利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，所述方法包括菌体蛋白的提取、第一向IPG等点聚焦电泳、SDS?PAGE凝胶电泳、凝胶扫描和图像分析等步骤。运用本方法能获得蛋白质清晰、背景清楚的双向电泳凝胶图谱，能够明确得鉴定出产琥珀酸放线杆菌中是否存在β?葡萄糖苷酶，从而解析产琥珀酸放线杆菌在二糖利用过程中的糖转运和降解机制，对于后续利用产琥珀酸放线杆菌工业化生产丁二酸的过程十分有利，尤其对于碳源优化、发酵过程控制、降低成本有重要的意义。
【专利说明】
利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法。
【背景技术】
[0002]丁二酸作为一种四碳化合物，在工业上具有重要的用途，它可作为有机合成的原材料、中间产物或专用化学品广泛应用于食品、香料、医药、油漆、塑料、材料等产业。生物法生产丁二酸具有许多优点，因此受到了国内外的广泛关注。目前，利用产琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸是国内外研究的热点之一。产琥珀酸放线杆菌能利用多种糖类，包括一些二糖(例如纤维二糖)。研究表明，该菌株具有较强的利用纤维二糖发酵生产丁二酸的能力(Min Jiang, Rong Xu, Yong-Lan Xi, et al.Succinic acid product1n fromcellob1se by Actinobacillus succinogenes.B1resource Technology, 2013, 135
(5):469-474.)。该菌是如何摄入并降解利用纤维二糖的，纤维二糖是直接以二糖的形式进入细胞代谢网络还是细胞将纤维二糖降解为两分子的葡萄糖之后再被细胞降解利用，解析这一问题对于研究产琥珀酸放线杆菌能利用多种碳源的机制有重要的意义。纤维二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下，可被降解为两分子葡萄糖。本专利旨在利用双向电泳技术来检测产琥珀酸放线杆菌糖转运机制中是否存在β-葡萄糖苷酶，从而更好地解析产琥珀酸放线杆菌在二糖利用过程中的糖转运和降解机制。
【发明内容】
[0003]利用酶活法测定菌体中是否存在某种酶对酶本身的活力和含量要求较高，特别对于一些含量比较低的蛋白，利用酶活测定法无法准确获知酶在该菌体中是否存在。本发明的目的在于提供一种利用双向电泳技术来检测产琥珀酸放线杆菌中葡萄糖苷酶的方法。
本发明所述的利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中葡萄糖苷酶的方法通过以下技术方案实现:
一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，包括以下步骤:
步骤I)培养产琥珀酸放线杆菌，提取菌体蛋白；
步骤2)采用IPG固相胶条，水化上样，进行等点聚焦，等电聚焦完成后平衡胶条；
步骤3)转移步骤2)平衡后的胶条至SDS-PAGE凝胶上进行电泳；
步骤4)将所得凝胶染色脱色后，扫描并分析图像。
[0004]具体地，所述步骤I)中产琥泊酸放线杆菌为产琥泊酸放线杆菌(Actinobac Hlussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培养产琥珀酸放线杆菌方法如下:将冻存于_70°C冰箱的菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37°C厌氧培养箱中活化培养24 h;活化培养后的菌种转接到种子培养基中，充⑶2 2?3min，培养温度35?37 °C，培养时间10?12h;将活化好的种子液接入发酵罐中，接种量为体积比3?10%，温度为35?40 °C，始终通入C02气体来保持厌氧环境，纤维二糖作为碳源，整个发酵过程中PH控制在6.5-7.0,搅拌速度为100?300 rpm，发酵30?40 h。
[0005]具体地，所述步骤I)提取菌体蛋白的具体方法为:菌体以纤维二糖作为唯一碳源发酵12?16h后，取发酵液，离心去除上清获得菌体沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品。利用clean-up试剂盒对该总蛋白样品进行纯化，试剂盒纯化能去除蛋白样品溶液中的杂质，有利于获得理想的电泳图谱。
具体地，所述步骤2)具体为:将步骤I)提取的菌体蛋白与水化液混合成上样液，加有已知酶的菌体蛋白与水化液混合成上样液作为对照，水化上样，泡涨IPG固相胶条，然后转移至胶条槽中，进行等点聚焦，等点聚焦结束后将胶条依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡条件为摇床转速40rpm下平衡15min;
其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG缓冲液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚蓝；
所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/胶条；
所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/胶条；
所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚蓝，29.3%甘油。具体地，所述的酶为葡萄糖苷酶;所述上样液体积为450HL，上样液含有菌体蛋白I?2mg，泡涨时间10?12h，所述IPG固相胶条为24cm的线性的固相干胶条pH3_10，等点聚焦过程参数设置如下:30V运行10h，500V运行lh，1000V运行lh，1000V电压2小时内梯度升高至10000V，10000 V运行7?8h，1000V运行2?3h，上限电流为50μΑ/胶条，温度为20 °C。
[0006]具体地，所述步骤3)中SDS-PAGE凝胶电泳中胶浓度为12.5%，电泳条件为3W/胶条4?5h，10-13W/胶条，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时停止电泳。
[0007]具体地，所述步骤4)采用考马斯亮蓝染色;分析图像具体方法为:将菌体蛋白样品和加有已知酶的菌体蛋白样品分别获得的凝胶图像进行比对，找出差异的蛋白点。
