一种微粒子色度自动聚类分析系统的制作方法

本发明属于生物微粒子检测领域，尤其涉及一种微粒子色度自动聚类分析系统。

背景技术：

生物微粒子分析是二十一世纪兴起的多学科交叉的新型检测技术，利用荧光、生物素或其他方法标记固定在生物芯片上的dna、rna、抗原、抗体等。通常微粒子(如细胞、细菌)直径在微米级，可基于彩色微球激发荧光来完成微米级粒子的生物标识。通过一次检测可同时测定多种生物信息，具备高通量及并行检测的优势，大大节省试剂和人工，提高了效率。随着该技术的不断发展，相关微粒子检测设备也不断出现，仪器和试剂的结合使得大量信息可以用仪器来判读，通过软件分析可以轻松解决。

然而，目前大多数生物微粒子分析设备很难实现真正意义上的高通量快速检测，存在以下不足之处：(1)视场小。专利：(200510063208.9)提出了一种微阵列芯片检测系统，其视场达到2mm。根本无法完成微板型生物芯片(384孔板)中每个孔标记荧光信息的一次完全检测，需要通过图像拼接完成，检测速度慢；(2)细胞检测分辨率低，无法完成细胞信息的精细化检测；(3)荧光成像光谱范围较窄，荧光通道数少，检测能力弱。专利：(201610262872.4)提出了一种激光诱导与ccd采集的生物芯片检测方法，其采用固定激光器激发只能检测对应种类的荧光染料，如果需要检测其它的荧光染料，则需要更换激光器，代价昂贵，并且激光器受激光离散性及中心频率的限制，只能有几种荧光染料能用，对完成细胞的高通量检测有一定限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具备大视场高分辨率宽光谱成像的微粒子色度自动聚类分析系统，以克服现有技术中存在的不足。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种微粒子色度自动聚类分析系统，其特征在于：包括大面积彩色微粒子平面图像采集系统，及微粒子色度聚类计数系统；所述大面积彩色微粒子平面图像采集系统，包括大视场显微系统、大靶面相机；大视场显微系统和大靶面相机有机集成，所述大视场显微系统将大面积彩色微粒子成像于大靶面相机的图像传感器，大靶面相机将图像传感器接收的光学信号转换成计算机图像，实现物方视场直径6.36mm面积范围内所有彩色微粒子在对角线尺寸为32.36mm的大靶面相机上成像，系统光学分辨率达到3μm。微粒子色度聚类计数系统对前述图像进行微粒子图像分割、色度识别并依据微粒子的色度进行聚类统计，输出大面积内彩色微粒子的统计信息供分析使用。

所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，采集面积不小于1000000μm²，微粒子粒径不大于100μm；所包括的大视场显微系统，其物方视场不小于1000000μm²；所包括的大靶面相机成像靶面对角线尺寸不小于25400μm。

所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，还包括自动对焦机构，达到彩色微粒子快速精确对焦成像效果。通过控制z轴电机带动成像物镜上下运动，改变物距实时成像，提取计算机图像有效区域和对焦窗口，转换成灰度图像，再通过中值滤波去噪及图像锐化增强处理；将对焦区域内微粒子边缘灰度梯度值作为清晰度计算评价函数；先用z轴电机大步长搜索得出整个行程内对焦评价函数值的最大值，搜索清晰度是否为最大值，是，则确定最佳对焦范围，再进行小步长搜索，确定清晰度值是否最大，是，则完成对焦。

所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，还包括样品自动扫描机构，通过控制x/y轴电机运动，实现阵列式样品检测池的图像扫描采集，达到微粒子高标本快速检测的效果。

阵列式样品检测池，包括2个以上的样品检测杯，每个样品检测杯容量不低于10μl，样品检测池内所有样品检测杯的内底部在同一平面。

所述微粒子色度聚类计算系统包括图像空间转换模块，其将获取的计算机图像从rgb空间转换到hsv空间；图像预处理模块，将获取的计算机图像进行去除本底背景颜色，以及去除计算机图像中边缘区域亮度低的部分；微粒子检测模块，其用于检测微粒子在计算机图像中的位置；微粒子聚类模块，其用于统计计算机图像中微粒子连通区域的个数，并根据单个微粒子所占像素面积、连通区域的像素面积，计算每个连通区域中微粒子的个数，对已检测到的微粒子进行色度提取计算及聚类统计；输出模块，其用于对图像中微粒子进行统计结果显示及保存。

所述图像预处理模块是利用获取计算机图像时所采用光源的h分量范围对计算机图像进行颜色开窗操作，实现去除本底背景颜色；设置所采用光源的v分量上的亮度阈值，去除计算机图像中边缘区域亮度低的部分，保留所需的中间图像。通过对中间图像去噪及锐化处理，根据灰度、色度特征把微粒子从背景中分离出来。

