污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，包括：对污泥进行冷冻干燥，研磨过筛取样，加替代物，加入甲醇和Na2EDTA?McIlvaine缓冲液，混匀超声离心提取上清液，将重复三次提取的上清液合并后用超纯水定容，调节pH为3.0；抽滤水样，用超纯水稀释并调节pH为3.0，加入替代物和Na2EDTA·2H2O，放置一个小时；固相萃取采用SAX?HLB串联系统，用甲醇、超纯水和酸性超纯水活化，然后上柱、淋洗、甲醇洗脱；洗脱液氮吹复溶，用优化好的液质参数定量。本发明优化的超声萃取、固相萃取、液质联用技术能实现复杂基质中抗生素的有效提取和准确定量，可应用于广泛的污水和污泥样品的测定。
【专利说明】
污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及抗生素的检测分析领域，具体涉及污水和污泥中12种典型抗生素的同 时检测方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素作为一种新型污染物广泛出现在地表水、地下水、土壤甚至饮用水中，尽管 浓度水平较低(通常为ng/L~yg/L或yg/kg~mg/kg)，仍可能会对敏感性生物产生急性或慢 性的毒害作用。抗生素持续排放形成的选择性压力，还会导致抗性细菌和抗性基因的产生， 该类基因片段一旦转移进入致病菌，会严重损害抗生素类药物对人类和动物感染的治疗潜 力。污水厂是环境中抗生素的重要来源，被生物体摄入但未被吸收的抗生素会随着排泄物 进入污水厂，因而污水和污泥中会存在一定浓度水平的抗生素。
[0003] 鉴于污水和污泥中抗生素类药物的浓度水平较低，属于微量有机污染物，且污水 和污泥中基质成分复杂，一般的检测手段难以满足要求，因此有必要建立新的具有高灵敏 度、高特异性的前处理和检测方法，实现该类复杂基质中微量抗生素的准确定量，以供进一 步的研究分析。
[0004] 针对微量抗生素的检测技术，常用的有液相色谱检测技术，包括高效液相色谱-紫 外吸收检测技术、高效液相色谱-荧光检测技术和液相色谱串联质谱检测技术，酶联免疫吸 附测定法和生物传感器技术，其中液相色谱串联质谱的检测技术灵敏度高、检出限低、稳定 性强，因此优选该技术用于分析检测。另外，超高效液相色谱与液相色谱相比，灵敏度和分 辨率更高，分析速度更快。对水相中抗生素的富集可采用冷冻干燥法和固相萃取技术，固相 萃取技术得出的检测限更低，方法更可靠。对吸附态抗生素的提取可采用超声萃取和加压 溶液萃取的方法，两者的回收率相当，但是超声萃取可同时处理多个样品，因而更方便快 捷。富集后的抗生素的浓缩方法有旋转蒸发和氮吹浓缩，相较于旋转蒸发，氮吹浓缩耗时较 长，但目标物回收率较高且稳定。通过对各个步骤应用技术的比选可以初步制定污水和污 泥中抗生素的提取、富集、浓缩和检测的方案，但针对不同的水质特点和目标物特性，仍要 进行具体操作条件的优化。
[0005] 目前针对污水和污泥中抗生素的检测方法多用于污水厂进出水及好氧污泥的检 测，而对于厌氧反应器，如厌氧消化池中污水和污泥，尚未形成成熟的抗生素检测方法。由 于厌氧反应器中有机化合物种类较多，浓度较高，对抗生素一类微量污染物的检测干扰较 为明显，因此需要对厌氧反应器中的污水和污泥的抗生素检测方法进行优化，得出可普遍 适用于污水厂各种污水和污泥的抗生素检测方法。目前针对污水中抗生素检测的方法一般 采用HLB小柱进行固相萃取(张金，宗栋良，常爱敏，等.水环境中典型抗生素 SPE-UPLC-MS/ MS检测方法的建立[J].环境化学，2015,34(8) :1446-1452)，如果用于厌氧反应器中污水的 抗生素检测，容易使较多有机干扰物截留在HLB小柱内，影响抗生素的检测准确性，因此需 要优化萃取过程，尽可能减少有机杂质的干扰。目前针对污泥中抗生素的检测方法一般采 用超声萃取(Yuan XJ，Qiang ZM，Ben ffff.Rapid detection of multiple class pharmace Uticals in both municipal wastewater and sludge with ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Environmental Sciences，2014,26(9) :1949-1959),但超声条件尚未形成统一的参数，而且提取液的成分 和用量方面还需要进一步优化。
【发明内容】
[0006] 本发明针对复杂的污水和污泥基质中微量的抗生素污染物，提出一种污水和污泥 中12种典型抗生素的同时检测方法，该检测方法灵敏度高、分辨率高、回收率高且可应用于 污水厂各种污水和污泥样品的检测分析。
[0007] 本发明提出的一种污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，包括以下步 骤：
