但是无法在单次的 检测中区别出发不同波长的荧光团。而将二次扫描技术与光纤光谱仪相结合的技术，虽然 能实现超分辨的光谱成像，但是成像光谱仪采用光纤光谱仪，系统整体的信号采集速率将 极大的受限于光谱仪CCD检测器的采集和读出速率，无法实现快速的信号采集。且若需要 大面积的成像，过长的采集时间将加大图像中各个像素点之间的采集时间差，当系统应用 于活体成像时，将导致明显的图像失真。其次，使用光纤来收集荧光信号，不可避免的会因 为光纤耦合过程而造成信号的损失。若荧光团被激发时产生的荧光较弱，则CCD检测器需 要更长的曝光时间来采集足够的信号量，从而更进一步的增加了信号的采集时间。而通过 提高激发光的功率以增加荧光信号，但同时将造成荧光团光漂白几率的增加。
[0005] 可见，当前的二次扫描超分辨显微技术中，存在信号采集速率和效率较低的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的实施例提供一种彩色超分辨成像装置及方法，以解决当前的二次扫描超 分辨显微技术中，存在信号采集速率和效率较低的问题。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种彩色超分辨成像装置，用于对待测样品进行显微成像，所述装置包括激光发 射器、第一二向色镜、分光镜、CCD相机以及三通道光电倍增管模块；
[0009] 所述激光发射器发射激发光至所述第一二向色镜，所述第一二向色镜将所述激发 光反射至待测样品上，以激发所述待测样品的荧光团发出荧光，所述荧光具有荧光信号；所 述荧光信号经过所述第一二向色镜到达所述分光镜；所述分光镜将所述荧光信号分为第一 束光路和第二束光路；所述第一束光路发射至所述CCD相机，采集超分辨图像；所述第二束 光路发射至所述三通道光电倍增管模块，分别采集红颜色通道图像、绿颜色通道图像和蓝 颜色通道图像。
[0010] 具体的，所述三通道光电倍增管模块包括：第二二向色镜、第一滤光片、第一光电 倍增管、第三二向色镜、第二滤光片、第二光电倍增管、第三滤光片、第三光电倍增管；
[0011] 所述第二束光路发射至所述第二二向色镜分光出红色荧光；所述红色荧光经所述 第一滤光片进行滤光后，被所述第一光电倍增管采集，产生所述红颜色通道图像；
[0012] 所述第二束光路分光出红色荧光的剩余部分光路发射至所述第三二向色镜，分光 出蓝色荧光和绿色荧光；所述蓝色荧光经所述第二滤光片进行滤光后，被所述第二光电倍 增管采集，产生所述蓝颜色通道图像；所述绿色荧光经所述第三滤光片进行滤光后，被所述 第三光电倍增管采集，产生所述绿颜色通道图像。
[0013] 具体的，所述第一滤光片为中心波长在692. 3nm至696. 3nm之间的窄带滤光片；所 述第二滤光片为中心波长在428nm至432nm之间的窄带滤光片；所述第三滤光片为中心波 长在541. 5nm至545. 5nm之间的窄带滤光片。
[0014] 进一步的，所述装置还包括在所述激光发射器和所述第一二向色镜之间设置的衰 减片；所述激光发射器发射激发光至所述衰减片进行强度衰减，再发射到所述第一二向色 镜处。
[0015] 进一步的，所述装置还包括依次设置于所述第一二向色镜和所述待测样品之间的 激发振镜、第一扫描透镜、镜筒透镜和第一物镜；
[0016] 经所述第一二向色镜反射的激发光照射在所述激发振镜上，经所述激发振镜改变 方向后进入所述第一扫描透镜、所述镜筒透镜和所述第一物镜，到达所述待测样品处；
[0017] 待测样品的荧光团发出的荧光依次经过所述第一物镜、镜筒透镜、第一扫描透镜、 激发振镜到达所述第一二向色镜。
[0018] 进一步的，所述装置还包括依次设置于所述第一二向色镜和所述分光镜之间的第 四滤光片、第二物镜、针孔以及第三物镜；
[0019] 所述荧光通过所述第一二向色镜到达所述第四滤光片进行滤光，消除荧光中的杂 散信号，并保留荧光中的所述荧光信号；
[0020] 进行滤光后的所述荧光信号依次经过所述第二物镜、针孔和第三物镜，到达所述 分光镜。
[0021] 进一步的，所述装置还包括依次设置于所述分光镜和所述C⑶相机之间的二次扫 描振镜和第二扫描透镜；
[0022] 所述第一束光路发射至所述二次扫描振镜后，再经过所述第二扫描透镜聚焦到所 述CCD相机处，以采集超分辨图像。
[0023] 具体的，所述分光镜为30:70分光镜；所述30:70分光镜将所述焚光信号分为第一 束光路和第二束光路；所述第一束光路为所述荧光信号的30%部分，所述第二束光路为所 述焚光信号的70%部分。
[0024] -种彩色超分辨成像方法，应用于上述的彩色超分辨成像装置，所述方法包括：
[0025] 将激光发射器发射的激发光经过第一二向色镜反射至待测样品上，以激发待测样 品的荧光团发出荧光；其中，所述荧光具有荧光信号；
[0026] 将所述荧光信号经过所述第一二向色镜到达分光镜；
[0027] 通过所述分光镜将所述焚光信号分为第一束光路和第二束光路；
[0028] 将所述第一束光路发射至CCD相机，通过所述第一束光路采集超分辨图像；
[0029] 将所述第二束光路发射至三通道光电倍增管模块，通过所述第二束光路分别采集 红颜色通道图像、绿颜色通道图像和蓝颜色通道图像；
[0030] 将所述红颜色通道图像、绿颜色通道图像和蓝颜色通道图像分别与所述超分辨图 像进行矩阵点乘，分别生成红颜色超分辨图像、绿颜色超分辨图像和蓝颜色超分辨图像；
[0031] 将所述红颜色超分辨图像、绿颜色超分辨图像和蓝颜色超分辨图像经过矩阵相加 运算，生成彩色超分辨图像。
[0032] 具体的，所述将所述第二束光路发射至三通道光电倍增管模块，通过所述第二束 光路分别采集红颜色通道图像、绿颜色通道图像和蓝颜色通道图像，包括：
[0033] 将所述第二束光路发射至第二二向色镜分光出红色荧光，并将所述红色荧光经过 第一滤光片进行滤光，再由第一光电倍增管采集，产生所述红颜色通道图像；
[0034] 将所述第二束光路分光出红色荧光的剩余部分光路发射至第三二向色镜，分光出 蓝色荧光和绿色荧光；
[0035] 将所述蓝色荧光经过第二滤光片进行滤光，再由第二光电倍增管采集，产生所述 蓝颜色通道图像；
[0036] 将所述绿色荧光经过第三滤光片进行滤光，再由第三光电倍增管采集，产生所述 绿颜色通道图像。
[0037] 本发明实施例提供的一种彩色超分辨成像装置及方法，通过将待测样品发出的荧 光信号分为两束光路，并分别发射到CCD相机和三通道光电倍增管模块处，从而能够通过 三通