Csfv抗体的改进的诊断测试的制作方法
【专利摘要】本发明涉及兽医诊断学领域，具体地涉及用于检测针对CSFV的抗体的测试。具体地，本发明涉及用于检测测试样品中的针对野生型CSFV的抗体的方法，其特征在于该方法包括与包含CSFV E2蛋白的突变的TAVSPTTLR表位的载体共温育。此外，本发明涉及诊断测试试剂盒，和本发明方法的用途。此外，本发明涉及用于区分被野生型CSFV感染的动物和用CSFV(标记)疫苗针对CSFV接种疫苗的动物的方法，和用于通过组合使用CSFV(标记)疫苗和本发明的诊断测试试剂盒控制猪类动物群体中的野生型CSFV的感染的方法。
【专利说明】CSFV抗体的改进的诊断测试
[0001] 本发明设及兽医诊断学领域，具体地设及用于检测针对CSFV的抗体的测试。具体 地，本发明设及用于检测测试样品中的针对野生型CSFV的抗体的方法。此外，本发明设及诊 断测试试剂盒，和所述方法用于检测针对野生型CSFV的抗体的用途。此外，本发明设及用于 区分被野生型CSFV感染的动物和用CSFV疫苗针对CSFV接种疫苗的动物的方法，和用于控制 猪类动物群体中的野生型CSFV感染的方法。
[0002] 已知不同的测试用于血清学诊断微生物的感染，W确定人或动物对微生物或针对 微生物的抗体阳性还是阴性的。通常，此类测试包含使用提供特异性的定义抗体检测可能 已经形成的免疫复合物的技术。经常，测试也将具有用于扩增信号强度的步骤，和一个或多 个用于洗去未结合的、非特异性的或不需要的组分的步骤。免疫复合物的检测可W多种方 式进行，诸如光学上通过检测颜色变化、巧光或颗粒大小的变化，或者另外通过检测免疫复 合物中的放射标记的抗原或抗体。类似地，测试的物理形式可W广泛变化，并且可W例如采 用微量滴定板、膜、试纸、生物传感器忍片、凝胶基质或包含(微)载体颗粒诸如胶乳、金属或 聚苯乙締(polystyreen)等的溶液。
[0003] 此类测试的特定设置的选择通常通过输入样品的类型、所需测试灵敏度(正确鉴 定阳性样品）和特异性(正确地区分真阳性和真阴性样品）来确定;此类特性取决于免疫应 答的强度和时机，或微生物的存在。进一步，测试经济诸如其大规模适用性和其成本的要求 对于具体格式的选择可W是决定性的。
[0004] 熟知的诊断测试是:放射免疫测定法、免疫扩散、免疫巧光、免疫沉淀、凝集、溶血、 中和和"酶联免疫吸附测定法"或ELISA。尤其是对于大规模测试，可要求液体处理、结果读 取和处理或两者的自动化。运还可需要用更加现代化和小型化的形式诸如Alph化ISA? (Perkin Elmer)代替传统的测定形式。
[0005] 常用的诊断测试是酶免疫测定，诸如化ISA。运些是容易放大的，并且可W是非常 灵敏的。其他优点是其结果的动态范围，因为可W在稀释范围内测试样品。结果W吸光度的 任意单位表示，一般为0.1和2.5光密度(0D)单位之间，运取决于用于读出的技术设备的性 能和设置。包括常规合适的阳性和阴性对照样品，并且多次测试倍数最高的样品。通过包括 定义参考样品（的稀释范围）而获得标准化，其也允许将特定评分匹配至用于确定阳性或阴 性的预设值，并且允许与生物学意义关联，例如:抗原的量与效力的关联，或抗体的量与免 疫保护水平的关联。
[0006] ELISA设置的许多变体是已知的，但通常采用将抗原或抗体固定化至固相，例如固 定化至微量滴定板的孔。当固定化抗体时，测试被称为'捕获'或'夹屯、'ELISA。接着添加测 试样品，允许配体(例如检测抗原或抗体)结合。然后加入检测剂(抗体、抗原或其他结合组 分），其缀合至标记，例如缀合至可诱导颜色反应的酶，所述颜色反应可W分光光度读取。其 他类型的标记可W使用发光、巧光或放射性。标记的检测剂的使用意在提供应用信号强度 W增强测试灵敏度，但是，它也可引入背景信号，降低信噪比。
[0007] 在化ISA方案的变体中，通过引入竞争性结合改善测试特异性，在该情况下，测试 被称为'竞争化ISA'、'抑制化ISA'、'干扰化ISA'或'阻断化ISA'。在此类测定中，测试样品 中的因子(抗体或抗原）与标记的检测抗体/抗原竞争结合固定化至固相的分子(抗原或抗 体）。运导致最大颜色信号的下降，它是测量竞争因子的存在或量的灵敏方式。结果可W表 示为最大化ISA信号的抑制百分比。
[0008] 由于其多功能性和灵敏性，一般使用化ISA，例如用于流行病学、感染监测计划，或 验证接种疫苗活动的效力。ELISA的该用途也延伸至动物健康部口，例如监测更相关的传染 病的根治和控制措施。在该背景中关键的是诊断测试的足够水平的敏感性和特异性，因为 在运方面的错误可具有任一方式的严重后果:假阳性可导致动物的不必要的检疫或扑杀， 假阴性可导致通过未检测到的载体动物跨境运输传播病原体。ELISA的此类使用的一个实 例是控制0IE应具报疾病，诸如猪类动物中的典型猪攝(CSF)。
[0009] 也称为猪霍乱或猪攝的CSF是全世界发生的猪类动物的常见致命疾病。它由高度 感染性的典型猪攝病毒(CSFV)(也被称为猪霍乱病毒）引起。该疾病导致大量动物患病，和 依赖于商业猪养殖及其产品的部口的巨大经济损失。
[0010] CSFV属于黄病毒科，并且属于攝病毒属。熟知的其他攝病毒是感染绵羊和猪的边 界病病毒(BDV)，W及感染牛、绵羊和猪的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。在运些相关的病毒之 间发生一定水平的交叉保护。CSF病毒颗粒相对较小且有包膜，并且包含约12.3化的正有 义、单链RNA病毒基因组。此基因组被翻译为一种约4000个氨基酸的大型多蛋白，其被许多 非结构病毒蛋白自动切割。运产生主要结构病毒包膜糖蛋白：Erns、El和E2。关于病毒及其 疾病的综述，参见:Moennig (2000，Vet. Microbiol., vol. 73，P. 93)。
[0011] 检测抗CSFV抗体的黄金标准是病毒中和测试。但是，因为运是费力和困难的， ELISA型测试用于快速筛选和检测，并且各种商业测试可用于检测CSFV抗原或CSFV抗体。此 类测试综述于Blome等人（2006, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 25, P. 1025) dCSFV抗原的巧聯检测全病毒或特定病毒(包膜)蛋白，诸如化ns或E2。类似地，CSFV抗 体的测试检测病毒-、E2-或Erns抗体。检测目标动物中的抗体比检测抗原或病毒更灵敏，因 为抗体在动物中存在更长时间，为检测提供更宽的时间窗口。此外，因为攝病毒间的交叉反 应性，在BVD和/或BVDV高流行地区，基于化ns抗原或抗体的检测的CSFV的诊断测试是不可 靠的。因此，CSFV诊断目前聚焦于抗CSFV E2蛋白抗体的检测。对于综述：Schroeder等人 (2012, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 31, p. 997)〇
[0012] CSFV E2蛋白（W前称为糖蛋白El或即51-54)从CSFV多蛋白的氨基酸(aa)位置690 起进行编码。成熟CSFV E2蛋白长度为约370 aa，其不具有与El C-末端重叠的约22 aa的N- 末端信号序列，但包括约40 aa的C-末端跨膜区（Ganges等人，2005, vaccine vol. 23, p. 3741)。在E2上，免疫显性A结构域位于多蛋白的氨基酸位置766和866之间（van Ri化等 人，1993. J. of Gen. Virol.，vol. 74，P. 2053)。在该结构域内，已经鉴定一个引发 病毒中和抗体的线性B-细胞表位:TAVSPTTLR表位(SEQ ID NO: 1)。此表位位于CSFV多蛋白 的氨基酸位置829 - 837处，其对应于E2 aa序列的aa 140-148,并且在CSFV毒株之间是高 度保守的，但不与BVDV-或BVD抗体交叉反应化in等人，2000，J. of Virol.，vol. 74， p. 11619)。
[0013] 已经开发了采用该抗原的特异性的许多商业E2抗体测试:PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 (W前命名为 Ceditest? CSFV 2.0)(均购自 Prionics AG, Schlieren-Zurich, Switzerland)和IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX Europe B.V.，Hoofddorp, The Netherlands)。运些测试是使用固定化的CSFV E2蛋白的竞争性化ISA试剂盒。当任何E2抗 体存在于测试样品中时，它们结合固定化的CSFV E2,所W与标记的指示剂抗体竞争，所述 标记的指示剂抗体是酶缀合的对于野生型CSFV E2的TAVSPTTLR表位特异性的单克隆抗体； 运些试剂盒中用作指示剂的标记的单克隆抗体被称为V2 (Prionics)或A18 (IDEXX)，并且 与Lin等人(2000，同上)使用的WH303单克隆抗体具有相同的特异性。
[0014] 针对CSF的疫苗是已知的，并且正在CSFV流行的国家常规使用。由于灭活CSFV疫苗 是不切实际的，因为活减毒病毒疫苗已经使用多年；最有效的疫苗基于所谓的化ina-或C- 毒株。它具有非常可靠的多年使用跟踪记录，并且也是欧盟允许的唯一活减毒疫苗，尽管仅 用于在CSF爆发的情况下紧急接种疫苗。经常通过禁止抗CSFV抗体血清阳性的猪的运输的 贸易限制体系来支持CSF的政府控制计划(例如抓Council Directive 2001/89/EC)。
[0015] 但是，一些国家可能遭受野生猪和野猪频繁再感染CSFV的天然储库。因此，发生 CSF的偶尔爆发，许多猪(感染的和未感染的)被扑杀。运导致大量的伦理问题W及相当大的 成本。此外，进行紧急接种疫苗的猪可能不再被出口，因为它们已经变为阳性。运导致猪腐 的过度拥挤和进一步的经济损失。
