抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法及检测抗氧化剂及防腐剂的方法
【专利摘要】本发明提供了抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法及检测抗氧化剂及防腐剂的方法，包括：分别配制抗氧化剂与防腐剂的单标甲醇溶液，在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下与负离子全扫描模式下进行质谱分析建立高分辨质谱数据库；将待测样品用醇溶液提取，进行质谱分析，根据质谱数据与高分辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。与现有技术相比，本发明采用高分辨质谱与靶标分析策略对抗氧化剂及防腐剂进行检测，其不需要复杂的前处理步骤，即可对多种抗氧化剂和防腐剂同时进行快速定性检测；更进一步采用液相色谱与高分辨质谱联用不仅准确性高、灵敏度高，还可对筛查出的未知抗氧化剂及防腐剂进行定性判定，扩大了分析监测范围。
【专利说明】
抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法及检测抗氧 化剂及防腐剂的方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学检测技术领域，尤其涉及抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的 建立方法及检测抗氧化剂及防腐剂的方法。
【背景技术】
[0002] 2014年版我国食品安全国家标准GB 2760《食品添加剂的使用》与2011年版比较， 抗氧化剂名单增加了茶多酚棕榈酸酯达27种，防腐剂名单中删去了 4-苯基苯酚、2-苯基苯 酚钠盐、乙萘酚和仲丁胺，增加了 聚赖氨酸及盐酸盐、溶菌酶，两版共计30种防腐剂。面对 如此多的添加剂，如何快速筛查多种添加剂信息，一直是安全和监管领域的热点。
[0003] 烟草控制的进行使烟草消费发生着新的变化，非燃烧类烟草制品，如无烟烟草制 品、新型烟草制品的销售出现增长，而《烟草控制框架公约》的实施方案中，则建议对烟草中 添加剂的使用进行限制或禁止，但目前对无烟烟草中添加剂使用情况研究较少。上述我国 国家标准中的添加剂，如防腐剂和抗氧化剂等的使用情况，值得关注，开发快速准确的筛查 方法是对添加剂安全进行有效监管的前提。
[0004] 关于防腐剂和抗氧化剂的分析研究很多，如采用全二维气相色谱/飞行时间质谱 法筛查食品中的防腐剂和抗氧化剂，使用Rtx-5弱极性柱串联Rtx-17极性柱正交分离组分， 测定了 32种目标物;超高效液相色谱-串联质谱法测定调味品中的防腐剂和抗氧化剂，固相 萃取净化前处理后，电喷雾四极杆质谱负离子模式下进行多反应监测(MRM)分析，定量测定 了 17种目标物。GC XGC方法分辨率高、峰容量大，但数据处理较为繁琐，用于超过100种组分 复杂基质分析具有突出优势，但对于快速筛查稍显不便;QqQ(MRM)灵敏度存在一定优势，但 在选择性与分析物数量方面不如高分辨质谱。HPLC/T0F-MS祀标分析(Target analysis)在 医药、食品、化妆品等诸多领域应用广泛。关于植物油中抗氧化剂和防腐剂的分析，方法采 用反相C18柱，负离子模式下定量分析了 11种目标物，但对于高分辨质谱筛查目标物的影响 因素没有进一步探讨。
[0005] 并且，目前通用的一级质谱数据库较多，但可公开获得的二级谱数据库极少，特别 是用于某些特定分析监测范围时，若建立了相应二级质谱数据库，可对分析目标物的结果 进行确证。已知目标物靶标分析中，可在许多化学物质结构数据库中搜库获取化合物名称、 分子式及结构等信息，如^^0^]?、〇161113?1(16匕0^81等，但二级谱数据信息仅在]\^338八疆 中有较少内容。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据 库的建立方法及检测抗氧化剂及防腐剂的方法，该方法前处理简单、快速准确、灵敏度高。
[0007] 本发明提供了一种检测抗氧化剂及防腐剂的方法，包括：
[0008] S1)配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0009] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0010] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0011] 配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0012] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0013] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0014] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据；
[0015] S2)将待测样品用醇溶液提取，得到提取液；
[0016] 将所述提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分析，得到提取液的 第--级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据；
[0017] 将所述提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，得到提取液 的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0018] 根据提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一二级高分辨质谱数据、提 取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱数据与步骤S1)中的高分 辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。
