超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学显微成像和原子力扫描成像不同模态成像技术的耦合，特别是一 种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置。
【背景技术】
[0002] 在微纳米尺度上对细胞膜上特定及相关生物学过程进行观察是近年来的热点，普 通荧光光学显微术由于对样本具有无损特点，在活细胞显微和检测研究中占据重要位置。 然而，由于荧光显微术，包括激光共焦扫描显微术受到衍射极限制约，空间分辨率都只能接 近半个波长。为了突破衍射极限（超衍射极限），即空间分辨率在200nm以下，近年来各种超 分辨光学成像技术，如受激发射损耗显微术STED、随机光学重建显微术ST0RM、光活化定位 显微术PLAM和结构光照明显微术S頂等应运而生。在上述的几种超分辨光学显微术中，结构 光照明显微术S頂是基于对光的照明方式进行改变，即改变系统的光学传递函数，实现分辨 率的提高(线性S頂技术分辨率最高可提高1倍，约为四分之一波长）;此外，S頂技术还具有 技术方案简单、成本较低、成像速度快、光漂白效应不明显等优点，使其在l〇〇nm量级的超衍 射分辨率相关研究如细胞膜上微区、细胞微丝、微管等细胞器的光学显微成像中获得青睐。
[0003] 原子力显微术AFM是扫描探针显微术的一种。它是基于探针针尖与样本表面分子 相互作用的原理，具有很高的横向和纵向分辨率(Ml量级），可以对样品表面形貌实现精确 扫描和成像。在过去的几十年，AFM技术已在材料领域获得了广泛应用。然而原子力探针无 特异性识别能力，而SIM则不具备获取纳米量级超微结构相关功能信息的能力。
【发明内容】
[0004] 为了实现对特定区域微结构和功能信息的获取，本发明所要解决的技术问题是提 供一种将结构光照明显微术SM和原子力显微术AFM有机融合的超衍射极限细胞膜微结构 生物物理特性获取方法与装置。
[0005] 为了解决上述问题，本发明的技术方案是:一种超衍射极限细胞膜微结构生物物 理特性获取装置，包括激光器和半导体激光器，所述激光器的激光输出光路依次设置有偏 振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板、第二会聚 透镜组和二向色镜，所述二向色镜的反射光输出光路依次设置有光学显微镜的物镜和载物 台，所述二向色镜的透射光输出光路依次设置有滤波片、可切换反射镜、第六会聚透镜和 CCD探测器，所述半导体激光器的激光输出光路依次设置有第二反射镜、由三维控制器驱动 的探针和位置敏感探测器，所述CCD探测器、三维控制器和位置敏感探测器均连接至数据采 集控制系统。
[0006] 在本发明的进一步技术方案中，所述第一会聚透镜组包含第一会聚透镜和第二会 聚透镜。
[0007] 在本发明的进一步技术方案中，所述第二会聚透镜组包含第四会聚透镜和第五会 聚透镜。
[0008] 在本发明的进一步技术方案中，所述第一反射镜输出的激光束入射到空间光调制 器的入射角度应小于10°。
[0009] 在本发明的进一步技术方案中，所述挡光板是用于阻挡空间光调制器0级衍射光 而只允许+1级衍射光和-1级衍射光通过的0级挡光板。
[0010] 为了解决上述问题，本发明的另一技术方案是:一种超衍射极限细胞膜微结构生 物物理特性获取方法，采用上述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，将样 品放置于载物台上，并按以下步骤进行： (1 )SIM成像模态:激光器福射出的激光依次经过偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一 反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板和第二会聚透镜组，第二会聚透镜组输出的 激光束经二向色镜反射后再依次经过物镜和载物台，样品反射回的激光束依次经过载物台 和物镜后再经二向色镜透射到滤波片，滤波片过滤后的激光束依次经过可切换反射镜和第 六会聚透镜后由CCD探测器接收光信号，最后由数据采集控制系统完成图像采集和数据处 理； (2)AFM成像模态:在实施和完成S頂成像模态后，将数据采集控制系统的工作方式切换 到AFM成像模态;在此工作模态下，由数据采集控制系统控制三维控制器使探针接近样品的 选定区域，并通过倒置的光学显微镜从底部的方向向上观察探针；由半导体激光器发射出 的激光经过第二反射镜后从探针上表面反射到位置敏感探测器；当探针在样品表面扫描， 探针会因为与样品之间的相互作用力而弯曲，激光光斑会随之偏移，位置敏感探测器接收 到信号，记录下偏移量，通过信号转换相应的生物物理特性参数，并被数据采集控制系统所 接收。