所述微粒子检测模块采用距离变换，分水岭分割算法和形态学分割相结合的方法，使得粘连微粒子能够完全准确的分割出来。

所述微粒子聚类模块对于已检测到的微粒子区域像素色度的均值，包括h分量和s分量，依据h分量和s分量数值分配组合对大面积范围内彩色微粒子进行聚类统计。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过将大视场显微系统、大靶面相机结合，实现超大视场高分辨率宽光谱成像；将样品自动扫描机构及自动对焦机构与大视场显微系统有机结合，实现快速高通量(高标本数)成像；基于微粒子色度聚类计数系统完成成像图像中微粒子统计计算，实现高通量(高指标数)检测。

附图说明

图1为本发明整体结构示意图；

图2为本发明大视场显微系统光路原理示意图；

图3为本发明大视场显微系统结构图；

图4为本发明放大成像模块结构图；

图5为本发明变束准直模块结构图；

图6为本发明色度提取系统流程图；

图7为本发明数字图像自动对焦处理流程图。

附图标记：

1-密闭外壳；2-大视场显微系统；20-大靶面相机；21-放大成像模块；22-样品自动扫描机构；23-变束准直模块；24-分光模块；25-led或半导体激光器；26-成像物镜；27-自动对焦机构；220-阵列式样品检测池；a217-滤光片；216-凸透镜；215-凹凸透镜；214-凸透镜；213-凹凸透镜；212-凸凹透镜；211-凸凹透镜；b210-滤光片；233-凹透镜；232-凸透镜；231-凹透镜；230-凸透镜。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

在以下实施例中，如图1-6所示，微粒子色度自动聚类分析系统包括密闭外壳1、位于该外壳1内的大面积彩色微粒子平面图像采集系统及微粒子色度聚类计数系统；大面积彩色微粒子平面图像采集系统，包括大视场显微系统2，大靶面相机20；大视场显微系统2将大面积彩色微粒子成像于大靶面相机20的图像传感器，大靶面相机20将图像传感器接收的光学信号转换成计算机图像；微粒子色度聚类计数系统对前述图像进行微粒子图像分割、色度识别并依据微粒子的色度进行聚类统计，输出大面积内彩色微粒子的统计信息供分析使用。

所述大视场显微系统2包括led或半导体激光器、变束准直模块23、分光模块24，所述变束准直模块23位于所述led或半导体激光器25与所述分光模块24之间；包括位于所述分光模块24上方的放大成像模块21、位于所述分光模块24下方的成像物镜26；还包括大靶面相机20，其设于所述放大成像模块21的最上方；样品自动扫描机构22，其位于所述成像物镜26的最下方，用于自动完成阵列式样品检测池220的自动x/y方向扫描运动。

所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，采集面积不小于1000000μm²，微粒子粒径不大于100μm；所包括的大视场显微系统2，其物方视场不小于1000000μm²；所包括的大靶面相机20成像靶面对角线尺寸不小于25400μm。

所述大视场显微系统将大面积彩色微粒子成像于大靶面相机的图像传感器，是指：将所述led或半导体激光器25水平布置，光束通过变束准直模块23耦合成较大均匀光斑；分光模块24由激发滤光片、发射滤光片及呈45°布置的二向色镜；所述光斑进入分光模块24，首先通过激发滤光片，再进入呈45°布置的二向色镜反射，反射光通过成像物镜26照射在样品自动扫描机构22上的阵列式样品检测池220上，激发所述阵列式样品检测池220的微粒子产生特定波长的荧光信息，所述荧光信息通过上方成像物镜26进入呈45°布置的二向色镜，再透射所述发射滤光片进入放大成像模块21，同时将阵列式样品检测池220中的荧光信息分别二次变倍成像在最上方的大靶面相机20上。

所述阵列式样品检测池220由384个样品检测杯组成，每次完成一个样品检测杯的荧光激发，每个样品检测杯中的荧光信息通过上方成像物镜26进入呈45°布置的二向色镜，再透射所述发射滤光片进入放大成像模块21，放大成像模块21可提高孔中荧光成像质量实时校正荧光的球差、像差及色差，同时将每个样品检测杯中的荧光信息二次变倍成像在最上方的大靶面相机20上。基于数字图像处理控制z轴对焦机构，带动成像物镜上下运动完成精确对焦。通过电动载物平台x/y二维方向自动扫描运动完成孔板样品的384个样品检测杯中荧光信息自动快速检测。

所述放大成像模块21由8片镜片组成，自光线入射方向依次为：滤光片a217、凸透镜216、凹凸透镜215、凸透镜214、凹凸透镜213、凸凹透镜212、凸凹透镜211、滤光片b210，各透镜排列在一条中轴线上。显微成像系统一方面实现对激发光的屏蔽，使得荧光信号能完全通过，提高成像信噪比；同时实时校正荧光成像出现球差、像差及色差缺陷，实现400-700nm波段光通过率高达98％，另外还具有二次变倍功能，实现有效放大倍率为1.11倍。