[0019] 优选的，所述步骤S1)具体为：
[0020] 配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0021] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到抗氧化剂的液相色谱数 据；
[0022] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0023] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0024] 配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0025] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到防腐剂的液相色谱数据；
[0026] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0027] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0028] 建立高分辨质谱数据库，所述质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨质谱数 据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗氧化剂 的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二级高分 辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数据。
[0029] 优选的，所述步骤S2)具体为：
[0030] 将待测样品用醇溶液提取，得到提取液；
[0031 ]将所述提取液先进行液相色谱分析，得到提取液的液相色谱数据；
[0032]将经过液相色谱分析的提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分 析，得到提取液的第一一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据；
[0033] 将经过液相色谱分析的提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，得到提取液的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0034] 根据提取液的液相色谱数据、提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一 二级高分辨质谱数据、提取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱 数据与步骤S1)中的高分辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。
[0035] 优选的，所述液相色谱分析的流动相A为甲酸水，流动相B为甲醇与甲酸的混合液， 70 %的流动相B等度洗脱。
[0036]优选的，所述正离子全扫描模式的质谱条件为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压 3000~4000V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150°C~200°C;干燥气流速2~101/min;质量扫 描范围m/z 50~lOOOamu;六级杆射频电压150 ? 0~300 ? OVpp ;碰撞池射频电压500 ? 0~ 800.0Vpp〇
[0037]优选的，所述负离子全扫描模式的质谱条件为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压 2500~3500V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150°C~200°C;干燥气流速2~101/min;质量扫 描范围m/z 50~lOOOamu;四级杆离子能量2.0~6. OeV;碰撞池射能量5.0~10.0 eV;碰撞池 射频电压500.0~800.0 Vpp;传输时间80.0~120.0 ys;预聚焦频率3.0~7. Oys。
[0038]优选的，所述步骤S1)中一级高分辨质谱数据与二级高分辨质谱数据的精确质量 数误差小于等于2mDa，同位素峰形偏差小于等于20。
[0039]优选的，所述抗氧化剂及防腐剂为噻苯咪唑、乙氧基喹啉、甘草酸、对香豆酸、没食 子酸丙酯、纳他霉素、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸庚酯、对 苯基苯酚、对羟基苯甲酸苄酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-己基间苯二酚、 2,4-D酸、对羟基苯甲酸正辛酯、阿魏酸、叔丁基对苯二酚、3,3_二硫代二丙酸二月桂基酯、 迷迭香酸与抗坏血酸。
[0040] 优选的，所述待测样品为无烟烟草。
[0041] 本发明还提供了一种抗氧化剂或防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法，包括： [0042]配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0043]将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0044] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0045] 配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0046] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0047] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二高分辨级质谱数据；
