本发明属于分子计算
技术领域：
，具体涉及一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门。
背景技术：
：随着DNA纳米技术的蓬勃发展，DNA折纸术(Origami)已经变成一种构建纳米结构的强大的工具，在构建各种各样的二维和三维结构方面有着广泛的应用。DNAOrigami首次被Rothemund发现，他通过一条长的DNA单链M13与几百条短的DNAstaple链杂交形成了初步的纳米结构。现在，将DNAorigami与纳米金属相结合，制作纳米器件得到了广泛关注。如LiuNa课题组将DNAOrigami与纳米金棒相结合，构造手性分子，并成功取得了可以动态控制的CD信号。得益于纳米金颗粒独特的结构和光学特性，科学家们热衷于将纳米金颗粒与荧光探针相结合，构造生物传感器。LiFeng课题组利用纳米金颗粒作结构核心，同时利用纳米金猝灭荧光基团的特性，构造了基于酶切反应的生物传感器。然而，这些研究始终没有将DNAOrigami、纳米金颗粒、荧光探针这三个现阶段研究热点结合起来。单纯的DNAOrigami逻辑运算、或者DNAOrigami和纳米金属相结合的逻辑运算系统，在信号检测结果读出方面存在着巨大的缺陷。就目前的技术而言，这些逻辑运算的信号检测要靠凝胶电泳或电子显微镜才能够观察地到，这就需要动辄几个小时的观测时间，很大程度上影响到了这些纳米器件的可应用性。利用简单的纳米金属荧光探针构造纳米器件，得益于在溶液中极高的局部浓度，响应时间大大缩短，通常在几分钟甚至几秒钟之内便可以检测到荧光信号，在信号检测方面有了质的飞跃。然而，这些渺小的纳米器件却无法在电子显微镜下得到印证，这使得实验结果的可信度大打折扣。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门，具体技术方案如下：一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门，包括：输入信号、信号转化器和输出信号，其特征在于，所述信号转化器包括：DNAOrigami，位于DNAOrigami上的切割链和纳米金属颗粒，以及纳米金属颗粒表面与切割链识别并连接的荧光链；所述切割链为DNA单链；所述荧光链为一端含有荧光基团的DNA单链，所述DNA单链未固定的一端含有酶切位点；所述荧光链的另一端通过巯基化固定在纳米金属颗粒表面；所述荧光链的具有酶切位点的一段与切割链远离DNAOrigami的一端完全互补；所述输入信号包括蛋白酶；所述蛋白酶特异性识别所述酶切位点，将酶切位点切开，使得荧光基团从纳米金属颗粒表面释放；所述输出信号为荧光基团的释放。所述DNAOrigami整体呈凹型哑铃状，其横切面为蜂巢结构。进一步地，DNAOrigami的制备方法为：将M13mp18链(M13噬菌体的环状单螺旋DNA链)与staple链(序列见表1)按1:10的摩尔比在缓冲液中混和，并退火，通过碱基互补配对将骨架链咬合，从而组装为哑铃状DNAOrigami，在DNAOrigami“哑铃”两端的凹槽侧面上延伸出切割链；哑铃状DNAOrigami的横切面为蜂巢结构。所述切割链位于DNAOrigami“哑铃”两端的凹槽侧面上；所述纳米金属颗粒固定在DNAOrigami“哑铃”的凹槽部位。所述纳米金属颗粒为纳米金颗粒或纳米银颗粒。所述荧光链的酶切位点与巯基之间有3-4个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。所述分子逻辑门为与门，所述信号转化器还包括A链，所述A链为DNA单链，A链与切割链远离DNAOrigami的一端部分互补；所述输入信号还包括A’链，所述A’链为DNA单链，A’链与A链完全互补。所述分子逻辑门为或门，所述信号转化器包括切割链1和切割链2；所述荧光链包括荧光链1和荧光链2；所述荧光链1的具有酶切位点的一段与切割链1远离DNAOrigami的一端完全互补；所述荧光链2的具有酶切位点的一段与切割链2远离DNAOrigami的一端完全互补。所述分子逻辑门为三输入逻辑门，所述切割链两端分别具有E区和e区，E-e区域互补，使切割链形成茎环结构；所述切割链E区域的下游为F区域，切割链e区域的下游为d区域；所述输入信号还包括B链和B’链；所述B链和B’链为DNA单链，B链由f、e、d区域组成，B’链由D、E、F区域组成，B链和B’链完全互补；所述B链的f、e区域与切割链E、F区域完全互补；所述B’链D、E区域与切割链e、d区域完全互补，相同字母大小写对应区域完全互补。