[0008]本发明所使用的菌株产琥?白酸放线杆菌(Ac t inobac illus succ inogenes )NJ 113的来源:在中国专利局或国际专利组织承认的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了专利程序保藏(保藏编号:CGMCC N0.1716)的，并在本申请日之前已授权(专利号200610085415.9，授权公告日2009年9月9日，授权公告号CN100537744 C)的生物材料。
[0009]本发明的有益效果在于:本发明所述方法提供了一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中葡萄糖苷酶的方法，本方法易操作，实验结果分析简便，而传统的利用酶活法测定菌体中酶的方法对操作的要求高，整个操作必须保证酶的活性，而且对酶量的要求比较高，微量的酶通过酶活法很难检测，而对于细胞膜上的酶的提取往往损失较为严重，很难获得活性比较好的酶。本方法弥补了上述所有的缺陷，可以作为检测产琥珀酸放线杆菌中酶的有效手段。
【附图说明】
[0010]图1是采用24cm的线性的IPG固相干胶条ΡΗ3-10的双向电泳凝胶考染图，蛋白样品为产琥珀酸放线杆菌蛋白提取液。
[0011]图2是采用24cm的线性的IPG固相干胶条pH3_lO的双向电泳凝胶考染图，蛋白样品为加有β-葡萄糖苷酶的产琥珀酸放线杆菌蛋白提取液。
【具体实施方式】
[0012]下面结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术人员所熟知的常规手段或者按照制造厂商所建议的条件。
[0013]本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均可通过通过商业化渠道购得。
[0014]实施例1
本发明所使用的菌株产琥泊酸放线杆菌(Ac t inobac ? I Ius succinogenes )NJ113的来源:在中国专利局或国际专利组织承认的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了专利程序保藏(保藏编号:CGMCC N0.1716)的，并在本申请日之前已授权(专利号200610085415.9，授权公告日2009年9月9日，授权公告号0肌00537744 C)的生物材料。
[0015]活化菌种:将冻存于-70 °C冰箱的产琥珀酸放线杆菌(Ac ZinokcH/mssucc inogenes )NJ113菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37 C厌氧培养箱中活化培养24 h0
[00? 6] 种子培养:将产琥I自酸放线杆菌(Ac / i I Ius succ inogenes )NJ113接种至种子培养基中，10mL血清瓶装液量50mL，充⑶2 2?3min，培养温度35?37°C，培养时间10?12h0
[0017]发酵培养菌体:将种子液接种到发酵培养基中，接种量为体积比3?10%，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，纤维二糖作为碳源，整个发酵过程中pH控制在6.5-7.0,发酵温度35?37°C，搅拌速度为100~300 rpm，发酵30?40 h。
[0018]上述的种子培养基和发酵培养基应理解为现有技术中任何可以被产琥珀酸放线杆菌利用的培养基成分。在本发明的实施例中，所述种子培养基组分为:葡萄糖10?20g/L，酵母膏 5 ?10 g/L，NaH2PO4.2H20 9.6 ?15.5g/L，K2HP04.3Η20 15.5 ?21.4 g/L，NaHCO3 10?18 g/L，玉米浆 5?10 g/L,pH 6.0?8.0。
[0019]所述发酵培养基组分为:纤维二糖40 g/L，乙酸钠1.36?2.8 g/L,NaCl I?2.2g/L，CaCl2 0.2?0.4 g/L，MgCl2 0.2?0.5 g/L,Na2HPO4 0.31 ?0.65 g/L,NaH2PO4 1.6 —3.5 g/L,K2HPO4 3?6.1 8/1，酵母膏10?2(^/1，？册.0~8.0。
[0020]提取菌体蛋白:菌体以纤维二糖作为唯一碳源发酵12?16h后，取发酵液，离心去除上清获得菌体沉淀，加入预冷的含有20mmol/LDTT的10%TCA丙酮溶液混匀后置于-20°C中过夜，离心去上清，风干沉淀，向沉淀中加入双向电泳裂解液(7M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mM DTT)，室温下浸提2h，离心取上清，即制得产琥I自酸放线杆菌(Act inobac Hlussucc inogenes )NJ113的总蛋白样品溶液。用c I ean_up试剂盒(从GE公司购得)纯化，试剂盒纯化能去除蛋白样品溶液中的杂质，有利于获得理想的电泳图谱。
[0021 ]蛋白质定量:用Bradford法测定蛋白质含量。
[0022]水化上样:将提取的菌体蛋白2mg与水化液(2%CHAPS，0.5%IPG缓冲液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚蓝)混合成上样液450UL，水化上样，泡涨IPG固相胶条12h，IPG固相胶条为24cm的线性的固相干胶条pH3-10，设有三个平行胶条，平行样之间的实验条件完全一致。
[0023]等电聚焦:将泡涨好的胶条转移至胶条槽中，进行等点聚焦，等点聚焦过程参数设置如下:30V运行10h，500V运行lh，1000V运行lh，1000V电压2小时内梯度升高至10000V，10000 V运行7?8h，1000V运行2?3h，上限电流为50μΑ/胶条，温度为20 0C。
[0024]胶条平衡:等点聚焦结束后将胶条依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡条件为摇床转速40rpm下平衡15min。所述平衡液1:SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/胶条；所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/胶条;所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M 尿素，2%SDS，0.002% 溴酚蓝，29.3% 甘油。