[0048] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据。
[0049] 本发明提供了抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法及检测抗氧化剂 及防腐剂的方法，包括:S1)配制抗氧化剂的单标甲醇溶液;将所述抗氧化剂的单标甲醇溶 液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨 质谱数据和第一二级高分辨质谱数据;将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪 负离子全扫描模式下进行质谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级 高分辨质谱数据;配制防腐剂的单标甲醇溶液;将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间 质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一 二级高分辨质谱数据;将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式 下进行质谱分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据;建 立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨质谱数据、 抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗氧化剂的 第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二级高分辨 质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数据;S2)将 待测样品用醇溶液提取，得到提取液;将所述提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式 进行质谱分析，得到提取液的第一一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据;将所 述提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，得到提取液的第二一级高 分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据;根据提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取 液的第一二级高分辨质谱数据、提取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高 分辨质谱数据与步骤S1)中的高分辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。与 现有技术相比，本发明采用高分辨质谱与靶标分析策略对抗氧化剂及防腐剂进行检测，其 不需要复杂的前处理步骤，即可对多种抗氧化剂和防腐剂同时进行快速定性检测；更进一 步采用液相色谱与高分辨质谱联用的检测方法不仅准确性高、灵敏度高，还可对筛查出的 未知抗氧化剂及防腐剂进行定性判定，扩大了分析监测的范围。
【附图说明】
[0050] 图1为本发明飞行时间质谱仪采用直接质谱进样时阀联接方式示意图；
[0051] 图2为本发明实施例1中自建数据库的一级高分辨质谱数据库示例图；
[0052]图3为本发明实施例1中自建数据库的二级高分辨质谱数据库示例图；
[0053]图4为本发明实施例2中Auto MS/MS模式下得到未知物的二级质谱图。
【具体实施方式】
[0054]下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。
[0055]本发明提供了一种抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法，包括：
[0056]配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0057] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0058] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0059]配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0060] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0061] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0062] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据。
[0063]其中，所述抗氧化剂及防腐剂优选为噻苯咪唑、乙氧基喹啉、甘草酸、对香豆酸、没 食子酸丙酯、纳他霉素、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸庚酯、 对苯基苯酚、对羟基苯甲酸苄酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-己基间苯二 酚、2,4-D酸、对羟基苯甲酸正辛酯、阿魏酸、叔丁基对苯二酚、3,3_二硫代二丙酸二月桂基 酯、迷迭香酸与抗坏血酸，其英文名称及分子式见表1。