[0008] 步骤一、取一定量的污泥预冻后冷冻干燥24h，研磨过筛后称取lg干污泥，将该干 污泥放入50mL的塑料离心管中，加入100yL质量体积浓度为lmg/L的 13C3-咖啡因作为替代 物；
[0009] 步骤二、向上述塑料离心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH为4.0的Na2EDTA-Mcl 1 vaine缓冲液，混勾振荡lmin，超声萃取15min，4000rpm离心5min，取出上清液，备用，再 重复两次上述操作；
[0010] 步骤三、合并步骤二获得的上清液，并用超纯水定容到500mL，然后用浓盐酸调节 pH为3.0，获得污泥的稀释样品；
[0011]步骤四、取1〇〇~500mL的污水水样，用0.7μπι的玻璃纤维滤膜进行过滤，超纯水稀 释到1000mL，用浓盐酸调节pH值为3.0,加入100yL质量体积浓度为lmg/L的13C3-咖啡因作为 替代物，加入〇.5g Na2EDTA · 2H20,放置一个小时，间歇振荡以保持Na2EDTA · 2H20的溶解状 态，完成污水水样的前处理；
[0012] 步骤五、将步骤三获得的污泥的稀释样品和经过步骤四前处理后的污水样品分别 进行固相萃取，用SAX-HLB小柱串联系统进行污水样品和污泥的稀释样品的固相萃取，所述 固相萃取的过程是：依次用6mL甲醇、6mL超纯水和6mL pH为3.0的超纯水进行活化，以5mL/ min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超纯水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脱得到洗 脱液；
[0013] 步骤六、将步骤五得到的洗脱液在40°C水浴条件下，氮吹至其中的溶剂完全挥发， 加入内标物，再用lmL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液复溶，得到检测样品；
[0014] 步骤七、分别以乙腈和0.3%甲酸溶液为流动相，利用超高效液相色谱串联质谱仪 对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析。
[0015] 进一步讲，步骤二中的超声萃取所采用的功率密度为0. lW/mL。
[0016] 步骤二中的超声萃取是在冰浴中进行。
[0017] 步骤七中，对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析中，超高效液相色谱串联 质谱仪的工作参数如下：
[0018] 色谱参数包括:脱溶剂气温度为450 °C，脱溶剂气流量为900L/Hr，锥孔气流速为 50L/hr，柱温为40°C ;检测时长10min;流动相梯度如下：
[0020] 质谱参数包括：质谱扫描分三个通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上 述三个通道分别对应的驻留时间依次为0.019s，0.063s和0.097s。
[0021 ]与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0022] (1)本发明的十二种目标物分属于四个不同的抗生素类别，结构、性质各有不同， 但在本方法中，针对高有机质浓度的厌氧污水和污泥，同时可以得到准确定量分析。
[0023] (2)污水厂实际水样中目标物浓度波动很大，在本方法中首先采用稀释的方法减 小复杂基质的影响（一般稀释到溶解性化学需氧量SC0D值低于100mg/L)，并在固相萃取过 程中，采用SAX-HLB小柱串联系统进行萃取，进一步降低萃取和检测过程中的杂质干扰，方 法的线性范围可达三个数量级，满足污水厂各种污水和污泥中抗生素的定量需求。
[0024] (3)污水厂污泥中的抗生素主要是以吸附态存在，在超声萃取过程中，既要保证充 分解吸到提取液中，又要避免抗生素发生降解，因此在处理过程中采用较小的功率密度 (0.1W/mL)，并加入冰浴;采用优化的提取液成分和用量，提高萃取效果。
【具体实施方式】
[0025]本发明污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法的基本原理是:将冷冻干燥 好的污泥与提取液充分混合，并置于超声环境中，通过超声过程中形成空化气泡的机械剪 切力作用，使吸附态的抗生素从污泥表面解吸下来，溶于提取液中。这个过程受到超声强度 和提取液极性、pH值的影响，既要保证充分解吸，又要避免抗生素发生降解，因此在处理过 程中采用较小的功率密度(0. lW/mL)，并加入冰浴；用甲醇和Na2EDTA-MCIlvaine缓冲液(pH 4.0)按1:1的比例作提取液。