[0016] 因此，努力集中于开发允许血清学"区分感染的动物与接种疫苗的动物"或:DIVA 的疫苗。此类型的区分测试背后的基本原理是，可W将用具有阳性或阴性'标记'功能的疫 苗对目标动物接种疫苗与野生型微生物感染动物在血清学上区分开。例如，该标记疫苗可 W是野生型微生物中存在的一种或多种抗原缺陷的。受感染的目标然后将变为该抗原血清 阳性的，而接种疫苗者仍然是该抗原血清阴性的。
[0017] 开发用于针对CSF使用的一类DIVA疫苗基于病毒亚单位，诸如E2和/或化ns。但是， 运些保护性较差，并且比全病毒疫苗具有较慢的免疫开始。
[0018] 此外，在未接种疫苗和扑杀CSFV的方案下，允许此类CSFV标记疫苗上市的唯一方 式是与可靠的伴侣诊断测试组合。
[0019] 为了努力将强烈和早期的保护W及DIVA能力组合于一种疫苗中，用Kodekaas等 人(2010，J. of Virol. Methods, vol. 163，P. 175)的重组DNA技术修饰现有的C-毒株 活减毒CSFV疫苗，由此它们聚焦于CSFV E2蛋白的A结构域中的TAVSPTTLR表位。突变或缺失 表位中的一些氨基酸，在此之后，使突变的CSFV病毒进行受迫病毒进化。获得具有 TAVSPTTLR表位的不同突变的活突变病毒。
[0020] 在E2的C-毒株CSFV突变体的vFlc- Δ PT系列中，选择一种用于进一步研究，命名 为:vFlc-APTal。此病毒具有E2的TAVSPTTLR表位的通过取代一个氨基酸和缺失两个氨基 酸形成的突变版本，对应于原始TAVSPTTLR表位的表位则变为:TAGS化RTE (SEQ ID NO: 2)。 此突变病毒显示良好的活力，并诱导针对E2的强烈抗体应答。此外，针对突变E2的兔抗体确 实不再识别亲本C-毒株病毒的野生型E2。因此，运被认为是允许DIVA的有效活CSFV标记疫 苗的理想候选。
[0021] 然后在目标动物中测试vFlc-APTal突变病毒的疫苗效力（Kortekaas等人， 2011, Vet. Microbiol., vol. 147, P. 11)，其中发现它诱导的保护水平接近于亲本毒 株的保护水平，并且有效地防止攻击病毒的脱落。但是，作者们失望地发现，来自用该突变 病毒接种疫苗的猪的血清不能与来自用亲本C-毒株病毒接种疫苗的猪的血清清楚地区分。 运是因为，E2突变病毒在猪中诱导抗体，所述抗体在E2 ELISA中得到中等至全强度假阳性 评分。因此，运排除了新的DIVA标记疫苗的市场引入，因为其缺乏可靠的区别性CSFV抗体检 测。
[0022] 为了努力克服来自用标记疫苗接种疫苗的猪的血清在E2 ELISA中的假阳性评分， Kortekaas等人(2011，同上)考虑对化ISA进行几种修改，诸如:通过使用Ξ级结构预测修饰 使用的肤;使用将允许更好地区分的新的单克隆抗体;使用不同的封闭抗体改变化ISA，因 为运已为其他人证明有效化olinka等人，2009，Virology, vol. 384，P. 106);和:改变 读出的截止值，同时保持可接受的灵敏度。发现所有运些方法对于克服假阳性的发生是无 效的。
[0023] 如所指出，Holinka等人(2009,同上）的结果，当测试来自用不同的重组CSF标记物 接种疫苗的猪的血清时，没有在类似E2 ELISA中显示假阳性结果。但是，它们的结果不能被 认为是显著的：一方面是因为它们测试合并的血清，而不是个体血清，并且在另一方面是因 为它们的读数在检测的底部范围内（0.100至0.350 0D单位;参见化linfoi等人，2009，同上； 图3A)，其中信噪比太不利，无法为可靠的大规模诊断测试形成基础。
[0024] -个更好的实例是Reimann等人（2010, Vet. Microbiolvol. 142, P. 45)的 出版物，其通过将来自CSFV E2的TAVSPTTLR表位替代为来自BVDV E2的对应序列而构建了 非常像化linka等人的疫苗的重组CSF疫苗。与Kodekaas等人（2011，同上）的结果一致， Reimann等人还发现用其突变E2病毒接种疫苗的猪的血清中的交叉反应性抗体，其结合未 修饰的E2表位。所W同样在此情况下，获得了假阳性分数，并且不能开发DIVA测试。为了解 决此问题，Reimann等人建议调整成本与灵敏度之比的截止值，或改变突变病毒骨架序列W 减少假阳性评分。
[0025] 所W，发现对TAVSPT化R表位的不同突变导致基于此类突变表位的CSFV标记疫苗 的相同问题:在基于vFlc-APTal病毒的CSFV疫苗的情况下，对TAVSPTTLR表位的突变改变 了该基因座中的9个氨基酸中的6个。类似地，对于Reimann等人(2010,同上），在测试E2蛋白 的相应基因座中的9个中的5个不同氨基酸时，此问题也会发生。
[0026] 因此，获自用包含CSFV E2蛋白的突变的TAVSPTTLR表位的CSFV(标记)疫苗接种疫 苗的动物的血清中的野生型CSFV E2抗体在化ISA中的假阳性评分的问题，因此具有普遍性 质，并且直到今天，仍然没有得到解决。在CSF候选疫苗的最近综述中，Ebl6等人（2013， Vet. Microbiol., vol. 162，P. 437)确认了此困境:对于CSFV，还没有得到CSFV疫苗和 相应的DIVA测试的最佳组合。
[0027] 因此，本发明的目标是克服现有技术中的缺点，并且通过当测试来自用在CSFV E2 的TAVSPT化R表位中具有突变的CSFV疫苗接种疫苗的动物的样品时减少针对野生型CSFV的 抗体的诊断测定中的假阳性结果而适应本领域中的需求。
[0028] 令人惊讶地发现，通过允许DIVA的野生型CSFV抗体的改进的诊断测试，可W满足 此目的，且因此可W克服现有技术的缺点。所述改进考虑修改野生型CSFV E2抗体的诊断测 定的溫育步骤，其中将测试样品与包含CSFV E2的TAVSPT化R表位的固定化的载体溫育，并 且现在引入与包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体的共溫育。发现此修改仅通过对 CSFV E2抗体的现有诊断测定的方案的有限修改而完全减少假阳性结果。
[0029] 此修改的诊断方法的有益效果是几个:主要一个是，此修改可完全整合入现有的 测试方案。因此，不需要额外的溫育步骤，并且改进的测试方法不需要比W前更多的时间。 考虑到在区域中CSF爆发的情况下可能需要在短时间内测试可能非常大量的测试样品，运 是明显的优点。
[0030] 此外，现在不再需要对相应的CSFV疫苗或原始诊断测定进行重大改变。相反，现在 可能使用现有的CSFV E2 ELISA的基本设置，用于检测来自用CSFV疫苗接种疫苗的动物的 样品中的野生型CSFV E2抗体。运允许依赖于确立的CSFV诊断测定法，其具有它们的证明的 可靠性，W及完全确立的特异性和灵敏度概况。
[0031] 在此修改的情况下，CSFV诊断测定现在可W用来有效地区分感染的动物和接种疫 苗的动物，因此本发明提供了允许DIVA筛选的野生型CSFV的改进的诊断测试，并且可W用 作CSFV(标记)疫苗的伴侣诊断法，W控制动物的易感群体中CSFV的存在。
[0032] 对于运些有益效果重要的步骤是由本发明人鉴定区分针对CSFV的接种疫苗与被 野生型CSFV或C-毒株疫苗感染的失败原因。
[0033] 发现此原因是，包含具有突变的TAVSPTTLR表位的E2的CSFV(标记)疫苗诱导抗体， 所述抗体不仅可W特异性结合疫苗的突变的E2表位，而且可W同样高亲和力结合野生型 CSFV和C-毒株疫苗中的E2的未修饰TAVSPT化R表位。当对于野生型CSFV的感染测试接种疫 苗的动物的血清样品时，运导致假阳性评分。相反，没有发现由野生型CSFV的感染或用C-毒 株疫苗接种产生的抗体，或针对野生型TAVSPTTLR E2表位的单克隆抗体（例如：V2 (Prionics), A18 (IDEXX), orW册03化in等人，2000，同上））对于CSFV疫苗的具有突 变的TAVSPTTLR表位的E2蛋白具有任何明显的亲和力。运是为什么与包含野生型CSFV E2蛋 白的TAVSPTTLR表位的载体共溫育没有解决针对具有突变的TAVSPT化R表位的疫苗的假阳 性评分的问题的原因。
[0034] 目前不知道此现象如何发生或者为什么发生。但是，不限于将解释运些观察结果 的任何理论或模型，本发明人推测有CSFV E2的TAVSPTTLR表位的Ξ维形式的影响；此Ξ维 形式在其线性氨基酸序列的突变后发生改变。运诱导针对突变的E2表位的抗体，运显然仍 然能够特异性结合CSFV E2的野生型TAVSPT化R表位。此类抗体在基于野生型CSFV E2蛋白 的诊断测定中是交叉反应的，从而导致高度特异性的假阳性评分。
[0035] 具有运种对假阳性测试评分的问题的原因的见解，本发明人然后发现了解决此问 题的令人惊讶的方式，并且能够在确立的E2诊断测定法的方案的一个步骤中实施解决方 案:将测试样品与包含CSFV E2蛋白的TAVSPTTLR表位的固定化载体溫育的步骤，并且此外： 与包含CSFV E2蛋白的突变的TAVSPTTLR表位的载体共溫育。运解决了假阳性评分的问题。
[0036] 诊断方法的修改可W采取共溫育的形式的事实是惊讶的，因为通常会预期此类程 序对于测试样品中的CSFV E2抗体与包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体的正确和 完全结合是破坏性的，因此技术人员通常不会加 W考虑。
[0037] 因此，在第一方面，本发明设及用于检测测试样品中针对野生型典型猪攝病毒 (CSFV)的抗体的方法，其中所述样品还可W包含针对CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的抗 体，所述方法包括将所述测试样品与包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体溫育的步 骤，特征在于所述方法包括在所述步骤中与包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体共 溫育。