[0064]表1抗氧化剂及防腐剂的名称及分子式
[0067]本发明优选按照以下方法配制抗氧化剂的单标甲醇溶液:分别称取7.5~10.0 mg 抗氧化剂的标准品，用甲醇定容至25ml容量瓶中，配制成0.3~0.4mg/ml的单标溶液;再分 别移取25~35yl的单标溶液，用甲醇定容至10ml容量瓶中，配制成1. Oμg/ml的单标甲醇溶 液。
[0068] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0069] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0070] 本发明抗氧化剂单标甲醇溶液采用直接质谱进样，此时阀联接方式如图1所示，抗 氧化剂及防腐剂的单标甲醇溶液从质谱雾化腔进样口转到联接P〇rt5，断开port3的HPLC联 接，将单标甲醇溶液从雾化腔进样口通过针栗引入;所述针栗的流速优选设为1〇〇~200yl/ h，更优选为150~200yl/h，再优选为160~190yl/h，最优选为180yl/h。
[0071] 其中，所述飞行时间质谱仪正离子全扫描模式的质谱条件优选为：电喷雾ESI离子 源；毛细管电压3000~4000V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150°C~200°C;干燥气流速2~ 101/min;质量扫描范围m/z 50~lOOOamu;六级杆射频电压150.0~300.0 Vpp;碰撞池射频 电压500.0~800.0 Vpp;更优选为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压3500V;雾化气1.5Bar;干 燥气温度180°C;干燥气流速6.01/min;质量扫描范围m/z 50~lOOOamu;六级杆射频电压 200.0 Vpp;碰撞池射频电压600.0 Vpp。
[0072] 所述飞行时间质谱仪负离子全扫描模式的质谱条件优选为：电喷雾ESI离子源;毛 细管电压2500~3500V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150°C~200°C;干燥气流速2~101/ min;质量扫描范围m/z 50~lOOOamu;四级杆离子能量2.0~6 . OeV;碰撞池射能量5.0~ 10 ? OeV;碰撞池射频电压500 ? 0~800 ? OVpp;传输时间80 ? 0~120 ? Oys;预聚焦频率3 ? 0~7 ? 0 ys。；更优选为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压3000V;雾化气1.5Bar;干燥气温度180°C;干 燥气流速6.01/min;质量扫描范围m/z 50~lOOOamu;四级杆离子能量4.OeV;碰撞池射能量 7. OeV;碰撞池射频电压600.0 Vpp;传输时间100.0 ys;预聚焦频率5. Oys。
[0073] 为消除溶剂对质谱数据的影响，优选在正离子全扫描模式及负离子全扫描模式下 均采用甲醇钠溶液校正质谱仪。所述甲醇钠的浓度优选为1~50mmol/L，更优选为5~ 30mmol/L，再优选为 10~20mmol/L，最优选为 10mmol/L。
[0074]采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据，优选精确 质量数误差小于等于2mDa，同位素峰形偏差小于等于20;采集抗氧化剂的第二一级高分辨 质谱数据与第二二级高分辨质谱数据，优选精确质量数误差小于等于2mDa，同位素峰形偏 差小于等于20。
[0075] 配制防腐剂的单标甲醇溶液;所述配制方法与抗氧化剂的单标甲醇溶液的配制方 法相同，在此不再赘述。
[0076] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据;将所述防腐剂 的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，采集防腐剂的第二 一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据;所述飞行时间质谱仪正离子全扫描模式 与负离子全扫描模式均同上所述，在此不再赘述。
[0077] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据。本发明优选将抗氧化剂及防腐剂的一级高分辨质谱数据与二级高分辨质谱数据导入 Library Editor软件，建立抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库。
[0078] 本发明中所述高分辨质谱数据库优选包括抗氧化剂及防腐剂的名称、CAS号、化学 式、化学结构、分子量、一级质谱数据、二级质谱数据、目标物碰撞能、特征碎片离子的精确 质量数及精度。
[0079] 本发明建立的抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库可提供抗氧化剂及防腐剂的 化合物基本信息、一级质谱数据的参数与二级质谱数据的参数。
[0080] 本发明还提供了一种利用上述抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库检测抗氧化 剂及防腐剂的方法，包括：
[0081 ] S1)配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0082] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0083] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0084] 配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0085] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0086] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0087] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据；