[0011] 在本发明的进一步技术方案中，步骤（1)中的数据采集控制系统按以下步骤进行 图像米集： (1.1) 放置好样品后，在三维控制器上装上探针，使针尖略浸入样品的细胞液面，调节 激光光斑在位置敏感探测器上的位置； (1.2) 校准探针； (1.3) 选定样品的区域，做光学校准，CCD探测器采集荧光图像 (1.4) 进行亚衍射极限细胞结构的荧光高分辨成像； (1.5) 设置空间光调制器的相位控制图像，在相位Φ、Φ + Δφ、φ+2Δφ、φ +90°、Φ + 90° + Δ φ和φ+90°+2Δ φ控制的结构光照明下，C⑶探测器依次采集荧光图像Π 、荧光图像 ΙΠ 、荧光图像IV、荧光图像V、荧光图像VI和荧光图像W; (1.6) 重构获得超分辨图像VI; (1.7) 打开半导体激光器，依据超分辨图像珊，调整探针至样品所选定区域位置或目 标； (1.8) 关闭空间光调制器，选用相应AFM工作模式，进行AFM数据采集。
[0012] 在本发明的进一步技术方案中，步骤（1.5)中的空间光调制器按以下步骤进行设 置相位控制图像： (1.5.1) 空间光调制器的相位控制图像设置为0°相位的结构光照明图像，调节偏振器， 使得挡光板后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强，CCD探测器采集荧光图像Π ; (1.5.2) 空间光调制器的相位控制图像设置为Δ φ相位的结构光照明图像，(XD探测器 采集荧光图像m; (1.5.3) 空间光调制器的相位控制图像设置为2 Δ φ相位的结构光照明图像，CXD探测 器采集荧光图像IV; (1.5.4) 空间光调制器的相位控制图像设置为90°相位的结构光照明图像，(XD探测器 采集荧光图像V; (1.5.5) 空间光调制器的相位控制图像设置为90° + Δ φ相位的结构光照明图像，C⑶探 测器采集荧光图像VI; (1.5.6) 空间光调制器的相位控制图像设置为90°+2Δ φ相位的结构光照明图像，（XD 探测器采集荧光图像W。
[0013] 在本发明的进一步技术方案中，步骤(1.5.4)调节偏振器，使得挡光板后的+1级衍 射光和-1级衍射光达到最强。
[0014] 在本发明的进一步技术方案中，步骤(1.6)按以下步骤重构获得超分辨图像VIII: (1.6.1) 对图像采集步骤中CCD探测器采集到的6张原始图像Π -W进行图像亮度均一 化处理，以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响； (1.6.2) 对上述处理后的图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息； (1.6.3) 由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3X3的线性方程组，分离出0级、 +1级和-1级频谱成像信息； (1.6.4) 由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频 率ko与初始相位Φ ; (1.6.5) 将分尚出的+1级频谱平移+k〇，将分尚出的-1级频谱平移_k〇; (1.6.6) 将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱 扩宽； (1.6.7) 对步骤（1.6.6)得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得(XD探测器采集的超 分辨图像。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明有机融合了结构光照明方式显微 术SIM和原子力扫描成像AFM二种不同模态的成像技术，可以实现超衍射极限细胞膜微结构 生物物理特性的信息获取，对纳米生物医学及其相关研究具有重要意义。
【附图说明】
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