用于确定数字图像中至少一个对象的整体亮度的方法与流程

生物技术、医学和相关的技术领域是基于分子分析的。电子器件可以以高精度和特异性分析分子。特别是在过去几年，自动化电子器件已经被开发出来用于通过常规方法分析大量样本。例如，现代dna测序设备被用于大量dna探针的常规分析。蛋白质样本可以借助高通量筛选及相关方法来分析。通常，这种电子器件检测从样本探针发射的荧光信号。当已经用荧光化合物如染料标记分子如核酸或蛋白质时，这是可行的。

商业上可获得的测序设备能够对用荧光染料标记的大量样本进行并行测序。最近开发的被称为“下一代测序”ngs的方法使测序发生革命性变化。ngs允许对在流动池中或通过产生油水乳液在空间上分隔的克隆扩增的或单个dna分子进行大规模并行测序。ngs允许同时执行数千乃至成百万到数十亿的测序反应。

在ngs中，通过聚合酶介导的核苷酸延伸的重复循环或者在一种格式中通过寡核苷酸连接的迭代循环来执行测序。作为大规模并行处理，取决于平台，ngs在单次仪器运行中产生数百兆碱基到数千兆碱基的核苷酸测序输出。与常规方法相比，廉价地产生大量的序列数据是其主要优点。

例如在voelkerding等人，clinicalchemistry55：4第641-658页，2009年以及metzker，naturereviews/genetics第11卷，2010年1月，第31-46页中综述了用于ngs技术的ngs平台和常见应用/领域。

在ngs中，各种感兴趣的寡核苷酸被共价附接于支持物上。随后，使用dna聚合酶将用荧光染料标记的核苷酸附接于生长的寡核苷酸链。当用不同的荧光染料标记四个核苷酸时，可以检测从探针发射的荧光信号并且可以鉴定被附接于寡核苷酸的核苷酸的类型。在检测之后，将荧光染料切割掉并且执行下一合成循环，在下一合成循环中将新的标记的核苷酸附接于生长的链上。通过执行多个循环，可以依照逐步的方式确定生长的寡核苷酸链的序列。在自动化测序设备中执行工作步骤。

us2010/0323350a1和wo2009/117119a1涉及使用例如通过合成方法从测序中获得的数据来确定核苷酸序列中的核酸的身份的方法和组合物。

wo2008/097455a1涉及一种用于激发并测量包括荧光材料如荧光标签、染料或颜料的样本上或样本中的荧光的成像系统，尤其是用于检测核酸上的荧光标签。此外，公开了一种器件，所述器件被配置为使得同时检测多个不同的dna模板中的荧光标签。

wo2014/020137a1涉及一种用于从测序库中富集目标序列以便提供目标富集测序库的方法，其中测序库适合于大规模并行测序并且包括多个双链核酸分子。

从具有标记分子的样本探针发射的荧光信号很弱，但是必须以高精度和特异性检测信号。因此，这种处理需要精确的光学设备，特别是照相机和扫描技术。

另外，为了例如在fastq中获得精确且可靠的测序结果，大规模评估由测序设备的光学成像系统捕获的数字图像是必须的。

在测序设备中，测序设备的流动池或所述测序设备的流动池的一部分的数字图像极度依赖于用于捕获数字图像的光学成像系统的特性。此外，当被配置为接收分子的至少一个对象是所谓的珠粒时，所述珠粒被配置为在其表面接收dna或rna，数字图像中的球形珠粒和正方形像素显示不同的形状并且珠粒的强度(intensity)必须根据一个或多个像素的亮度来公式化。此外，在光学成像系统中例如由光晕效应所引起的轻微失真效应进一步强化了确定共同表示特定珠粒的像素集的整体亮度的需要。此外，除必须考虑的球形珠粒和图像像素具有不同的形状的事实之外，各自像素的强度提取还必须补偿图像对准处理的轻微不准确性，所述图像对准处理是子像素精确珠粒位置和相应的荧光图像的对准。

本发明的目的是提供用于确定数字图像中至少一个对象的整体亮度的方法和系统，特别是数字图像中至少一个对象的整体亮度，其中所述至少一个对象被配置为接收包括遗传信息的分子。本发明的方法是计算机实现的。然而，技术人员应当理解还存在其它方式来实现本发明的方法。