[0088] S2)将待测样品用醇溶液提取，得到提取液；
[0089] 将所述提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分析，得到提取液的 第--级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据；
[0090] 将所述提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，得到提取液 的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0091] 根据提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一二级高分辨质谱数据、提 取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱数据与步骤S1)中的高分 辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。
[0092] 其中，所述步骤S1)中建立抗氧化剂及防腐剂高分辨质谱数据库的方法同上所述， 在此不再赘述。
[0093]在本发明中，为了进一步提高抗氧化剂及防腐剂的筛分速度及效率，所述S1)中优 选还包括液相色谱分析，先将抗氧化剂或防腐剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，再进 行质谱分析，即液质联用，此时，所述步骤S1优选具体为：
[0094] 配制抗氧化剂的单标甲醇溶液；
[0095] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到抗氧化剂的液相色谱数 据；
[0096] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0097] 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质 谱分析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0098] 配制防腐剂的单标甲醇溶液；
[0099] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到防腐剂的液相色谱数据；
[0100] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据；
[0101] 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱 分析，采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0102] 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第一一级高分辨 质谱数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗 氧化剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二 级高分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数 据。
[0103] 其中，所述抗氧化剂及防腐剂的种类同上所述，在此不再赘述，在检测中更优选为 如表2所示的抗氧化剂及防腐剂。
[0104]表2抗氧化剂及防腐剂的名称及分子式
[0106] 所述液相色谱为本领域技术人员熟知的液相色谱即可，并无特殊的限制，本发明 中优选为高效液相色谱或超高效液相色谱;所述液相色谱分析的流动相A为甲酸水，流动相 B为甲醇与甲酸的混合液，70%的流动相B等度洗脱;其中，所述甲酸水的pH值优选为2~3， 更优选为2.5~3，再优选为2.7;所述混合液中甲酸的体积含量优选为0.1 %~0.3 %，更优 选为0.1 %~0.2%，再优选为0.1 %~0.15%，最优选为0.1 % ;所述液相色谱分析所用的色 谱柱优选为Luna C8液相色谱柱;所述色谱柱的规格优选为4.6mm X 3ym X 150mm;所述色谱 柱的温度优选为30°C~40°C，更优选为32°C~38°C，再优选为34°C~36°C，最优选为35°C; 所述液相色谱的进样体积优选为3~10yl，更优选为5~10yl，再优选为5~8yl，最优选为5y 1〇
[0107] 所述质谱分析的条件同上所述，在此不再赘述。
[0108] 将待测样品用醇溶液提取，得到提取液;所述待测样品为本领域技术人员熟知的 待测样品即可，并无特殊的限制，本发明中优选为无烟烟草;所述醇溶液优选为甲醇与水的 混合液;所述甲醇与水的体积比优选为（1~5): 1，更优选为(2~4): 1，最优选为3:1;所述待 测样品与醇溶液的比例优选为0. lg: (1~3)ml，更优选为0. lg:2ml;所述提取的步骤优选 为:将待测样品与醇溶液混合依次进行超声、涡旋、离心、过滤处理，得到提取液;所述超声 的时间优选为5~15min，更优选为8~12min，再优选为lOmin;所述祸旋的时间优选为10~ 20min，更优选为13~18min，再优选为15min;所述离心的速度优选为5000~20000r/min，更 优选为8000~15000r/min，再优选为10000~12000r/min，最优选为10000r/min ;所述离心 的时间优选为5~20min，更优选为8~15min，再优选为lOmin;所述过滤优选采用0.1~0.5y m滤膜进行过滤，更优选为采用0.2mi滤膜进行过滤。