[0038] 本发明的"检测方法"是体外方法，其应用于测试样品，W确定测试样品的值或特 性(通常被称为"生物标记物"），在此之后，测定的结果可W被解释成为其结果给予特定意 义。此解释基于使用该方法对于测试样品获得的结果与参考值或w前的测量值的比较，并 且确定测量的值是否存在或不存在，或者是否已经增加或减少。
[0039] 对于本发明，测量的值是对于野生型CSFV E2蛋白的TAVSPTTLR表位特异性的抗体 的定性和定量存在。
[0040] 本发明方法可W是不同的熟知形式之一的诊断测试，例如为:放射免疫测定法、免 疫扩散测定法、免疫巧光测定法、免疫沉淀测定法、凝集测定法、溶血测定法、中和测定法、 "酶联免疫吸附测定法"化LISA)或A1地aLISA ?。
[0041] 几本教科书描述了各种可用的诊断测试及其具体特征；例如：J.化ebner: Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions (第9 章，于：Pier, Lyczak 和Wetzler (编辑；）：Immunology, infection, and immunity, ASM Press, Washington D.C., 2004, ISBN: 1555812465, p. 207-232);'Antibodies: A L曰bor曰tory M曰nu曰 1 '（编车茸：Harlow 和Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, ISBN-10:0879693142);和：'Immunoassays:A Practical A邮roach' (J. P. Gosling编辑，Oxford University press, 2000, ISBN-10:0199637105)。
[0042] 大量商业公司可W提供诊断测试的材料和试剂，或成品诊断试剂盒，或者可W提 供测试和分析。
[0043] 设计和优化本发明方法的方案、材料和条件完全在技术人员的常规能力之内。
[0044] 也如本领域中所熟知，"抗体"是免疫球蛋白，并且通常W5类存在。对于测试样品， 所述抗体通常是IgG或IgM类型，并且是完整抗体。但是，可W用作本发明方法中的试剂，例 如作为二抗，或作为标记抗体，的其他抗体，不需要是完整免疫球蛋白，例如单链抗体，或免 疫球蛋白的一部分;并且也可W是不同的形式:此类部分的（合成）构建体，条件是抗体-部 分仍然含有抗原结合位点。免疫球蛋白的熟知子片段为:Fab、Fv、scFv、dAb或Fd片段、Vh结 构域或此类片段或结构域的多聚体。
[0045] 用作诊断测定中的试剂的抗体通常通过用目标抗原(过度)免疫供体动物、并从动 物的血清收获产生的抗体而产生。熟知的供体是兔和山羊。另一个实例是可W在蛋黄中产 生高水平的抗体(所谓的IgY)的鸡。或者，抗体可W在体外产生，例如通过熟知的从永生化B 淋己细胞培养物(杂交瘤细胞）的单克隆抗体技术，并且其工业规模生产系统是已知的。抗 体或其片段本身也可W在重组表达系统中通过表达克隆的Ig重链和/或轻链基因来表达。 所有运些都是技术人员熟知的。
[0046] 对于本发明且在正文始终，抗体将基于它们针对的目标进行命名；例如:针对CSFV 的抗体被称为' CSFV抗体'，并且' E2抗体'是针对E2蛋白的抗体，也称为抗-E2抗体等。
[0047] 如本领域中所熟知，"针对"特定目标的抗体是对于该目标上的表位特异性的抗 体，其中所述目标是特定分子或实体。如果抗体(或其片段)能够选择性结合该表位，则它对 于表位是特异性的。
[0048] 抗体和目标之间的相互作用是否是特异性和/或选择性的，可W由技术人员容易 地进行评价。例如，可W通过证明抑制与测定中使用的抗原或抗体的浓度相关来确定基于 抑制的免疫测定法的结果的特异性。使用例如竞争结合测定，可W确定需要多少抗原来使 抗体与该包被抗原的结合抑制50%(B;rudere;r等人，1990, J. of Imm. Meth.，vol. 133, p. 263)。作为本情况的实例:使用野生型CSFV E2蛋白和TAVSP化LR表位特异性(单克 隆)抗体。
[0049] 在诊断免疫测定的背景下非常相关的是当抗体证明假阳性结合、导致诊断测定的 假阳性结果时。运可W由与除了抗体针对生成的表位W外的表位的相对强结合，或由与其 来源表位、但然后位于与来源目标不同的目标上的来源表位的特异性结合导致。
[0050] 免疫测定技术领域中的技术人员知道如何区分真阳性结果和假阳性结果(例如通 过用不同类型的诊断测定证明结果，或用来自不同时间点的测试样品证明结果）。
[0051] 通过本发明方法，当测试针对野生型CSFV的E2蛋白的抗体时，可W获得假阳性评 分的显著减少。如本文所概述和例举，假阳性评分的减少已经达到被错误认为CSFV阳性的 动物数量的高达5倍(例如，超过50% ELISA抑制，低至小于10%抑制)和高达100%的减少。
[0052] 在使用本发明方法的各种测试中，基于测试结果，从感染后约3周起，来自被野生 型CSFV感染的猪的所有血清都被证明是阳性的，而来自用基于vFlc-APTal的疫苗重复接 种疫苗的动物的血清，在第Ξ次接种疫苗后，都没有变为阳性，直到测量的最后一个时间 点。
[0053] 还对来自Central Veterinary Institute (Xelys1:ad, the 化therlands)的保 藏中屯、的约900份测试样品（包含高、低、阴性或怀疑的CSFV抗体）W及许多含有BVD-或 BVDV-抗体和甚至一些CSFV、BVD和/或BVDV的混合感染的血清的大集合测试本发明方法。通 过本发明方法，可优异的特异性和灵敏度正确地鉴定几乎所有样品，参见W下实施例。
[0054] 事实上，当测试900份样品收集物时，当应用共溫育与本发明方法时，对于测试的 大多数样品甚至观察到增强的灵敏度。运意味着，与应用标准商业CSFV E2抗体阻断化ISA 相比，当应用本发明方法时，对于几份样品，在野生型CSFV E2抗体的阻断化ISA中观察到的 抑制百分率更高。运导致5份W前指示为可疑的样品现在评分为阳性，且两份W前阴性的样 品现在评分为阴性(参见实施例2.3和表2)。
[0055] 对于本发明，"野生型"猪攝病毒是指自然界中存在的CSFV。运并不意味着此类野 生型CSFV都是相同的，因为遗传组成和生物特征的许多变化是可想象的或已知的。但是，该 术语意在排除作为人为干预的结果的那些CSFV在本发明中使用，所述人为干预诸如通过修 饰或突变，例如通过反复传代，或通过经由重组DNA技术的改变其核酸。
[0056] 对于本发明，"典型猪攝病毒"或乂SFV" -般指来自分类学攝病毒属的病毒，其具 有CSFV的熟知特性。运也包括W任何方式从其亚分类的CSFV，例如作为亚种、毒株、分离株、 基因型、血清型、血清变型、血清群、变体或亚型等。此类CSFV共享它们的分类学家族成员的 表征特征，诸如基因组、物理、电子显微镜、生化特征，W及生物特征诸如生理学、免疫学或 致病行为。接着血清学分类，其他测定可W基于如本领域中已知的核巧酸测序或PCR测定 法。
[0057] 对于技术人员明显的是，尽管作为本发明主题的病毒种目前命名为CSFV，但运是 当新见解导致重新分类为新的或不同的分类组群时可W进行改变的分类学分类。然而，由 于运不改变设及的微生物或其表征特征，只有其科学名称或分类，此类重新分类的生物体 仍然在本发明的范围之内。
[0058] 用于本发明方法中使用的"测试样品"原则上可W是任何类型的含有抗体的样品， 例如从来自动物的全血样品制备的血浆或血清样品。技术人员完全知道从动物获得和制备 此类血浆或血清样品所需的技术和材料。
[0059] 优选的是血清样品，因为其更干净，并且可W通过标准实验室技术来制备，例如其 包括步骤:凝血、离屯、和补体失活。
[0060] 任选地，测试样品可W进一步处理或纯化，例如W改进信号强度或降低背景信号。 例如，可W分离出抗体。用于抗体纯化的熟知技术是例如使用辛酸或硫酸锭沉淀此类抗体， 或使用亲和色谱。
[0061] 对于本发明，本文中使用的术语"包含（comprise r(W及变型诸如"包含 (comprising)"、"包含(^comprises)"和"包含(comprised)")是指其中使用该术语的文本部 分、段落、权利要求等覆盖或其中包括的可想象用于本发明的所有要素和任何可能的组合， 即使未明确记载此类要素或组合;且不是指排除任何此类要素或组合。因此，任何此类文本 部分、段落、权利要求等也可W设及一个或多个实施方案，其中术语"包含（comprise)"(或 其变型）被替代为术语诸如"由...组成（consist ofT、"由...组成（consisting of)"或 "基本上由...组成（consist essentially of)"。
[0062] 乂SFV E2的TAVSPTTLR表位"是指具有该名称的CSFV E2蛋白的A结构域中熟知的 表位，并且是长度为9个氨基酸的线性表位。技术人员将清楚的是，给予该表位的名称 "TAVSPTTLR"，当W标准单字母IUPAC代码(其中苏氨酸被称为T，丙氨酸被称为A，等等..）表 示时，与该表位的氨基酸序列匹配。
[0063] CSFV E2的TAVSPTTLR表位在野生型CSFV中是保守的化in等人，2000,同上），并且 其氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO: 1。
[0064] 对于本发明，CSFV E2的"突变的"TAVSPTTLR表位在其氨基酸序列方面与SEQ ID NO: 1的不同在于至少一个位置。突变可W设及单个或多个改变，并且可W是氨基酸的插入、 缺失、或取代或其组合。
[00化]在本发明方法中使用的CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的一个实例是突变CSFV 病毒诸如vFlc-APTal中存在的相应表位，其中此表位是TAGSTLRTE (SEQ ID N0:2)。另一 个实例是如由Reimann等人（2010,同上）描述的重组CSFV,例如病毒pA/CP7_EW2alf_TLA， 其中相应表位是:TLANKDTLA (沈Q ID N0:3)。