[0026]采用SAX-HLB小柱串联系统做固相萃取，强阴离子交换柱SAX，可以结合带负电性 的腐殖酸，降低萃取和检测过程中的杂质干扰。HLB小柱是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙 烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔聚合物，通过特殊的极性捕获基团增加对 极性物质的保留。通过对pH值的优化，保证SAX小柱不吸附目标物，尽可能吸附腐殖酸等杂 质；对洗脱液的体积和极性进行优化，保证HLB小柱上吸附的目标物能被完全洗脱。对超高 效液相色谱串联质谱检测系统的优化主要是对质谱检测参数的优化和色谱分离效果的优 化，保证达到一定的分离度和分辨率，使得仪器能在较大的范围内保证线性和准确性。
[0027] 下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施案 例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028] 试验例，以实验室中的厌氧消化污泥为例，厌氧消化的消化液水样为污水水样，利 用本发明方法进行12种典型抗生素的同时检测，检测仪器选用Waters ACQUITY TQD，检测 步骤如下：
[0029] 步骤一、取某污水厂的浓缩污泥进行厌氧消化，将消化污泥放入锡箱纸中包好避 光放入-20 °C冰箱中预冻24h，完全冻实后取出放入冷冻干燥机中冷冻干燥24h，过程注意避 光。将冷冻干燥好的样品研磨过筛，并称取lg干污泥，放入50mL的塑料离心管中，加入100yL 质量体积浓度为lmg/L的13C3-咖啡因替代物。
[0030] 另外，为了测定本试验例的回收率制备出加标泥样，其制备过程是在上述步骤一 的基础上，再加入l〇〇yL lmg/L的混合物标准液，最终制得本试验例的加标泥样。
[0031] 步骤二、向上述塑料离心管中加入提取液，提取液为7.5mL的甲醇和7.5mL且pH为 4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲液，混匀振荡lmin，超声萃取15min，超声时的功率密度约为 〇. W/mL，再在4000rpm条件下离心5min，将上清液倒入棕色容量瓶中，离心出的污泥再加提 取液重复提取两次。
[0032] 步骤三、合并三次操作的上清液，最后用超纯水稀释到500mL，用浓盐酸调节pH值 为3.0，从而获得污泥的稀释样品。
[0033] 步骤四、由于本试验例中控制稀释后污水水样的SC0D值约为100mg/L，而测定污水 水样的SC0D值为919mg/L，因此，本试验例中取100mL的污水水样，将该污水水样过0.7μπι的 玻璃纤维滤膜，玻璃纤维滤膜可以避免对目标物抗生素的吸附，再用超纯水稀释到l〇〇〇mL， 用浓盐酸调节pH值为3.0，加入100yL质量体积浓度为lmg/L的 13C3-咖啡因作为替代物，加入 0.5g Na2EDTA · 2H20,放置一个小时，间歇振荡以保持Na2EDTA · 2H20的溶解状态，以保证络 合反应的进行，至此，完成污水水样的前处理。
[0034]另外，为了测定本试验例的回收率制备出加标水样，其制备过程与上述步骤四的 过程基本相同，不同仅在于，在加入替代物的同时再加入l〇〇yL质量体积浓度为lmg/L的混 合物标准液，最终制得本试验例的加标水样。
[0035]步骤五、将步骤三获得的污泥的稀释样品和经过步骤四前处理后的污水样品分别 进行固相萃取，用SAX-HLB小柱串联系统进行污水样品和污泥的稀释样品的固相萃取，所述 固相萃取的过程是:依次用6mL甲醇、6mL超纯水和6mL pH为3.0的超纯水进行活化，活化过 程中要保证柱子不能干燥，上柱的流速控制在5mL/min。拆掉SAX小柱后用5mL的超纯水淋洗 HLB小柱，主要是淋洗掉盐类，避免对检测仪器造成损害，真空抽干30min，最后用8mL的甲醇 洗脱得到洗脱液。
[0036]步骤六、将步骤五得到的洗脱液在40°C水浴条件下，氮吹至其中的溶剂完全挥发， 加入内标物，再用lmL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液复溶，得到检测样品；
[0037]步骤七、分别以乙腈和0.3%甲酸溶液为流动相，利用检测仪器用对检测样品进行 12种目标抗生素的定量分析，其中，检测仪器的工作参数如下：
[0038] 色谱参数包括:脱溶剂气温度为450 °C，脱溶剂气流量为900L/Hr，锥孔气流速为 50L/hr，柱温为40°C ;检测时长10min;流动相梯度如表1所示：
[0041 ] 质谱参数包括：质谱扫描分三个通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上 述三个通道分别对应的驻留时间依次为0.019s，0.063s和0.097s。
[0042] 根据目标物抗生素的特性，本试验例中检测仪器的质谱条件如表2所示。
[0043] 表 2
[0044]
[0046] 每次测样之前都要重复进同一浓度水平的标准样品，检查重现性，包括保留时间 的重现性和峰形的重现性，并且最好每次都做一条标准曲线，保证定量准确。本试验例的12 种抗生素的标准曲线及相关系数如表3所示。