[0109] 按照本发明，优选先将提取液进行液相色谱分析，得到提取液的液相色谱数据;将 经过液相色谱分析的提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分析，得到提取 液的第一一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据;将经过液相色谱分析的提取液 在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，得到提取液的第二一级高分辨质谱 数据与第二二级高分辨质谱数据；
[0110] 其中，所述液相色谱的条件与所述质谱的条件均同上所述，在此不再赘述;为了减 少溶质对色谱数据的影响，优选采用甲醇钠溶液校正质谱仪;所述甲醇钠的浓度优选为1~ 50mmol/L，更优选为5~30mmol/L，再优选为10~20mmol/L，最优选为10mmol/L。
[0111] 根据提取液的液相色谱数据、提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一 二级高分辨质谱数据、提取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱 数据与步骤S1)中的高分辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。
[0112] 本发明不需要复杂的前处理步骤，即可对多种抗氧化剂和防腐剂同时进行快速定 性检测；同时本发明提供的检测方法不仅准确性高、灵敏度高，还可对检测出的未知抗氧化 剂及防腐剂进行定性判定，扩大了分析监测的范围；本发明方法采用高分辨质谱采集准确 质量数，抗氧化剂和防腐剂的分辨率可达2~3万。
[0113]为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的抗氧化剂及防腐剂高分 辨质谱数据库的建立方法及检测抗氧化剂及防腐剂的方法进行详细描述。
[0114] 以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0115] 实施例1
[0116] 1.1标准溶液配制
[0117] 标准溶液:分别称取7.5-10.0 mg标准品，用甲醇定容至25mL容量瓶中，配制成0.3-0.4mg/mL的单标甲醇溶液；分别移取25-35此的单标甲醇溶液，用甲醇定容至10mL容量瓶 中，配制成约l.〇yg/mL的单标甲醇溶液，4°C冷藏待用。
[0118] 1.2质谱条件
[0119] 电喷雾ESI离子源：正离子全扫描模式，毛细管电压：3500V;雾化气：1.5Bar;干燥 气温度：180°C ;干燥气流速:6.01/min;质量扫描范围:m/z 50-1000amu;六级杆射频电压： 200.0 Vpp;碰撞池射频电压:600.0 Vpp。
[0120]负离子全扫描模式;毛细管电压:3000V;雾化气：1.5Bar;干燥气温度：180°C ;干燥 气流速:6.01/min;质量扫描范围:m/z 50-1000amu;四极杆离子能量:4. OeV;碰撞池能量： 7 ? OeV;碰撞池射频电压:600 ? OVpp;传输时间：100 ? Oys;预聚焦频率:5 ? Oys。
[0121] 正负离子模式下均以10mm〇l/L的甲酸钠溶液作为质量数校正液。
[0122] 1.3质谱仪采用直接质谱进样时阀联接方式如图1所示，标准校正液从质谱雾化腔 进样口转到联接port 5，断开port 3的HPLC联接，将单标甲醇溶液从雾化腔进样口通过针 栗(syringe pump)引入，针栗流速设为180iiL/h。
[0123] 1.4用10mm〇l/L的甲酸钠溶液校正质谱仪，采集抗氧化剂及防腐剂的一级、二级质 谱数据，使精确质量数误差<2mDa，同位素峰形偏差<20.
[0124] 1.5打开Library Editor软件自建新数据库，导入采集到的抗氧化剂及防腐剂的 一级、二级质谱数据。自建数据库的一级、二级高分辨质谱数据示例如图2、图3所示。
[0125] 实施例2
[0126] 2.1标准溶液配制
[0127] 标准储备液:分别称取7.5~10 . Omg标准品，用甲醇定容至25mL容量瓶中，配制成 0.3-0.4mg/mL的单标甲醇溶液;分别移取25-35yL的单标甲醇溶液，用甲醇定容至10mL容量 瓶中，配制成约l.〇yg/mL的单标甲醇溶液，4°C冷藏待用。
[0128] 单标工作溶液：将l.Oyg/mL的单标分别稀释1倍（约为500ppb单标）；混标工作溶 液:分别移取15_20yL 0.3-0.4mg/mL的单标甲醇溶液，至1 OmL容量瓶中，用甲醇定容（约为 500ppb混标）。4°(：冷藏待用。
[0129] 2.2色谱条件
[0130] 高效液相色谱条件:Luna C8液相色谱柱(4.6mmX 3umX 150mm，Phenomenex公司）。 [0131]流动相A为甲酸水(pH 2.7)，流动相8为甲醇(0.1%甲酸）；进样体积为51^;柱温为 35 °C ;流速为400yL/min; 70 % B等度洗脱。
[0132] 2.3质谱条件
[0133] 电喷雾ESI离子源：正离子全扫描模式，毛细管电压：3500V;雾化气：1.5Bar;干燥 气温度：180°C ;干燥气流速:6.01/min;质量扫描范围:m/z 50-1000amu;六级杆射频电压： 200.0 Vpp;碰撞池射频电压:600.0 Vpp。
[0134] 负离子全扫描模式;毛细管电压:3000V;雾化气：1.5Bar;干燥气温度：180°C ;干燥 气流速:6.01/min;质量扫描范围:m/z 50-1000amu;四极杆离子能量:4. OeV;碰撞池能量： 7 ? OeV;碰撞池射频电压:600 ? OVpp;传输时间：100 ? Oys;预聚焦频率:5 ? Oys。
[0135] 正负离子模式下均以10mm〇l/L的甲酸钠溶液作为质量数校正液。
[0136] 2.4样品处理