SDS-PAGE凝胶电泳:使用垂直电泳，胶浓度为12.5%，将平衡后的胶条转移至SDS-PAGE凝胶的上端，用琼脂糖封顶。电泳的条件为3W/胶条4?5h，10-13W/胶条，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时停止电泳。
[0025]考马斯亮蓝染色:将跑完的凝胶放于考马斯亮蓝R-250染色液(Ig考马斯亮蓝R-250粉末溶于300mL乙醇、10mL乙酸和600mL水的混合溶液中)中，震荡染色过夜，将胶条转移至脱色液[40%(v/v)乙醇、20%(v/v乙酸)，40%(v/v)超纯水]中，震荡脱色，直至凝胶背景透明。
[0026]凝胶扫描和图像分析:将脱色过的凝胶置于扫描仪上扫描，保存图片，如图1所示。平行之间的凝胶图片重复性比较高，没有蛋白点丢失，本实施例证明采用上述电泳实验可以获得菌体的蛋白质图谱。
[0027]实施例2
取实施例1提取的菌体蛋白2mg，加入β-葡萄糖苷酶(从Fluka公司购买)0.1mg，与水化液混合上样，其他条件同实施例1。
[0028]凝胶图片如图2所示。将图1与图2进行差异分析，图2中方框标出的点为β-葡萄糖苷酶，图1中此位置没有出现蛋白点，结果证明产琥珀酸放线杆菌中不含β-葡萄糖苷酶，这对于研究产琥珀酸放线杆菌二糖代谢机理有很大的帮助。
【主权项】
1.一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)培养产琥珀酸放线杆菌，提取菌体蛋白； 步骤2)采用IPG固相胶条，水化上样，进行等点聚焦，等电聚焦完成后平衡胶条； 步骤3)转移步骤2)平衡后的胶条至SDS-PAGE凝胶上进行电泳； 步骤4)将所得凝胶染色脱色后，扫描并分析图像。2.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤I)中产琥?自酸放线杆菌为产琥?自酸放线杆菌(Act inobaci I Iussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培养产琥珀酸放线杆菌方法如下:将冻存于_70°C冰箱的菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37 °(:厌氧培养箱中活化培养24 h;活化培养后的菌种转接到种子培养基中，充⑶2 2?3min，培养温度35?37 °C，培养时间10?12h;将活化好的种子液接入发酵罐中，接种量为体积比3?10%，温度为35?40 °C，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，纤维二糖作为碳源，整个发酵过程中PH控制在6.5-7.0,搅拌速度为100?300 rpm，发酵30?40 h。3.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤I)提取菌体蛋白的具体方法为:菌体以纤维二糖作为唯一碳源发酵12?16h后，取发酵液，离心去除上清获得菌体沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品，利用clean-up试剂盒对该总蛋白样品进行纯化。4.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为:将步骤I)提取的菌体蛋白与水化液混合成上样液，加有已知酶的菌体蛋白与水化液混合成上样液作为对照，水化上样，泡涨IPG固相胶条，然后转移至胶条槽中，进行等点聚焦，等点聚焦结束后将胶条依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡条件为摇床转速40rpm下平衡15min; 其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG缓冲液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚蓝； 所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/胶条； 所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/胶条； 所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚蓝，29.3%甘油。5.根据权利要求4所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述的酶为β-葡萄糖苷酶。6.根据权利要求4所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述上样液体积为450yL，上样液含有菌体蛋白I?2mg，泡涨时间10?12h，所述IPG固相胶条为24cm的线性的固相干胶条pH3-10，等点聚焦过程参数设置如下:30V运行10h，500V运行lh，1000V运行lh，1000V电压2小时内梯度升高至10000V，10000 V运行7?8h，100V运行2?3h，上限电流为50μΑ/胶条，温度为20 °C。7.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤3)中SDS-PAGE凝胶电泳中胶浓度为12.5%，电泳条件为3W/胶条4?5h，10-13W/胶条，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时停止电泳。8.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤4)采用考马斯亮蓝染色。9.根据权利要求1所述的一种利用双向电泳技术检测产琥珀酸放线杆菌中酶的方法，其特征在于，所述步骤4)中分析图像具体方法为:将菌体蛋白样品和加有已知酶的菌体蛋白样品分别获得的凝胶图像进行比对，找出差异的蛋白点。
【文档编号】G01N21/84GK105891303SQ201610305977
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】徐蓉, 徐为民, 徐世伟, 孙雨茜, 徐寸发, 周昊
【申请人】江苏省农业科学院