[0066] 在本发明方法中使用的CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位可W获自多种天然或合 成的来源。最方便的是通过人为干预，诸如通过修饰或突变，例如通过经由重组DNA技术改 变编码的核巧酸序列，在CSFV E2的TAVSPTTLR表位中引入突变，随后在体外重组表达系统 中表达包含突变表位的蛋白（例如CSFV E2蛋白，或其部分）。
[0067] 对于本发明，"溫育"是指允许抗体和它的特异性表位之间的结合。运将需要有利 于形成此类分子相互作用的反应条件，并且将包括使用正确的缓冲剂、溫度和持续时间。用 于本发明的溫育的材料和方法在熟知的手册和商业测试供应商提供的说明书中描述。
[0068] 在本发明的上下文中，"载体"是指可W携带和呈递CSFV E2蛋白的表位的大分子 结构。原则上，任何结构可W是合适的，条件是表位可W与抗体结合。载体可W是生物或矿 物质来源的，天然或合成的，大或小的，并且可W例如是金属颗粒、聚合物、蛋白或碳水化合 物。该表位可W通过共价键或通过非共价键(包括任何种类的离子、静电、水动力或分子相 互作用)连接。该表位包含在载体中或载体上，并且因此可W是它的一部分，例如作为蛋白 中的内部元件，或者作为融合蛋白。该载体也可W含有其他分子或基团，诸如当包含表位的 蛋白是脂蛋白或糖蛋白，或缀合物等时。将表位连接至载体的方法是本领域中熟知的，并且 可W包含生化或重组DM技术。
[0069] 对于本发明，蛋白是氨基酸的分子链。该蛋白可W是天然或成熟的蛋白，蛋白前体 或前蛋白，或蛋白的免疫原性片段。特别是:肤、寡肤和多肤包括于蛋白的定义内。
[0070] 本发明的载体是"固定化的"，意味着:通过共价键合或通过非共价键合，诸如通过 吸附或包被等，连接至固相。运并不暗示固相本身是不动的。固相原则上可W是任何固体支 持物，条件是它允许执行本发明的检测方法，并且可W是不同的大小、形状或形式，例如板、 颗粒、膜等等…。
[0071] 将载体固定化到固相的方法和材料是本领域中熟知的，并且可W例如设及使用碳 酸盐缓冲液和碱性pH值。或者，固定化可W例如是通过导致共价键合的化学反应，或通过载 体的生物素化和与抗生物素蛋白包被的固体载体的结合。
[0072] 优选地，固相是微量滴定板的孔，或A1地aL ISA测定中使用的载体珠。
[0073] 对于本发明，"共溫育"表明包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体与包含 CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体和测试样品一起溫育。在实践中，运将意味着，包含 CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体存在于溫育混合物中，所述溫育混合物应用于将包 含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体和测试样品溫育该溫育所需的时间的至少实质 部分的步骤中。多少时间构成"实质部分"取决于所采用的诊断测定的特定方案的细节。例 如，IDEXX CSFV Ab测试的制备商的说明书表明，用于将测试样品和固定化的E2蛋白溫育的 步骤的时间段为2小时或过夜（12 - 18小时）。
[0074] 对于本发明，'时间的实质部分'是指用于将包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定 化载体和测试样品溫育的步骤的时间的至少25%。优选为该时间的50%，更优选该时间的 75、90、95、99或100 %，W该优先顺序。
[0075] 此共溫育设置将本发明方法与将被视为预溫育的溫育分开，其将采用单独和额外 的将测试样品和包含突变的TAVSPTTLR表位的载体溫育的步骤，并且其可W在与包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体溫育之前进行。此类预溫育将是技术人员当优化溫育方 案时的标准选择，因为它允许减少任何不希望的结合反应的良好控制的可能性。但是，本发 明的令人惊讶的发现是，运些溫育可W有利地整合入一个步骤中作为共溫育，而没有对测 试的选择性和特异性的不利影响。
[0076] 如所述，突出的优点之一是，共溫育不需要额外的时间来进行诊断测定。一个进一 步优点是，可W使用标准商业E2 ELISA的基本方案，而无需对测试组分或它的方案进行明 显修改。
[0077] 在本发明方法的一个实施方案中，检测是通过酶免疫测定法，更优选通过化ISA (酶联免疫吸附测定法）。
[0078] ELISA是熟知的，并且形式和方案的各种类型是已知的。一般优点是它们提供快速 和可靠的结果，并且可W容易按比例放大。
[0079] 在本发明方法的一个优选实施方案中，ELISA是间接阻断化ISA。如本领域中已知， 运暗示来自测试样品的抗体与标记的检测抗体竞争结合固定化的表位。测试样品中存在的 抗体越多，它越结合固定化的表位，并且可W保留较少标记的抗体，导致标记结合的最大水 平的下降(抑制）。
[0080] 本发明方法的示例性方案（由此检测是通过间接阻断化ISA)可W包括一些或所有 连续步骤： -将包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的载体包被于固相， -将测试样品和包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体与包被载体共溫育，随 后洗涂， -与标记的二抗溫育，然后洗涂， -显色反应，和 -读取结果。
[0081] -些步骤可W分开进行，或由不同方面进行。例如，当作为商业测试应用时，供应 商也提供准备用于与测试样品共溫育的预包被固相。
[0082] 任选地，所述方案可W另外含有用于阻止假阳性结合反应的一个或多个步骤。通 常，运设及在用于溫育和/或洗涂步骤的缓冲液(例如，脱脂奶，或血清白蛋白）中与过量的 非特异性蛋白溫育。
[0083] ELISA可W通过如下进一步优化:调整其试剂和过程步骤，诸如溫育步骤的溫度和 持续时间；用于固定化或用于检测的抗体或抗原的特异性和种类;应用的固定化的量和方 法;和所用的溫育和洗涂缓冲液的组成。
[0084] 酶免疫测定的一般参考文献存在于各种出版物中，尤其是标准实验室教科书，诸 女日：'The Immunoassay Handbook (第4片反：Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques'； D. G. Wild edt., 2013, ISBN-10: 0080970370);和：'The ELISA 加 idebook' （Methods in Molecular Biology, vol. 149， J. R. Crowther, Humana Press, 2000，ISBN-10:0896037282)。替代品是供应商的手册， 诸如："Technical guide for ELISA", Κ化 Inc., Gaithersburg, MD, USA, 2013;和： Eli Lilly &Co.的"Assay guidance manual"，章节：Immunoassay methods, K.Cox等人， 2012年5月。
[0085] 在一个进一步优选实施方案中，本发明的化ISA基本上类似于CSFV E2抗体的商业 ELISA，例如：PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 ELISA，W前命名为Ceditest? CSFV 2.0 ELISA， 均购自Prionics AG (Schlieren-Zurich, Switzerland),或IDEXX CSFV Ab测试，购自 IDEXX Europe B.V.巧oofddo;rp, The Netherlands)。在运方面，'基本上类似的'是指用 于运些商业测试的方案和材料。
[0086] 也可W设计本发明方法的可替代方案。例如，可W基于本领域中熟知的A1地aLISA 测试的方案的特征设置本发明方法。在此类测试中，不需要洗涂步骤，而可W手动进行测 定，优选自动化的A1地aLISA。
[0087] AlphaLISA方案的特征是，抗原(运里:包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的载体)和抗 体(运里:CSFV E2的TAVSPTTLR表位特异性的（单克隆）抗体)结合载体珠，可通过发光检测 它们的结合。
[008引包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的载体可W例如生物素化，并固定在抗生物素蛋白 包被的受体珠上，并与缀合至供体珠的抗体一起使用。此类AlphaLISA测试中的一个步骤然 后包括共溫育用包含CSFV E2的TAVSPrrLR表位的载体包被的受体珠与测试样品和包含 CSFV E2的突变的TAVSPT化R表位的载体。周围的其他方法（包含包被CSFV E2的突变的 TAVSPTTLR表位的载体），或中间形式(从而包被两种载体），是同样可行的。下一步骤然后可 w是与抗体包被的供体珠溫育，最后读出结果。
[0089] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，检测是通过具有A1曲aLISA?的特征的诊 断测试。
[0090] 本发明方法对于测试来源于易受CSFV感染的动物的样品是最有利的。运些是猪科 的各种动物。
[0091] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，测试样品来源于猪类动物。
[0092] 对于本发明，"猪类"是指猪科的动物，并且优选是指猪属(Sus属）的动物，例如:野 生猪或家猪、猪（3￥；[]1日）、阐猪化0旨）、野猪、鹿豚化日13；[1'113日)或痛猪(>日1'1110旨）。运也包括设 及它们的性别或年龄的任意名称所指明的猪类诸如:母猪、公猪、阐猪化Og)、小母猪、断奶 猪或仔猪。