此目的由独立权利要求的方法和系统实现。从属专利权利要求涉及优选实施方式。

本发明涉及一种用于确定数字图像中至少一个对象的整体亮度的方法。所述至少一个对象被配置为接收包括遗传信息的分子。所述方法包括产生包含k个样本点的区域a的步骤，所述k个点依照预定分布在区域a中分布。所述方法进一步包括将区域a的中心位置对准到数字图像中至少一个对象的中心位置的步骤。所述方法进一步包括提取在k个样本点的每个样本点处的强度值的步骤。所述方法进一步包括计算在各自k个样本点处提取的强度值的中心趋势的步骤。

优选地，依照上面给出的次序来执行本发明方法的上述步骤。

优选地，将区域a的中心位置对准到数字图像中至少一个对象的中心位置的步骤通过仿射变换执行，更优选地借助线性变换即平移来执行。

优选地，所述至少一个对象是优选被配置为接收dna和/或rna的珠粒。

优选地，产生的区域a具有数字图像中至少一个对象的形状。例如，如果至少一个对象例如具有现实生活中立方体的形状，即采用3d形状，那么它在数字图像中具有矩形形状，即用其2d表示。因此，产生的区域a优选还具有矩形形状。

优选地，区域a具有数字图像中至少一个对象的尺寸乘以系数s1。优选地，至少一个对象的尺寸是数字图像中至少一个对象的区域的尺寸。

优选地，所述至少一个对象具有数字图像中直径为d1的第一盘片的形状。优选地，d1是2.8像素。

优选地，产生的区域a具有直径为d2的第二盘片的形状。优选地，d2是3像素。

优选地，如果所述至少一个对象具有数字图像中直径为d1的第一盘片的形状，那么产生的区域a具有第二盘片的形状。优选地，d1＝d2。例如，如果所述至少一个对象具有现实生活中的球形，即3d形状，那么它具有数字图像中第一盘片的形状，即用其2d表示。因此，产生的区域a优选也具有所述盘片即第二盘片的形状。

优选地，样本点k的数目小于或等于30，优选k≤30，优选k＝27。然而技术人员应当理解样本点k的数目不限于30或更少。

优选地，预定的分布是蓝噪声。例如在参考文献[1]、[2]或[3]中给出了蓝噪声的实例。

优选地，使用泊松盘片采样(poissondisksampling)来产生k个样本点。在参考文献[1]中示出了泊松盘片采样的实例。

优选地，使用在k个样本点的每个样本点的子像素位置处的强度值的双线性内插来提取在所述k个样本点的每个样本点处的数字图像的强度值。

优选地，通过计算各自k个样本点的提取的强度值的中位值来计算各自k个样本点的提取的强度值的中心趋势。

优选地，所述至少一个对象被配置为携带荧光化合物。优选地，在荧光化合物发射电磁辐射期间由光学成像系统获得数字图像。

作为可替选方式，数字图像还可以由光学成像系统在反射照明期间，优选在反射白光照明期间获得。

本发明还涉及一种包括一个或多个计算机可读介质的计算机程序产品，所述介质具有用于执行前述权利要求之一的方法的步骤的计算机可执行指令。

本发明还涉及一种用于确定数字图像中对象的整体亮度的系统。

优选地，所述至少一个对象被配置为接收包括遗传信息的分子。

优选地，所述系统被配置为执行前述权利要求任一项的任一方法的步骤。

本发明的系统包括产生单元，其被配置为产生包括k个样本点的区域a，所述k个点依照预定分布在区域a中分布。

本发明的系统进一步包括对准单元，其被配置为将区域a的中心位置对准到数字图像中至少一个对象的中心位置。

本发明的系统进一步包括提取单元，其被配置为提取在k个样本点的每个样本点处的强度值。

本发明的系统进一步包括计算单元，其被配置为计算在各自k个样本点处提取的强度值的中心趋势。

下面将参考优选示例性实施方式且参考附图更详细地解释本发明，其中：

图1示出了示例性的荧光图像及其放大部分；

图2示出了具有泊松盘片p的如图1所示的荧光图像的放大部分，其中将泊松盘片p依照本发明的优选实施方式与珠粒位置对准；

图3示出了依照本发明的优选实施方式的用于提取在泊松盘片p的样本点k处的强度值的示例性双线性内插；和

图4示出了依照本发明的优选实施方式的用于确定数字图像中至少一个对象的整体亮度的系统。

图1在左侧示出了表示所谓的荧光图像的示例性数字图像，即在由多个珠粒携带的荧光化合物发射期间使用光学成像系统获得的数字图像。所述珠粒是被配置为接收dna或rna的对象。这种珠粒在商业上可从例如赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientificinc.)例如以dynabeads商标获得，参见参考文献[4]。图1的右侧示出了图1的左侧的示例性荧光图像的示例性放大部分。放大部分的围绕的部分示出了按照本领域已知方法确定的珠粒的位置。在此实施方式中，珠粒的尺寸近似为2.8像素。