[0137] 称取五份0.1g(精确至O.Olg)无烟烟草样品于离心管中，加入2mL甲醇:水溶液(体 积比3:1)，超声10min，祸旋15min，10000r/min离心10min，取上清过0.2wii滤膜，得到提取 液。
[0138] 每份取200iiL混合作为烟草萃取液基质，加入混标，浓度为250ppb。
[0139] 2.5建立高分辨质谱筛查数据库
[0140]用单标甲醇溶液获得色谱和一级、二级质谱数据，数据预处理采用Bruker公司的 Data Analysis软件获得目标物精确质量数及保留时间，Smart Formula manually识别色 谱峰，采用Target Analysis软件建立数据库，数据库主要包括目标物准分子离子峰子质荷 比、保留时间、分子式、目标物英文名称等项目。
[0141] 2.6数据处理
[0142]数据预处理采用Bruker公司的Data Analysis软件获得目标物精确质量数及保留 时间，Smart Formula manually识别色谱峰，采用自建高分辨质谱筛查数据库定性筛查目 标化合物，质量数误差范围为± 5. OmDa，同位素峰形偏差判定值< 20。
[0143] 2.7已知多目标物快速筛查的结果
[0144] 对于Target Analysis筛查命中的已知物，本实验在负离子模式、正离子模式下18 种目标物的筛查结果如表2所示，质量数误差均<5. OmDa，同位素峰形偏差均小于20，保留 时间漂移< 〇. 15min。而得分值为2的化合物的离子响应均较低。
[0145] 关于Target Analysis的影响因素：相同色谱条件下，化合物的保留时间漂移很 小;分析了无烟烟草萃取溶液加混标溶液、以及混标甲醇溶液的目标物筛查，筛查得分值相 同，说明基质对筛查结果几乎没有影响;在HPLC和UPLC分析条件下，目标物的分辨率和灵敏 度存在差异，HPLC条件下，目标物分离度高，而UPLC条件下，响应值增加有利于含量低的离 子筛查，高分辨质谱的优势使在两种色谱条件都能获得较好的筛查结果;而质量数的准确 性是影响筛查结果的关键因素，在实验前，需要对飞行时间质谱仪进行质量数校正，在实验 中，每次进样均使用甲酸钠校正，已满足质量数误差要求，提高筛查命中率。
[0146] 表3抗氧化剂及防腐剂目标分析结果(*为同分异构体）
[0149] 2.8对筛查出的未知物进行定性
[0150] 对于Target Analysis筛查到的未知物，可预测其分子式、进行二级质谱图确证， 以鉴定未知物。如在烟草基质分析中，负离子模式下，设定质量数误差<5.0mDa，mSigma值 小于50，检索到未知物离子m/z = 191.0544，预测该未知物分子式见表4。
[0151 ]表4预测的未知物准分子离子的分子式
[0154] 在PUBCHEM化学品数据库中检索分子式C7H1206，检索结果为奎尼酸，奎尼酸是抗氧 化剂和防腐保鲜剂，可用作烟草增香剂。
[0155] 〇8118~〇2的检索结果为4-11161:1171-6-11；[1：1'0-1，4-(1;[117(11'0-1，2,4-匕611201：1'1&2；[116; 其他未检索到化合物名称。
[0156] Auto MS/MS模式下得到该未知物的二级质谱图如图4所示，测得的质谱数据可在 现有质谱数据库(如Mass Bank)中进行检索，与D-(-)-Quinic acid的质量数差值见表5,该 数据库有八百多个化合物的ESI-QqTOF-MS数据，文献称其数据源非标准统一的分析条件。
[0157] 表5未知物实验值与数据库检索的二级质谱数据之间的差值
【主权项】
1. 一种检测抗氧化剂及防腐剂的方法，其特征在于，包括： 51) 配制抗氧化剂的单标甲醇溶液； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 配制防腐剂的单标甲醇溶液； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第-级高分辨质谱 数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗氧化 剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二级高 分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数据； 52) 将待测样品用醇溶液提取，得到提取液； 将所述提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分析，得到提取液的第一 一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据； 将所述提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析，得到提取液的第 二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 根据提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一二级高分辨质谱数据、提取液 的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱数据与步骤Sl)中的高分辨质 谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Sl)具体为： 配制抗氧化剂的单标甲醇溶液； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到抗氧化剂的液相色谱数据； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 配制防腐剂的单标甲醇溶液； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液进行液相色谱分析，得到防腐剂的液相色谱数据； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第--级高分辨质谱 数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗氧化 剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二级高 分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数据。