[0093] 本发明方法的一种进一步有利的应用是测试已经用CSFV标记疫苗针对CSFV接种 疫苗的猪类动物的样品。
[0094] 如所熟知，并且如上所述，标记疫苗中的抗原在抗原性上不同于作为其基础的野 生型抗原，例如，与野生型版本相比，缺乏表位，或具有不同版本的表位。通常地，标记疫苗 中的抗原已经通过生物化学或重组DNA技术改变或修饰，结果是，针对标记疫苗的修饰抗原 的抗体应答可W与针对未修饰的野生型抗原的抗体应答区分开。运将允许血清学"区分感 染的动物与接种疫苗的动物"或:DIVA。
[00M]因此，在本发明方法的一个实施方案中，测试样品来源于已经用CSFV标记疫苗针 对CSFV接种疫苗的猪类动物。
[0096] 当CSFV(标记）疫苗包含作为CSFV抗原的通过CSFV E2的TAVSP化LR表位中的突变 而不同于野生型E2的CSFV E2蛋白时，本发明方法的一个特别有利的应用变得明显。如上所 述，在用此类疫苗接种疫苗的动物的样品中，当使用现有的CSFV抗体的诊断测试时，发现假 阳性评分。但是，本发明方法仅显示真阳性评分。运对于猪养殖的兽医健康和经济学具有重 大意义。
[0097] 因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，测试样品获自已经用包含CSFV E2蛋 白（包含突变的TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗针对CSFV接种疫苗的猪类动物。
[009引如上所述，原则上，CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的许多形式可W想象用于本 发明方法中的共溫育。但是，在共溫育中采用的CSFV E2的突变的TAVSPT化R表位与标记 CSFV疫苗中的表位相同的情况下，该方法是最有利的。
[0099] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，用于本发明方法中的共溫育中的载体中 包含的CSFV E2的突变的TAVSPT化R表位与CSFV标记疫苗的CSFV E2蛋白中存在的突变的 TAVSPTTLR表位是相同的。
[0100] 进一步考虑适用于CSFV标记疫苗中的CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位:该疫苗必 须仍然能够诱导目标动物中针对CSFV的有效免疫应答，尽管存在TAVSPTTLR表位的突变。
[0101] 对于本发明，在一方面用于对本发明方法中待测试的测试样品来源的动物接种疫 苗的CSFV标记疫苗中的CSFV E2的突变的TAVSPT化R表位和另一方面用于本发明方法中的 共溫育中的载体中包含的CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位之间优选存在匹配。
[0102] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，用于共溫育中的载体中包含的CSFV E2的 突变的TAVSPTTLR表位与用于对获得测试样品的猪类动物接种疫苗的CSFV疫苗的CSFV E2 蛋白中包含的突变的TAVSPTTLR表位是相同的。
[0103] 技术人员完全能够确定哪些突变的TAVSPTTLR表位允许包含含有此类突变表位的 CSFV E2蛋白的CSFV标记疫苗是有效的免疫原。
[0104] 例如通过监测接种疫苗后或攻击感染后的免疫应答，例如通过监测目标的疾病的 临床体征，临床评分，血清学参数，或通过病原体的重新分离，且将运些结果与模拟接种疫 苗的动物中看到的应答进行比较。
[0105] 注：由于CSFV是高度感染性的，并且在许多国家是通报感染病，可能含有感染性 CSFV(无论是野生型或减毒的）的样品的任何实验室或畜牧业用途必须用与国家或国际指 南一致的适当的生物安全预防措施进行。
[0106] 包含可W与用于本发明方法中的共溫育中的包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表 位的载体匹配的具有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗的实例是本领域中 已知的，且如上所述。例如从Kcxrtekaas等人（2010，同上）；一个实例是被称为vFlc-Δ PTal 的突变CSFV,其具有包含氨基酸序列为TAGSTLRTE的突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白， 如表示为沈Q ID NO:2。
[0107] 另一个实例来自Reimann等人（2010,同上）：被称为pA/CP7_EW2alf_TLA的突变 〇5尸￥，其具有包含氨基酸序列为化4^(0化4(如表示为569 10^:3)的突变的了4￥5?1'化尺表 位的CSFV E2蛋白。
[0108] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，用于共溫育中的载体中包含的CSFV E2的 突变的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列:TAGSTLRTE (沈Q ID NO: 2)。
[0109] 在本发明方法的一个可替代实施方案中，用于共溫育中的载体中包含的CSFV E2 的突变的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列:TLANKDTLA (沈Q ID N0:3)。
[0110] 在一个进一步实施方案中，本发明的测试样品来源于已经用如Kortekaas等人 (2011，同上）中所述的CSFV疫苗、诸如基于如上所述的被称为vFlc-APTal的突变CSFV的疫 苗接种疫苗的猪类动物。
[0111] 因此，在本发明方法的一个进一步实施方案中，所述CSFV疫苗基于vFlc-APTal病 〇
[0112] 对于本发明方法中使用所述的载体的两个不同的实施方案是:用于固定化到固相 的包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的载体，和用于共溫育的包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR 表位的载体。运些载体可W具有不同的形式，并且突变型表位和野生型TAVSPTTLR表位的载 体可W是相同或不同的类型；它们也可W是单独的，或者可W是相同的实体，例如一种包含 两种类型的TAVSPTTLR表位的载体。
[0113] 在本发明方法的一个实施方案中，包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体， 或包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体，是蛋白，或者两种载体是蛋白。
[0114] 运些蛋白可W是相同的或不同的。
[0115] 在本发明方法的一个优选实施方案中，包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载 体，或包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体，是CSFV E2蛋白，或者两种载体是CSFV E2蛋白。
[0116] 除了具有野生型或突变的TAVSPTTLR表位W外，CSFV E2蛋白载体的剩余部分也可 W氨基酸序列不同；CSFV E2的几个实例已经描述于文献中，并且它们的序列可W从公共数 据库诸如GenBank?得到。
[0117] 当包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体是CSFV E2蛋白时，运为从测试样 品检测抗CSFV抗体提供了最佳机会。
[011引类似地，当包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体是CSFV E2蛋白时，运为捕 获动物测试样品中可存在且可另外导致假阳性结果的任何交叉反应性抗体提供了最佳机 会。运是因为CSFV E2蛋白将提供最接近于此表位的天然形式的CSFV E2的突变的 TAVSPTTLR表位的3D表示。
[0119] 因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，两种载体都是完整成熟CSFV E2蛋 白。
[0120] 但是，如本领域中已知，C-末端跨膜区，和实际上E2的C末端一半，对于结合抗体不 那么相关（van Rijn等人，1994, J. of Virology, vol. 68, P. 3934;化ang等人， 2010, Virus Res.，vol. 149，p. 183)。因此，在本发明方法的背景下，技术人员将完全 能够开发和优化本发明的检测野生型CSFV抗体的方法，在其中任一载体或无一载体是完整 成熟E2蛋白，而是其部分，条件是（突变的）TAVSPTTLR表位本身仍然存在，其仍然允许很好 检测野生型CSFV抗体，并且很好减少假阳性评分。
[0121] 在本发明方法中使用CSFV蛋白或其部分作为包含CSFV E2的（突变的）TAVSPTTLR 表位的载体可W通过改变共溫育的量和条件来进一步优化。例如，本发明人已在熟知的杆 状病毒表达载体系统中表达具有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白，纯化蛋白，并且使 用重组表达的E2蛋白对于共溫育测定。
[0122] 可W评价表达的E2蛋白的纯度和量，例如通过SDS-凝胶电泳、蛋白染色和通过光 密度测定的定量。一种可替代方法是在E1 i sa中使用结合E2的抗体、通过除了 TAVSPTTLR W 外的另一表位和已知浓度的参考样品进行定量。