成像物镜26放大倍率为4倍，数值孔径na为0.16，具备平场复消色差功能，能校正球差、相差、慧差。

本发明的大视场显微系统物方视场达到直径6.36mm，光学分辨率3μm，系统有效放大倍率为4.44倍；一次扫描可完成384标本检测，每个标本最多可实现36000种指标检测。通过样品自动扫描机构22实现阵列式样品检测池220的384个检测杯中所有信息快速捕获对准，借助自动对焦机构27完成每个检测杯中微粒子图像精确自动对焦，最后依靠放大成像模块21完成成像，同时借助图像处理软件完成自动图像处理及数据分析。

所述变束准直模块23由4片镜片组成，自光束入射前至后依次为凹透镜233、凸透镜232、凹透镜231、凸透镜230，各透镜排列在一条中轴线上，将半导体激光器或led输出的光束扩大到直径6.36mm，同时保证光斑亮度均匀。

大靶面相机20为行间转移型，分辨率不低于4896×3264，像元大小为5.5μm×5.5μm，光谱响应范围为：400-1000nm，靶面尺寸为：26.93×17.95mm。

半导体激光器或led中心波长为390nm，半波宽度10nm，荧光素发射光谱范围为440-700nm。

所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，还包括样品自动扫描机构27，通过控制x/y轴电机运动，实现阵列式样品检测池220中微粒子图像扫描采集。

阵列式样品检测池，包括2个以上的样品检测杯，每个样品检测杯容量不低于10μl，样品检测池220内所有样品检测杯的内底部在同一平面。

所述微粒子色度聚类计算系统包括图像空间转换模块，其将获取的计算机图像从rgb空间转换到hsv空间；图像预处理模块，将获取的计算机图像进行去除本底背景颜色，以及去除计算机图像中边缘区域亮度低的部分；微粒子检测模块，其用于检测微粒子在计算机图像中的位置；微粒子聚类模块，其用于统计计算机图像中微粒子连通区域的个数，并根据单个微粒子所占像素面积、连通区域的像素面积，计算每个连通区域中微粒子的个数，对已检测到的微粒子进行色度提取计算及聚类统计；输出模块，其用于对图像中微粒子进行统计结果显示及保存。

所述图像预处理模块是利用获取计算机图像时所采用光源的h分量范围对计算机图像进行颜色开窗操作，实现去除本底背景颜色；设置所采用光源的v分量上的亮度阈值，去除计算机图像中边缘区域亮度低的部分，保留所需的中间图像。通过对中间图像去噪及锐化处理，根据灰度、色度特征把微粒子从背景中分离出来。

所述微粒子检测模块采用距离变换，分水岭分割算法和形态学分割相结合的方法，使得粘连微粒子能够完全准确的分割出来。

所述微粒子聚类模块对于已检测到的微粒子区域像素色度的均值，包括h分量和s分量，依据h分量和s分量数值分配组合对大面积范围内彩色微粒子进行聚类统计。

如图7所示，所述的大面积彩色微粒子平面图像采集系统，还包括自动对焦机构27，通过控制z轴电机带动成像物镜26上下运动，改变物距实时成像，提取计算机图像有效区域和对焦窗口，转换成灰度图像，再通过中值滤波去噪及图像锐化增强处理；将对焦区域内微粒子边缘灰度梯度值作为清晰度计算评价函数；先用z轴电机大步长搜索得出整个行程内对焦评价函数值的最大值，搜索清晰度是否为最大值，是，则确定最佳对焦范围，再进行小步长搜索，确定清晰度值是否最大，是，则完成对焦。

自动对焦机构27通过z轴电机带动成像物镜上下运动，行程为15mm，分辨率为0.2μm，基于数字图像处理算法控制其完成精确对焦。

电动载物平台22实现阵列式样品检测池220x/y二维运动，其主要由步进电机、编码器、极限传感器、滚珠丝杠、交叉滚子导轨组成，x方向行程为120mm，y方向80mm，重复定位精度0.2mm。

大靶面相机获得计算机图像后首先提取图像中有效区域，并在有效区域中选取中心及四个角区域为对焦区域，然后将图像转换灰度图，采用中值滤波去噪，选取7x7矩形阵列像素点为窗口，通过从窗口取出各个像素灰度值按照升序排列，用中位数也就是中值取代领域像素值，消除图像中的颗粒噪声十分有效，在保护边缘信息同时使得图像更加平滑。基于拉普拉斯算子完成对焦区域图像进行锐化增强，使得区域内微粒子细节及轮廓更加清晰。将区域内微粒子边缘灰度梯度值作为清晰度计算评价函数。先控制z轴电机带动成像物镜26大步长搜索得出整个行程内对焦评价函数值的最大值，然后将步长调小，减小搜索范围，提高搜索精度，在最大值附近重新搜索，这个过程反复进行，直到得到最高精度的搜索值，最后完成每个样品检测杯的自动对焦。

本发明的上述实施例仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。