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为： 将待测样品用醇溶液提取，得到提取液； 将所述提取液先进行液相色谱分析，得到提取液的液相色谱数据； 将经过液相色谱分析的提取液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式进行质谱分析，得 到提取液的第一一级高分辨质谱数据与第一二级高分辨质谱数据； 将经过液相色谱分析的提取液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析， 得到提取液的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 根据提取液的液相色谱数据、提取液的第一一级高分辨质谱数据、提取液的第一二级 高分辨质谱数据、提取液的第二一级高分辨质谱数据、提取液的第二二级高分辨质谱数据 与步骤Sl)中的高分辨质谱数据库检测待测样品中的抗氧化剂及防腐剂。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述液相色谱分析的流动相A为甲酸 水，流动相B为甲醇与甲酸的混合液，70 %的流动相B等度洗脱。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述飞行时间质谱仪正离子全扫描模式的 质谱条件为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压3000~4000V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150 °(：~200°(：;干燥气流速2~101/1^11 ;质量扫描范围111/2 50~1000&11111;六级杆射频电压 150 · 0~300 · OVpp;碰撞池射频电压 500 · 0~800 · OVpp。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述飞行时间质谱仪负离子全扫描模式的 质谱条件为：电喷雾ESI离子源；毛细管电压2500~3500V;雾化气1~3Bar;干燥气温度150 °C~200°C ;干燥气流速2~101/min;质量扫描范围m/z 50~1000 amu;四级杆离子能量2.0 ~6. OeV;碰撞池射能量5.0~10.0 eV;碰撞池射频电压500.0~800 . OVpp;传输时间80.0~ 120 · Oys;预聚焦频率3 · 0~7 · Oys。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Sl)中一级高分辨质谱数据与二 级高分辨质谱数据的精确质量数误差小于等于2mDa，同位素峰形偏差小于等于20。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂及防腐剂为噻苯咪唑、 乙氧基喹啉、甘草酸、对香豆酸、没食子酸丙酯、纳他霉素、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、对羟基 苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸庚酯、对苯基苯酚、对羟基苯甲酸苄酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟 基苯甲酸异丁酯、4-己基间苯二酚、2,4-D酸、对羟基苯甲酸正辛酯、阿魏酸、叔丁基对苯二 酚、3，3-二硫代二丙酸二月桂基酯、迷迭香酸与抗坏血酸。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述待测样品为无烟烟草。10. -种抗氧化剂或防腐剂高分辨质谱数据库的建立方法，其特征在于，包括： 配制抗氧化剂的单标甲醇溶液； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述抗氧化剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分 析，采集抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 配制防腐剂的单标甲醇溶液； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪正离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第一一级高分辨质谱数据和第一二级高分辨质谱数据； 将所述防腐剂的单标甲醇溶液在飞行时间质谱仪负离子全扫描模式下进行质谱分析， 采集防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与第二二级高分辨质谱数据； 建立高分辨质谱数据库，所述高分辨质谱数据库包括抗氧化剂的第-级高分辨质谱 数据、抗氧化剂的第一二级高分辨质谱数据、抗氧化剂的第二一级高分辨质谱数据、抗氧化 剂的第二二级高分辨质谱数据、防腐剂的第一一级高分辨质谱数据、防腐剂的第一二级高 分辨质谱数据、防腐剂的第二一级高分辨质谱数据与防腐剂的第二二级高分辨质谱数据。
【文档编号】G01N30/02GK105929052SQ201610248071
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】刘彤, 陈欢, 韩书磊, 付亚宁, 张小涛, 刘洋
【申请人】国家烟草质量监督检验中心