[0123] 取决于蛋白的纯度，选择包含（突变的）TAVSPTTLR表位的E2蛋白的量，W获得野生 型CSFV抗体的最佳检测，同时最佳减少假阳性评分。如本文所例举，96孔微量滴定板的每孔 通常地需要小于2 pg E2蛋白。每孔1 yg或甚至0.5 yg的量也是有效的。
[0124] 如上所述，野生型CSFV抗体的现有的商业诊断测试已经基于用于确定它们的特异 性和特异性概况的大量测试数据确立其可靠性。运通过国际认可的标准阳性和阴性参考样 品的集合来维持。在测定和参照样品的运种组合中的置信度是它们的销售授权和它们在用 此类测定测试的动物的政府控制的出口认证中的用途的基础。
[0125] 为了使本发明方法实现用此类确立测定法的参考值和现有测试评分充分整合，可 W进行测试方案的进一步改变。具体地，可W改变测定方案中的溫育条件W在共溫育步骤 中容纳其它组分，其中引入CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位。
[0126] 本发明人已发现，如果不调整所述步骤的溫育条件，本方法发明在减少假阴性评 分中仍然是有功能的，并且是高度有效的；但是，当使用本发明方法测试建立的标准样品 时，然后获得的精确0D评分可W不同于先前那些标准(或高或低）的结果。运是因为加入其 它化合物可能需要将一定体积的液体加入溫育混合物，运可导致溫育缓冲液和其可包括的 组分(诸如盐类、稳定剂、去污剂或阻断剂)的稀释，导致与标准评分的偏差。
[0127] 因此，在一个实施方案中，本发明方法包括改变包括与包含CSFV E2的突变的 TAVSPTTLR表位的载体共溫育的步骤的溫育条件W适应于加入所述载体。
[012引有几种可W进行运种"改变"的方式。最直接的方式是将包含含有CSFV E2的突变 的TAVSPTTLR表位的载体的溶液纳入本发明方法中使用的溫育缓冲液中，由此溫育缓冲液 的浓度与该方法中使用的其最终浓度相比增加。例如，当合并等体积的包含含有CSFV E2的 突变的TAVSPTTLR表位的载体的溶液和溫育缓冲液时，然后可W提供溫育缓冲液作为其最 终使用的2x浓度的储备溶液。也可需要校正包含含有CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载 体的溶液中已经存在的任何盐或缓冲剂。此原则容易适应于其他体积比和相应浓度的溫育 缓冲液储备溶液。
[0129] 可选地，可W提供溫育缓冲液的即用预混合溶液，所述溫育缓冲液已经包含含有 CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体，其中所述溫育缓冲液为其最终使用浓度。
[0130] 前面实例依赖于在溶液中提供包含CSFV E2的突变的TAVSPrrLR表位的载体。但 是，由于运可能对于蛋白的稳定性不是最佳的，替代方案是邻近于最终使用浓度的溫育缓 冲液的容器的冷冻干燥形式的单独容器中提供包含CSFV E2的突变表位的蛋白。当然后在 使用之前不久用溫育缓冲液重构蛋白时，运不影响蛋白的稳定性，并且所述重构不（显著） 改变溫育缓冲液的浓度。
[0131] 技术人员将能够设计和优化其他组合W获得类似溶液。
[0132] 如所描述，应用本发明方法的一种有利方式是通过使用诊断测试试剂盒，其包含 应用所述方法所需的各种组分。
[0133] 因此，本发明的一个进一步方面设及用于实施本发明方法的诊断测试试剂盒。
[0134] 对于本发明，"诊断测试试剂盒"设及用于执行本发明方法的部件试剂盒。所述试 剂盒包含用于执行所述方法的一种或多种组分，具体地：固定化到固相的包含CSFV E2的 TAVSPTTLR表位的载体，和包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体。运些应该W方便形 式和容器中出现，任选具有用于样品稀释和溫育、封闭或洗涂的缓冲液，并且任选具有如何 执行所述方法和如何阅读和解释结果的说明书。
[0135] 在一个实施方案中，所述试剂盒可W包含具有多个孔的容器，诸如微量滴定板。容 器的孔可W经处理W含有用于本发明方法中使用的一种或多种组分。
[0136] 在本发明的诊断测试试剂盒的一个优选实施方案中，将具有TAVSPT化R表位的 CSFV E2蛋白固定化到微量滴定板的孔。
[0137] 本发明的诊断测试试剂盒任选包含的说明书，例如可W写在含有试剂盒的成分的 盒上;可W存在于该盒中的小册子上；或者可W是在试剂盒的经销商等的因特网网站上可 见或可下载。
[0138] 对于本发明，诊断测试试剂盒也可W是所述部件的提供(设及商业销售），例如在 因特网网站上，用于在包含本发明方法的测定法中组合使用。
[0139] 在一个实施方案中，本发明的测试试剂盒可W基于野生型CSFV E2抗体的已知商 业测试试剂盒之一，即，与PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 (Prionics)或IDEXX CSFV Ab Test ? (IDEXX)基本相同，其经修改W适应于与其他组分共溫育。该修改可设及经修改的用户 说明书，W提供共溫育的说明书。此外，所述试剂盒可W额外提供包含冷冻干燥的制备物的 容器，所述冷冻干燥的制备物包含含有CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体，其再悬浮 于例如溫育缓冲液中。可选地，所述测试试剂盒可W包含含有浓度高于其最终使用浓度的 溫育缓冲液的储备溶液的容器，和包含含有载体(其包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位） 的溶液的容器，所述溶液与溫育缓冲液储备溶液一起用于共溫育中。技术人员可设想并入 本发明的诊断测试试剂盒的组分的几个其他实施方案。因此，此类实施方案落入本发明的 范围之内。
[0140] 因此，在一个实施方案中，本发明的检测试剂盒包含容器，所述容器包含含有CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体。
[0141] 在一个进一步方面，本发明设及包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体用于 本发明方法中或本发明的诊断测试试剂盒中的共溫育的用途。
[0142] 此类用途提供了动物测试样品、特别是来自已经用包含CSFV E2蛋白（包含突变的 TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗针对CSFV接种疫苗的动物的样品中的野生型CSFV抗体的检测。 此用途提供了如上所述的任何假阳性评分的减少。
[0143] 在一个实施方案中，本发明的用途设及使用包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位 的载体。所述载体优选为蛋白，所述蛋白优选为CSFV E2蛋白，所述CSFV E2蛋白优选为完整 成熟蛋白。
[0144] 本发明的检测方法的一种进一步有利的应用是其应用于CSFV接种疫苗和检测的 DIVA方法。运允许区分针对CSFV接种疫苗的动物和被CSFV感染的动物。只有用本发明方法， 并且随后消除假阳性分数，该方式的血清学区分是可能的，此时接种疫苗是通过使用包含 含有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的针对CSF的疫苗。
[0145] 因此，在一个进一步方面，本发明设及用于区分被野生型CSFV感染的动物和用 CSFV疫苗（其中所述疫苗包含含有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白）针对CSFV接种疫 苗的动物的方法，并且所述方法包括使用本发明的检测方法，或者包括使用本发明的诊断 测试试剂盒。
[0146] 本发明的区分方法是使用如上所述的动物测试样品的体外诊断方法。技术人员将 意识到，本发明的区分方法因此包括所研究的测试样品的诊断评分中的结果。具体地，CSFV E2蛋白抗体的检测，通过它们的存在或不存在，或它们的绝对值水平，或与对照样品的值相 比的相对值。
[0147] 方法的输入值是来自受试者的测试样品；所述受试者优选为猪类动物;所述测试 样品优选为血液样品，更优选血清或血浆的样品。
[0148] 为了最终区分感染的动物和接种疫苗的动物，测试评分需要被解释为阳性或阴 性;在实践中，运意味着:高于或低于特定阔值。运可W通过向测试中在测试样品旁边并入 许多标准参考样品而方便地进行。运描述于实施例中。阳性和阴性参考样品可W在动物中 制备，或者可W获自几个机构和参考实验室，例如在University of veterinary medicine, Hannover, Germany的CSF的Community Reference Laboratory。
[0149] 将测试样品评分为阳性、阴性或怀疑之后，可W将其外推为将获得测试样品的供 体动物诊断为关于野生型CSFV的感染阳性、阴性或怀疑野生型CSFV的感染。
[0150] 在动物被诊断为阳性(或怀疑）的情况下，然后与管理规则一致，所述动物可W通 过接种疫苗和/或留出检疫而进行治疗，或者W负责任的方式进行扑杀。
[0151] 因此，在本发明的区分方法的一个实施方案中，所述方法还包括选自W下的一个 或多个步骤： -获得测试样品的步骤 -通过与阳性和阴性参考样品的结果比较而解释获得的测试结果的步骤。 -将获得的样品测试结果与预定的截止值比较的步骤， -将样品评分为含有针对野生型CSFV的抗体阳性、阴性或怀疑含有针对野生型CSFV 的抗体的步骤， -将样品供体诊断为野生型CSFV的感染阳性、阴性或怀疑被野生型CSFV感染的步骤， -基于诊断野生型CSFV的感染的阳性或怀疑结果，通过接种疫苗、检疫和/或扑杀而 (推荐)处理样品供体的步骤。
[0152] 在一个或多个优选实施方案中，所述样品是血清样品，或:所述测试结果是化ISA 抑制百分率的评分。
[0153] 在一个优选实施方案中，测试样品来源于已经用包含CSFV E2蛋白（包含突变的 TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗针对CSFV接种疫苗的猪类动物。