[0047] 表 3
[0048]
[0049] 将加标水样和加标泥样扣除空白样品的浓度值，求得在该基质条件下的加标回收 率，如表4所示。后续进行了多次实验验证，数据结果显示回收率保持在比较稳定的水平。
[0050] 表 4
[0053] 表4中，污水加标水平为lyg/L，污泥加标水平为100yg/kg。
[0054] 根据表3得到的12种抗生素的线性方程和相关系数，本发明中的线性相关系数达 到0.99以上，线性范围为1~1000yg/L，检出限较低，定量结果准确，且能测定较大浓度范围 的样品。表4中污泥和污水中的加标回收率为32.98 %~133.38 %，能够实现样品中抗生素 的有效提取和检测。因此，上述结果综合表示本发明方法具备较优的检测性能，可应用于广 泛的污水和污泥样品的测定。
[0055] 尽管上面对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的【具体实施方式】，上 述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的 启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之 内。
【主权项】
1. 污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，包括w下步骤： 步骤一、取一定量的污泥预冻后冷冻干燥24h，研磨过筛后称取Ig干污泥，将该干污泥 放入50mL的塑料离屯、管中，加入10化L质量体积浓度为Img/L的"C3-咖啡因作为替代物； 步骤二、向上述塑料离屯、管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH为4.0的NasEDTA- Mcllvaine缓冲液，混匀振荡Imin，超声萃取15min，4000巧m离屯、5min，取出上清液，备用，再 重复两次上述操作； 步骤Ξ、合并步骤二获得的上清液，并用超纯水定容到500mL，然后用浓盐酸调节pH为 3.0,获得污泥的稀释样品； 步骤四、取100~500mL的污水水样，用0.7皿的玻璃纤维滤膜进行过滤，超纯水稀释到 lOOOmL，用浓盐酸调节抑值为3.0，加入10化L质量体积浓度为Img/L的1化3-咖啡因作为替代 物，加入〇.5g Na2抓TA · 2此0,放置一个小时，间歇振荡W保持化2EDTA · 2此0的溶解状态， 完成污水水样的前处理； 步骤五、将步骤Ξ获得的污泥的稀释样品和经过步骤四前处理后的污水样品分别进行 固相萃取，用SAX-HLB小柱串联系统进行污水样品和污泥的稀释样品的固相萃取，所述固相 萃取的过程是:依次用6mL甲醇、6mL超纯水和6mL pH为3.0的超纯水进行活化，W5mL/min的 流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超纯水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脱得到洗脱液； 步骤六、将步骤五得到的洗脱液在40°C水浴条件下，氮吹至其中的溶剂完全挥发，加入 内标物，再化址的10%乙腊+90%0.3%甲酸溶液复溶，得到检测样品； 步骤屯、分别W乙腊和0.3 %甲酸溶液为流动相，利用超高效液相色谱串联质谱仪对检 测样品进行12种目标抗生素的定量分析。2. 如权利要求1所述污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步骤 二中的超声萃取所采用的功率密度为0.1 W/mL。3. 如权利要求1所述污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步骤 二中的超声萃取是在冰浴中进行。4. 如权利要求1所述的污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步 骤屯中，对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析中，超高效液相色谱串联质谱仪的工 作参数如下： 色谱参数包括:脱溶剂气溫度为450°C，脱溶剂气流量为90化/Hr，锥孔气流速为50L/ 虹，柱溫为40°C ;检测时长lOmin;流动相梯度如下：质谱参数包括:质谱扫描分Ξ个通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-lOmin，上述Ξ 个通道分别对应的驻留时间依次为0.019s，0.063s和0.097s。
【文档编号】G01N30/06GK106093220SQ201610373937
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】李茹莹, 张翔宇, 周佳虹
【申请人】天津大学