一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门为与门，包括：输入信号、信号转化器和输出信号；所述信号转化器包括：DNAOrigami，位于DNAOrigami上的切割链和纳米金属颗粒，A链，以及纳米金属颗粒表面与切割链识别并连接的荧光链；所述切割链为DNA单链；所述A链为DNA单链，A链与切割链远离DNAOrigami的一端部分互补；所述荧光链为含有荧光基团的DNA单链，所述DNA单链未固定的一端含有酶切位点；所述荧光链的DNA单链另一端通过巯基化固定在纳米金属颗粒表面；所述荧光链的具有酶切位点的一段与切割链远离DNAOrigami的一端完全互补；所述荧光链的酶切位点与巯基之间有3-4个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；所述输入信号为蛋白酶、A’链或其混合；所述A’链为DNA单链，A’链与A链完全互补；所述蛋白酶特异性识别所述酶切位点，将酶切位点切开，使得荧光基团从纳米金属颗粒表面释放；所述输出信号为荧光基团的释放。一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门为或门，包括：输入信号、信号转化器和输出信号；所述信号转化器包括：DNAOrigami，位于DNAOrigami上的切割链和纳米金属颗粒，以及纳米金属颗粒表面与切割链识别并连接的荧光链；所述切割链为DNA单链，包括切割链1和切割链2；所述荧光链为含有荧光基团的DNA单链，所述DNA单链未固定的一端含有酶切位点；所述荧光链的DNA单链另一端通过巯基化固定在纳米金属颗粒表面；所述荧光链包括荧光链1和荧光链2；所述荧光链1的具有酶切位点的一段与切割链1远离DNAOrigami的一端完全互补；所述荧光链2的具有酶切位点的一段与切割链2远离DNAOrigami的一端完全互补；所述荧光链的酶切位点与巯基之间有3-4个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；所述蛋白酶1特异性识别荧光链1的酶切位点，蛋白酶2特异性识别荧光链2的酶切位点；所述输入信号为蛋白酶1、蛋白酶2或两者混合，蛋白酶特异性识别所述酶切位点，并将酶切位点切开，使得荧光基团从纳米金属颗粒表面释放；所述输出信号为荧光基团的释放。一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门为三输入逻辑门，包括：输入信号、信号转化器和输出信号；所述信号转化器包括：DNAOrigami，位于DNAOrigami上的切割链和纳米金属颗粒，以及纳米金属颗粒表面与切割链识别并连接的荧光链；所述切割链为DNA单链；所述切割链两端分别具有E区和e区，E-e区域互补，形成茎环结构；所述切割链E区域的下游为F区域，切割链e区域的下游为d区域；所述荧光链为含有荧光基团的DNA单链，所述DNA单链未固定的一端含有酶切位点；所述荧光链的DNA单链另一端通过巯基化固定在纳米金属颗粒表面；所述荧光链的具有酶切位点的一段与切割链远离DNAOrigami的一端完全互补；所述荧光链的酶切位点与巯基之间有3-4个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；所述输入信号为蛋白酶、B链、B’链或其混合；所述B链和B’链为DNA单链，B链由f、e、d区域组成，B’链由D、E、F区域组成，B链和B’链完全互补；所述B链f、e区域与切割链E、F区域完全互补；所述B’链D、E区域与切割链e、d区域完全互补；相同字母大小写对应区域完全互补；输入B链或B’链，茎环结构打开，蛋白酶特异性识别所述酶切位点，将酶切位点切开，使得荧光基团从纳米金属颗粒表面释放；所述输出信号为荧光基团的释放。本发明的有益效果为：(1)本发明的分子逻辑门将DNAOrigami、纳米金属颗粒、荧光探针结合起来，既保证了纳米器件的响应速度，又丰富了纳米器件的检测手段，同时满足实验数据的读取速度和可信度等多项要求。DNAOrigami和纳米金属颗粒的连接体可以通过琼脂糖凝胶电泳检测效果，看到明显的分带现象；纳米器件在透射电子显微镜(TEM)的观测下可以看到清晰的成像；利用荧光PCR可以检测逻辑计算的输出信号，同时满足实验数据的读取速度(2)DNAOrigami采用哑铃状结构，哑铃状折纸结构在最大程度地提高酶切的局部浓度的同时，还提供了一种编址纳米金属颗粒表面DNA的方法，这对构造反应更加灵敏、结构更加合理的生物传感器有着重要的意义。横切面为蜂巢结构，蜂巢结构的DNA双螺旋间距比立方结构的DNA双螺旋间距更大，可以在相同材耗的情况下获得更大的体积，同时使结构具有足够的强度，适合用来设计立体结构。附图说明图1(a)是本发明DNAOrigami的左视图。图1(b)是本发明DNAOrigami的边缘末端细节图。图1(c)是本发明DNAOrigami的展开图。图2是本发明分子逻辑门的效果示意图。图3是本发明分子逻辑门的酶切反应示意图。图4是与逻辑门的示意图。图5是或逻辑门的示意图。图6是三输入逻辑门的示意图。具体实施方式以下实施例便于更好地理解本发明。如无特殊说明，实验材料均可通过商业途径获得，实验方法均为常规实验方法。实验中所使用的DNA链购自上海生工，未被修饰的DNA链用PAGE电泳纯化，被修饰了二硫化物和荧光基的DNA链通过高性能液相色谱法提纯。