图2示出了具有泊松盘片p的如图1的右侧所示的荧光图像的放大部分，其中将泊松盘片p依照本发明优选的实施方式与珠粒位置对准。

泊松盘片p具有的直径略大于珠粒的直径，在此优选实施方式中即3像素。

使用如在参考文献[1]中给出的算法来产生泊松盘片p。泊松盘片p包括k个样本点，每个样本点彼此具有最小距离r，其中参数r是在如参考文献[1]所述的算法中用户定义的密度参数。使用此算法，在泊松盘片p中创建蓝噪声分布。换句话说，在具有蓝噪声分布的泊松盘片p中分布k个点。泊松盘片p不仅为此珠粒创建，而且可以用于确定整个数字图像中所有珠粒/珠粒位置的亮度。甚至这样产生的泊松盘片p还可以用来确定其它数字图像中一个或多个珠粒位置的亮度，这也是可以的并且本领域技术人员也应当理解。换句话说，泊松盘片p可以只被产生一次，然后就可以用于各种图像中的各种珠粒位置。

在下一步骤中，将泊松盘片与珠粒位置对准。换句话说，泊松盘片的中心与珠粒位置的中心对准。

在下一步骤中，在每个样本点，提取强度值。使用双线性内插来提取在样本点的位置处的强度值从而产生双线性强度提取。

参考图3示例性地示出了用于依照本发明优选实施方式在泊松盘片p的样本点k处提取强度值的双线性内插。在图3中，被标示为“s”的样本点位于在子像素精确位置s(x0，y0)处的像素内。

在图3中，

s＝(x0，y0)标示样本点s的二维子像素精确位置，

r11＝(x1，y1)标示左下邻近像素，

r21＝(x2，y1)标示右下邻近像素，

r12＝(x1，y2)标示左上邻近像素，和

r22＝(x2，y2)标示右上邻近像素。

此外，应用以下定义

x1＝[x0]，y1＝[y0]

x2＝[x0]，y2＝[y0]

在这个背景下，需要定义下列方程式：

考虑到像素的总长度为2，可以如下简化上述方程式：

从而，强度可以作为双线性内插导出：

其中

i(x，y)：＝图像中位于(x，y)的像素的亮度，

iid：＝样本点s的强度值

依照这种方式，确定k个样本点的每个样本点s的强度值。

在下一步骤中，对k个样本点应用中值滤波从而分别得到整个泊松盘片和整个珠粒的强度值。换句话说，可以依照该方式来确定珠粒的整体亮度。

图4示出了依照本发明优选实施方式用于确定数字图像中至少一个对象的整体亮度的系统100。

通常，系统100被配置为执行如上所述的方法步骤。

系统100包括产生单元101，其产生包括k个样本点的区域a，所述k个点依照蓝噪声分布在区域a中分布。换句话说，产生单元101被配置为产生包括k个样本点的泊松盘片p。

在产生泊松盘片p之后，系统100的对准单元102将泊松盘片p的中心位置对准到数字图像中的珠粒的中心位置。

此后，提取单元103提取k个样本点中的每个样本点的强度值。

在提取k个样本点的强度值之后，系统100的计算单元104计算在各自k个样本点处提取的强度值的中值从而得到珠粒的整体亮度。

虽然在附图和先前描述中已经图示并详细描述了本发明，不过这种图示和描述被认为是说明性的或示例性的以及非限制性的；从而本发明不限于公开的实施方式。根据附图、公开内容和权利要求的教导，实践所要求保护的发明的那些本领域的技术人员可以理解并实现对公开的实施方式的变化。在权利要求中，词“包括”并不排除其它元素或步骤，并且不带具体数量的指称并不排除复数并且可以表示“至少一个”。

参考文献：

[1]-bridson，r.“任意维数的快速泊松磁盘采样(fastpoissondisksamplinginarbitrarydimensions)”，acmsiggraph2007sketches，2007年，第22篇文章

[2]-dunbar，d.等人，“一种用于快速泊松磁盘样本生成的空间数据结构(aspatialdatastructureforfastpoisson-disksamplegeneration)”，2006年，acmtrans.graph.25，3，503-508。

[3]-cook，r.l.，″计算机图形学中的随机抽样(stochasticsamplingincomputergraphics)″，acmtrans.graph.5，1，1986

[4]-https：//www.themiofisher.com/de/de/home/brands/product-brand/dynal.html