[0154] 在一个可替代方面，本发明设及诊断CSFV感染的体外方法，所述方法包括使用本 发明的检测方法，或包括使用本发明的诊断测试试剂盒，并且其中就阳性和阴性参考样品 的评分而言确定针对野生型CSFV的抗体的存在。
[0155] 在本发明的一个进一步方面，本发明的检测方法，或本发明的诊断测试试剂盒，用 于根治CSFV疾病，或者在国家监控计划中，作为与用CSFV疫苗接种疫苗一起的伴侣诊断法。
[0156] 用此组合，可W应用CSFV的DIVA方法，其允许区分感染的动物和接种疫苗的动物。
[0157] 因此，在一个进一步方面，本发明设及通过组合使用包含含有突变的TAVSPTTLR表 位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗和本发明的诊断测试试剂盒而控制猪类动物群体中野生型 CSFV感染的方法。
[0158] 由于本发明提供了假阳性评分的强烈减少，来自接种疫苗的动物的(血清)样品现 在可W可靠地鉴定为针对野生型CSFV的抗体阴性。只有真阳性动物需要被挑出来，并在监 控、扑杀或根治计划的背景下进行适当的控制和检疫措施。
[0159] 因此，运种组合使用CSFV疫苗和诊断方法允许用结构化的基于疫苗的CSFV根治计 划代替不期望且非常昂贵的扑杀政策，从而减少动物痛苦和经济成本。
[0160] "猪类动物群体"可被认为在本地(农场）、区域或者甚至在国家水平的组群。"组合 使用"的细节和方案将取决于为待施用的特定(标记)CSFV疫苗开出的接种疫苗方案。组合 使用的表现还将取决于筛选的要求和理由，或甚至取决于可能需要遵守的特定政府法规。 [0161 ] -些实例:在常规接种疫苗的情况下，猪将在幼龄针对CSFV接种疫苗一次或两次， 并且例如每年接受加强接种疫苗。无论何时怀疑发生野生型CSFV感染，都可W测试运些动 物。可选地:已经接种疫苗的意在用于出口的猪，可W在它们的预期出口日期前不久进行测 试。同样:在怀疑CSFV感染的情况下或在CSFV爆发的情形下，可W在数周、可能甚至数天的 短时间间隔内执行接种疫苗和测试。技术人员可想到的运些和其他实施方案都在本发明的 范围之内。
[0162] 在实践中，当样品被评分为野生型CSFV抗体阳性或阴性时，可W通过重新测试来 自相同目标、但来自不同时间点的样品，或者通过测试来自相同畜群或区域的其他动物来 获得确认。或者，可W使用不同的技术，和不同类型的样品，例如通过经由病毒中和测定检 测血液、组织、鼻拭子或粪便中的病毒，或通过检测病毒核酸(例如通过PCR)来确认结果。
[0163] 本发明现在将通过W下非限制性实施例进一步描述。 实施例
[0164] 实施例1:猪样品的测试: 1.1.测试样品： 实施例1中使用的测试样品从Central VeterinaiT Institute化elystad, the 化therlands)获得，并且在Kodekaas等人，2011(同上）中描述。简而言之：8周龄血清阴 性猪用活CSFV疫苗接种疫苗:基于C-毒株或vFlc-APTal病毒。在数周始终取血液样品。制 备血清用于测试。在接种疫苗后28天，用野生型CSFV攻击感染动物。
[01化]1.2.现有技术ELISA测试： 如Kodekaas等人，2011 (同上)所述，获得的猪血清使用商业化ISA:PrioC肥CK ? CSFV Ab 2.0 (Prionics)进行测试。运根据制备商的说明书进行，简而言之:使用预包被的微量 滴定板，并且分配试剂盒的样品缓冲液。将对照样品加入特定孔中，将测试样品（猪血清)加 入其他中。接着将板溫育，洗涂，并分配缀合物。再次溫育并洗涂板，最后加入显色试剂，溫 育，然后终止。接着通过测量0D读板。基于阳性标准计算化ISA抑制的百分比。结果作为比较 的结果描述于图1中，基本上重复了Kcxrtekaas等人，2011(同上）的图4A。对于此化ISA，正/ 负分离的阔值为40%抑制。
[0166] 从运些结果明显可知：C-毒株接种疫苗的猪的血清样品（虚线），W及用vFlc-Δ PTal病毒标记疫苗接种疫苗的猪的样品（实线），都随着时间推移阳性响应；即，诱导40%或 更多的抑制。因此，在用C-毒株疫苗或用标记CSFV疫苗（即vFlc-APTal病毒)接种疫苗的动 物之间不能进行明确的区分。
[0167] 1.3.现有技术样品的重新测试： 然后使用CSFV E2抗体的不同商业化ISA:IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX)，根据制备 商的说明书和与上述Prionics ELISA基本上相同的方案重新测试Kodekaas等人的运些血 清样品。
[0168] 结果描述于图1B，并且灰色水平条表示在此测定中的正/负分离的阔值，由此：阴 性为30%或更少的抑制；阳性为40%或更多的抑制;30和40%抑制之间的得分是可疑样品。 其中抑制水平为负值的结果表示0D值高于阴性对照的0D值的样品。运些可W被认为是零％ 抑制值。
[0169] 如从图明显可知且与Prionics ELISA中的结果类似，几乎所有样品都随着时间推 移阳性反应；只有一种标记接种疫苗(猪编号3161)保持完全阴性。来自猪编号3163和3164 的两个样品在接种疫苗后42或49天得到尖峰值，运可能与攻击反应相关;样品不能针对材 料缺少进行重新测试。
[0170] 1.4. E2蛋白 从C-毒株的CSFV病毒和vFlc-APTal病毒的E2基因产生E2蛋白，其用于本发明的方法 的共溫育。首先，针对杆状病毒昆虫细胞表达系统中的表达对它们的E2基因的核巧酸序列 进行密码子优化，同时只使用沉默突变。接着，根据优化的序列化学合成DNA并克隆入 pFastBac ?质粒化ife technologies)中的多角体蛋白启动子的后面。通过位点特异性转 位将表达盒转移入重组杆粒DNA，并在DHlOBac感受态大肠杆菌感受态细菌中扩增。接着，分 离杆粒DNA，并用于转染Sf9昆虫细胞。使用从转染上清液获得的重组杆状病毒W感染新鲜 的Sf9昆虫细胞。分离并使用杆状病毒感染W感染在2L生物反应器中培养的Sf21昆虫细胞。 在运些生物反应器培养物中表达两种E2蛋白，主要在上清液中。将其收获，并且在 Sepharose柱上通过亲和柱色谱分离E2蛋白，所述Se地arose柱已经偶联TAVSPTTLR表位特 异性单克隆抗体。从柱收集纯化的E2蛋白，并通过抑制化ISA定量。
[0171] 使用SDS-凝胶电泳，标准表达和纯化的E2蛋白：观察到约80kDa的单一条带，纯度 为约80%。然后在化ISA中邻近于标准样品定量E2。重组表达的具有突变的TAVSPTTLR表位 的CSFV E2蛋白可W常规地获得为约800 pg/ml的纯化的储备溶液。
[0172] 1.5.通过本发明的方法检测 对上述Kodekaas等人，2011 (同上)应用本发明的检测测试样品中的野生型CSFV的抗 体的方法。
[0173] 该方案很大程度上基于IDEXX ELISA的方案，除了共溫育。简而言之：根据制备商 的说明书使用IDEXX CSF Ab测试试剂盒，一个例外是：用2x浓缩的版本替换试剂盒的标准 样品稀释液。然后将25μ1(即，测试试剂盒的方案中规定的体积的一半)的此2X样品稀释液 在Ε2包被的孔中与50μ1血清样品和25 杆状病毒表达的具有突变的TAVSPTTLR表位的 CSFV E2蛋白的溶液共溫育，使得每孔存在约1 pg E2。
[0174] 运些共溫育中使用的具有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白是vFlc-APTal疫 苗病毒中包含的E2。
[0175] 获得的结果描述于图1C中，并且立即例举说明与没有共溫育的相同测定的结果 (图1B);或与没有共溫育的类似测定的结果（图1A)的差别。C-毒株接种疫苗的猪的所有样 品都阳性反应，而标记接种疫苗的猪的所有样品都阴性反应。没有发现加强接种疫苗的效 果，并且甚至对于猪编号3163和3164观察到的尖峰值低于阔值。W此方式，有效的DIVA测试 最终对于活减毒CSFV疫苗是可能的！ 当使用野生型CSFV的E2蛋白用于共培育(运里不介绍）重复此实验时，结果是完全不同 的:所有样品评分为阴性，甚至是C-毒株接种疫苗的猪的样品。因此，运不是有用的替代方 案。
[0176] 还在PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 ELISA (Prionics)的基本方案中引入共溫育。观 察到基本上相同的结果:假阳性结果的非常有效的减少，只留下评分为阳性的真阳性样品 (此处为:高于40%的化ISA抑制）。
[0177] 1.6.来自现有技术样品的重新测试的结果的概述 表1中组装上述实验的结果。运表明，来自Kodekaas 2011 (同上)实验的接种疫苗的动 物将接受的分类，当被测试为CSFV抗体阳性/怀疑具有CSFV抗体时，是不同的，运取决于将 应用哪种检测E2抗体的方法。可W明显看出，仅通过使用与包含CSFV E2的突变的 TAVSPTTLR表位的载体共溫育，用包含突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗接 种疫苗的动物可W与野生型CSFV感染-或C-毒株接种疫苗的动物明确区分。
[0178] 表1:使用不同的检测CSFV E2抗体的方法评分为怀疑具有CSFV抗体或CSFV抗体 阳性的来自Kodekaas 2011实验的动物的数量。
[0179] 实施例2:建立测试特异性和灵敏性 为了确定本发明方法的特异性和灵敏性与标准商业CSFV E2抗体化ISA的特异性和灵 敏性至少相当，使用本发明方法之一测试大量样品（约900份）。样品由collection of the Virology Division, Central Veterinary Institute, Lelystad,荷兰的W丄.Loeffen 博±提供，并且包括一组来自荷兰的超过400份CSFV阴性野外猪血清，一组在几周内取样的 来自实验CSFV感染的猪的超过400份样品，和一组混合来源的约80份猪血清样品；运最后一 组含有来自针对BVDV接种疫苗的猪或被CSFV感染的猪W及被BVDV或抓V毒株感染W及具有 一些混合感染的猪的阳性和阴性血清。