M13mp18DNA链从NewEnglandBiolabs购买。金颗粒从TedPellaInc购买。TE缓冲液配制为：量取5ml1MTris-HClBuffer(PH＝8.0)，1ml0.5MEDTA(PH＝8.0)于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml去离子水均匀混合，将溶液定容到500ml。本发明使用哑铃状DNAOrigami使用caDNAno软件设计DNAOrigami的DNA序列，其界面如图1所示。图1(a)是本发明DNAOrigami的左视图。DNAOrigami采用蜂巢结构，蜂窝结构的DNA双螺旋间距比立方结构的DNA双螺旋间距更大，可以在相同材耗的情况下获得更大的体积，同时使结构具有足够的强度，适合用来设计立体结构。图1(c)是本发明DNAOrigami的展开图。按照图1(a)左视图中对DNA双螺旋的标号顺序，从上到下依次展开。图中最长的线表示折纸结构的骨架链，选用M13噬菌体的环状单螺旋DNA链，它由7249个脱氧核糖核苷酸组成，足够形成想要的哑铃结构。图中数量众多的短线表示DNAOrigami的staple链，它们由caDNAno软件自动生成。在特定的位置，staple链(序列见表1)通过碱基互补配对将骨架链咬合，从而形成特定的立体结构。在设计DNAOrigami时，需要考虑边缘末端的处理，一般有两种方式，一是将staple链伸出一段，二是将staple链缩进一段，由此避免“齐头末端”产生的堆叠效应。在此将具体的选择以图1(b)作以交代。由于受DNA双螺旋结构在轴向上旋转角度的限制，每股双螺旋转向下一股双螺旋的位置并不能随意确定，第10股双螺旋分子转向第11股的位置，与第12股转向第13股的位置有所差异。表1本发明以DNAOrigami作为结构核心，在DNAOrigami“哑铃”两端的凹槽侧面上伸出切割链(左侧切割链和右侧切割链)，荧光链一端含有荧光基团，DNA单链未固定的一端含有酶切位点，另一端通过巯基化固定在纳米金颗粒表面，荧光链的具有酶切位点的一段与切割链远离DNAOrigami的一端完全互补，通过DNA自组装将纳米金颗粒连接在DNAOrigami“哑铃”的凹槽部位，形成局部效应。自然状态下，纳米金颗粒将荧光基团猝灭，系统没有荧光信号的输出；在蛋白酶(Nicking酶)的作用下，发生酶切反应，释放荧光基团，荧光基团可以在特定波长的激发光刺激下发光，系统可以检测到荧光信号的输出。此时切割链与荧光链互补碱基数减少到2个，常温下不稳定，因此切割链会倾向于同下一个荧光链结合，发生酶切反应，从而继续释放荧光基团，且由于近距离效应的存在，这种酶切反应将十分迅速，使得整个系统响应时间大大缩短。酶切反应的示意图如图3所示。在逻辑门的构造中，我们将荧光基团的释放作为输出，能够检测到强烈的荧光信号记作“1”，不能够检测或检测到很微小的荧光信号(误差)记作“0”。纳米金颗粒上修饰的DNA链如表2。表2实施例1：与逻辑门一种基于DNA折纸术和纳米金颗粒荧光探针的与逻辑门，构建方法包括如下步骤：(1)将1.6nM的M13mp18链与staple链以摩尔比1:10的比列在1×TE、11mMMgCl2缓冲液里面混和，并从90℃退火至室温，组装为哑铃状DNAOrigami，在DNAOrigami“哑铃”两端的凹槽侧面上延伸出切割链1和切割链2；(2)将胶体金用BSPP过夜处理，加入NaCl至溶液变紫色，6500rmp，离心15min，抽取上清液，用1×BSPP、0.5×TBE、50mMNaCl溶液回收；与巯基化的DNA体系(荧光链与CAP链以摩尔比10:1比例在0.5×TBE、50mMNaCl溶液中混合而成)混合，室温反应6h以上，得到荧光DNA链修饰的纳米金颗粒。(3)将荧光DNA链修饰的纳米金颗粒超速离心处理，除去多余的DNA单链，与DNAOrigami样品混合，反应过夜，使用凝胶电泳提纯DNAOrigami连接纳米金颗粒的复合结构(通过CAP链与DNAOrigami上的Capture1/2互补配对连接)。(4)将提纯的DNAOrigami和纳米金颗粒复合结构，与A链按1:2的比例混合，室温反应2h，保证与切割链充分结合。将上述样品放入荧光PCR采集荧光信号。在信号采集过程中加入1U/μL蛋白酶(蛋白酶为Nb.BbvCI)和/或4倍于A链浓度的A’链，观察荧光信号的输出，验证逻辑与门。本实施例中切割链，A链和A’链的序列如表3。表3在与门的构造中，我们引入一条寡核苷酸短链A链将切割链上的酶切位点保护起来，如图4所示。A链与切割链蛋白酶识别一端部分互补，与另一条DNA短链A’链完全互补。当体系中不存在A’链时，由于切割链上的蛋白酶识别区域被A链保护起来，因而不能与连接金颗粒和荧光基团的寡核苷酸链特异性识别，故而不能释放荧光基团。当体系中加入A’链时，A’链会将A链置换下来，使得切割链重新恢复特异性识别连接链的能力，并在蛋白酶的作用下释放荧光基团。我们将蛋白酶和A’链作为两个输入，存在计作“1”，不存在计作“0”，便构成了逻辑与门。