[0180] 对于本发明方法的应用，使用IDEXX CSF Ab测试试剂盒的方案和材料、使用预包 被的板、阳性和阴性对照样品、A18单克隆抗体缀合物、显色反应底物、终止溶液和洗涂溶液 测试所有样品。唯一偏差是在于样品稀释液被替换为该稀释剂的2x浓缩形式，其W根据测 试方案的体积的一半使用；体积的另一半通过加入包含具有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白（即，vFlc-APTal病毒中包含的E2蛋白）的溶液来提供。一式两份测试对照样品，单 次测试测试样品。
[0181] ELISA抑制结果的解释与商业化ISA是相同的：阴性为30%或更少的抑制；阳性为 40%或更多的抑制;30和40%抑制之间的得分是可疑样品。
[0182] 2.1. CSFV阴性野外样品： 阴性野外血清组通常评分为-20至0% ELISA抑制。结果描述于图2中。413份样品的平 均评分为:-11 % ± 5.2 %。运与预期一致:所有样品评分远低于怀疑/阳性的阔值(30% ELISA抑制），并且用于检测的方法和用于区分的方法(均根据本发明）的使用没有从真阴性 样品产生任何假阳性评分。
[0183] 2.2. CSFV阳性实验样品： 随着时间推移采集的一组超过400份CSFV阳性样品的分析证明了本发明方法的灵敏度 是优异的。结果表示于图3中，并且显示特别是在感染后早期，本发明方法提供运样的结果， 与商业CSFV E2抗体化ISA相比，其允许更多样品被归类为阳性，更少的样品被归类为怀疑 或阴性。运在感染后14天最突出，并且在感染后21天还有点如此。
[0184] 因此，运证明了本发明方法在正确地检测真阳性中的灵敏度至少与商业CSFV E2 抗体化ISA的灵敏度一样好，或者相反不同放置:将共溫育引入现有的CSFV E2抗体化ISA的 一个步骤没有损害测试的灵敏度。
[01化]2.3.混合样品： 使用本发明方法测试一组各种类型的约80份样品，W便将结果与来自标准商业化ISA 的结果进行比较。各种样品来自被称为'Erns workshop'、乂SFV抓参考实验对象组'和CVI Lelystad内部'攝病毒参考实验对象组'的实验对象组。
[0186]样品和它们的代码与来自使用本发明方法(在列中表示为'本发明'）或使用商业 CSFV E2抗体化ISA(在列中表示为'商业'）的检测抗CSFV E2抗体的结果一起列于表2中。具 有样品编号的列仅用于参考目的:样品1 - 54是来自被CSFV的不同毒株感染或针对CSFV接 种疫苗的动物的野外样品的血清;样品在不同的感染后天数(dpi)或接种疫苗后天数(dpv) 采集;样品55-60是真阴性;样品编号61 -67是来自BVDV感染的血清;样品68来自抓V感染;且 样品69-76来自混合感染。
[0187] 结果表示为百分比化ISA抑制评分，并且根据商业化ISA的评分表进行分类。
[0188] 如从表2中的结果明显可知，对于测试的绝大多数样品，使用本发明方法获得的结 果得到化ISA抑制百分率的评分，具有比商业化ISA更高区分度。在只有两种情况下，与商业 ELISA相比，使用本发明方法的结果W阴性方式偏离:样品23和75。不知道运些是否是测试 表现中的误差。因此，对于CSFV E2抗体，本发明方法至少与商业化ISA-样灵敏。
[0189] 运可W具有明显的后果，因为对于几种样品，商业化ISA和本发明方法产生了不同 的分类。实例是：样品编号8、25、28、38和45，运被商业化154归类为'怀疑'具有〔5。￥62抗 体，但本发明方法将需要归类为CSFV E2抗体'阳性的'。类似地，样品编号37将需要分类从 阴性变为怀疑。
[0190] 对于只有两种样品，编号23和75,本发明方法的结果是阴性的，而商业E2抗体 ELISA的评分是阳性的。在任一测定中的实验误差可能是原因。
[0191] 表2:混合样品集合中CSFV E2抗体的检测结果，其表示为化ISA抑制百分比。
[0192]
【附图说明】 图1: 通过Kodekaas等人，2011(同上)描述的样品中的CSFV E2抗体的阻断化ISA的分析结 果:比较的是通过标准商业测定的分析和通过本发明方法的分析。
[0193] 虚线表示来自用C-毒株CSFV疫苗接种疫苗的猪的样品（'CS'样品）的结果;实线表 示来自用基于vFlc-APTal病毒的标记疫苗接种疫苗的猪的样品（'VS'样品）的结果。
[0194] 水平灰色条表明不同测定中的阔值评分，将样品解释为野生型CSFV E2抗体阳性， 怀疑含有野生型CSFV E2抗体，或野生型CSFV E2抗体阴性。
[0195] 图1 A:比较结果：再现Kortekaas等人，2011(同上）的图4 A。使用的E2 ELISA是 PrioCHECK? CSFV Ab 2.0 (Prionics)〇
[0196] 图 1 B:使用不同的商业E2 ELISA，IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX)重新测试 Kortekaas等人，2011 (同上）的样品的结果。
[0197] 图1 C:使用本发明的检测方法(将共溫育引入IDEXX CSFV Ab测试的一个步骤中） 重新测试Kortekaas等人，2011 (同上）的样品的结果。
[019引图2: 来自超过400份阴性野外样品中的CSFV抗体的分析的结果。根据IDEXX CSFV Ab测试? (IDEXX)、修改为在本发明方法中引入共溫育的方案，进行测试。结果表示为每微量滴定板 检测到的化ISA抑制百分比的平均值，对于所有样品合并结果，并且将所有板合并为一。最 高值和最低值由黑色菱形表示，通过黑条连接，并且平均值通过灰色菱形表示。
[0199]图3: 来自被CSFV实验感染的猪且在接种后2、3或4周取样的超过400份样品的分析结果。不 是每个动物都有Ξ份样品。检测方法是本发明方法，表示为'Inv.'；或者是商业化ISA (IDEXX CSFV Ab检测），表示为'Comm. '。分类：阴性、怀疑和阳性基于测量的百分比化ISA抑 审IJ，并且分别根据商业化ISA的评分表指定为低于30%、30-40%或超过40% ELISA抑制。
【主权项】
1. 用于检测测试样品中针对野生型典型猪瘟病毒(CSFV)的抗体的方法，其中所述样品 还可以包含针对CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的抗体，所述方法包括将所述测试样品与 包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化载体温育的步骤，其特征在于所述方法包括在所述 步骤中与包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体共温育。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测通过ELISA(酶联免疫吸附测定法）。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述测试样品获自已经用CSFV疫苗针对CSF接 种疫苗的猪类动物，所述CSFV疫苗包含含有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于共温育中的载体中包含的CSFV E2 的突变的TAVSPTTLR表位与用于对获得所述测试样品的猪类动物接种疫苗的CSFV疫苗的 CSFV E2蛋白中包含的突变的TAVSPTTLR表位是相同的。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中用于共温育中的载体中包含的CSFV E2 的突变的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列：TAGSTLRTE(SEQ ID N0:2)。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述CSFV疫苗基于vFlc- △ PTal病毒。7. 根据权利要求1 -6中任一项所述的方法，其中包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定 化载体，或包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体，是CSFV E2蛋白，或者两种载体都 是CSFV E2蛋白。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其包括改变包括与包含CSFV E2的突变的 TAVSPTTLR表位的载体共温育的步骤的温育条件以适应于加入所述载体。9. 诊断检测试剂盒，其用于执行根据权利要求1-8中任一项所述的方法。10. 包含CSFV E2的突变的TAVSPTTLR表位的载体用于根据权利要求1-8中任一项所述 的方法中的共温育或根据权利要求9所述的诊断检测试剂盒中的用途。11. 用于区分被野生型CSFV感染的动物和用CSFV疫苗针对CSFV接种疫苗的动物的方 法，其中所述疫苗包含含有突变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白，并且所述方法包括使用 根据权利要求1-8中任一项所述的方法的检测方法，或者包括使用根据权利要求9所述的诊 断测试试剂盒。12. 用于控制猪类动物群体中野生型CSFV的感染的方法，其通过组合使用包含含有突 变的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗和根据权利要求9所述的诊断测试试剂盒而 实现。
【文档编号】G01N33/569GK105829892SQ201480069404
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】U.P.布鲁德雷
【申请人】英特维特国际股份有限公司