真值表如表4所示。表4逻辑与门真值表INPUT1INPUT2OUTPUTA’链蛋白酶荧光基团000010100111实施例2：或逻辑门一种基于DNA折纸术和纳米金颗粒荧光探针的或逻辑门，构建方法包括如下步骤：步骤(1)-(3)同实施例1。(4)将提纯的DNAOrigami和纳米金颗粒复合结构样品放入荧光PCR采集荧光信号。在信号采集过程中加入1U/μL蛋白酶(蛋白酶1为Nb.BbvCI和/或蛋白酶2为Nb.BsrDI)，观察荧光信号的输出，验证逻辑或门。如图5所示，两种酶特异性识别的酶切位点并不相同，图中用不同的灰度表示了两种蛋白酶(深色和浅色)和对应的两组酶切位点，这为逻辑或门的构造提供了可能。本实施例中切割链的序列如表5。表5当浅色表示的蛋白酶1存在时，左侧切割链1可以与酶切位点序列特异性结合，从而释放相应的荧光基团；当深色表示的蛋白酶2存在时，相应的，右侧荧光基团被释放。其真值表如表6所示。表6逻辑或门真值表INPUT1INPUT2OUTPUT蛋白酶1蛋白酶2荧光基团000011101111实施例3：三输入逻辑门一种基于DNA折纸术和纳米金颗粒荧光探针的三输入逻辑门，构建方法包括如下步骤：步骤(1)-(3)同实施例1。(4)将提纯的DNAOrigami和纳米金颗粒复合结构样品放入荧光PCR采集荧光信号。在信号采集过程中加入1U/μL蛋白酶(蛋白酶为Nb.BbvCI)，和/或4倍于切割链浓度的B链，和/或B’链，观察荧光信号的输出，验证三输入逻辑门。本实施例中切割链、B链和B’链的序列如表7。表7在三输入逻辑门的构造中，切割链为一个“茎环”结构，如图6所示。初始状态下，切割链两端分别具有E区和e区，E-e区域互补配对，形成“茎环结构”。由于长度的限制，切割链不能释放荧光基团。互补区域的上游和下游各有一段粘性末端，F与d。我们引入完全互补的两条链：B链和B’链，其中，B链由f、e、d三段组成，B’链由D、E、F三段组成，大小写对应区域完全互补。在B链单独存在的情况下，B链f段与茎环F区域的粘性末端特异性识别，将茎环结构打开，使得切割链获得足够的长度释放荧光基团。当B’链单独存在时，B’链D段与茎环d区域的粘性末端特异性互补，打开茎环结构，使切割链伸长，释放荧光基团。当B链与B’链同时存在时，由于这两条链完全互补，故倾向于两两结合，而不是打开茎环结构。此时切割链仍然受到长度限制，无法释放荧光基团。三输入逻辑门真值表如表8所示。表8三输入逻辑门真值表INPUT1INPUT2INPUT3OUTPUT蛋白酶B链B’链荧光基团00000100001001101000110110111110序列表<110>华北电力大学<120>一种基于DNA折纸术和纳米金属颗粒荧光探针的分子逻辑门<130>2017<160>205<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>28<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple1<400>1ttttaacctccagcccagttttccccgg28<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple2<400>2acttctgaagagcctaataca21<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple3<400>3ggccttgcctcagattcccc20<210>4<211>43<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple4<400>4gccatttgggaaaccggaattgccatattgacaatattcacaa43<210>5<211>26<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple5<400>5acgagccggcaggcgaagaatagccc26<210>6<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple6<400>6gattaatagataagtcttaaa21<210>7<211>36<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple7<400>7gagcaaacaagacaaatatgtctgaaacacgactag36<210>8<211>31<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple8<400>8cgaggcttgacggggaaacactaaacgccgc31<210>9<211>30<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple9<400>9ctcaatcttatttagaagtatgaattatca30<210>10<211>36<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple10<400>10aggaaggccggagcgggagagggcttaggttgggaa36<210>11<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple11<400>11ccaggcaaagggaagggcgatcggtgcgg29<210>12<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple12<400>12accgcctccctgagccaccaccctccgccagcctt35<210>13<211>22<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple13<400>13ctgttctttcctgtatcgaaac22<210>14<211>50<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple14<400>14acgccagggttcaccgctgatcgcacaataggggaacaaagcataagcaa50<210>15<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple15<400>15ttcatagccccgaaacgtcaccaacagaaatcacc35<210>16<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple16<400>16tcaattctacttttgacccaattcttgaatattgc35<210>17<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple17<400>17ttcaacagttaggaattcaaa21<210>18<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple18<400>18taaatgtttttttaaagggattttactcgttatga35<210>19<211>31<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple19<400>19gcataaaaactcacattaacaaacagctggt31<210>20<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple20<400>20agatataaaaacatgttcttaccaatcaggtcttt35<210>21<211>37<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple21<400>21gagccagcataagtgagaatcaccgtcaccgacttga37<210>22<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple22<400>22gcggaatgaattaagtatagcccatttaggattag35<210>23<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple23<400>23caaagaattaagctaaaatttttagtaatgtagct35<210>24<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple24<400>24cagtgctaacggattcgcgaacgcggacgctgaga35<210>25<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple25<400>25attagaaagagtcaagagctcattccagatacaaa35<210>26<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple26<400>26cacctttgtttaacgtcagccatatatcc29<210>27<211>35<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>Staple27<400>27gattttcagatagataaccctcaatcaatactgaa35<210>28<211>35<212>DNA<213>Artifi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