本发明属于数字全息成像技术的医学应用领域，涉及一种基于全息成像的红细胞多项生理参数的检测方法。
背景技术：
血液是人体不可或缺的重要组成部分，血液中各类细胞、内容物含量的正常与否直接关系到人自身身体的健康状况。其中红细胞作为数量最为庞大的一种血细胞，是人体内运送氧气、排出二氧化碳的重要媒介，其数量、形态对于人健康状况影响重大。
血液常规检测是医疗中一种常见化验项目，用以反应人体血细胞情况。随着目前检测技术的进步，能够用于血常规的检测的方法手段越发丰富：
①、显微计数法：
原理：采用人工镜检(多使用细胞计数板，又称牛鲍板)，借助染色剂、造影剂或荧光染料，直接由医检人员对各类血细胞观察标记、分类计数。
缺点：人工检测成本高、效率低下，无法满足医疗需求；受限于显微镜的狭窄视野，无法对大样本血样同时观察计数；需借助染料染色，对细胞造成不可逆伤害。
②、库尔特计数法：
原理：利用血细胞通过充满电解液的小孔管时，由于排开了相同体积的电解液而导致小孔管内外两电极间电阻变化而产生电位脉冲，通过处理直流阻抗-射频阻抗等信息来检测血细胞直径、表面形貌等信息，进而对通过的血细胞进行分类计数。
缺点：设备体积庞大，价格昂贵，不能便携，内部结构复杂不易小型化；对于细胞回流、孔间徘徊、粘连等情况的分辨处理能力不佳。
③、流式细胞术
原理：利用光散射理论，通过检测细胞的前向散射特征、侧向散射特征以及荧光特征等，对处于快速直线运动中的细胞进行逐个、多参数的快速定性、定量分析及分选。
缺点：价格昂贵，设备维护成本高，仪器内血样流路繁复、光路复杂。
④、图像分析法
原理：将显微镜和图像处理技术相结合，利用图像处理技术进行自动检测。
缺点：对样品和图像质量要求较高，往往需要对样品进行繁琐的预处理；受限于显微镜捕获图像时的视野，包含样品量较低，引入的偶然误差较大。
作为一种新兴的成像手段，数字全息成像技术完美继承了图像处理方法灵活的处理方法的同时，还基于自身特点规避了上述方法中诸多缺陷。数字全息是一种精度可达微米级别的成像方法，可由ccd等光学元器件直接记录获取样本图像，光路极其精简，易于集成和小型化。同时其具有全视场、非接触、无损伤、实时性、定量化的优点。加之无需对样本染色即可清晰成像，故特别适合于活体生物样品的定量三维重建和快速跟踪，得以在生物医学应用领域尤其是细胞培养观测中发展迅速。此外由于全息图视野直接对应于光学元器件的尺寸，所以全息图具有得天独厚的大视野成像的优点。在同时能够对微米级别物体准确成像的基础上，全息图视野下所记录的物体信息远丰富于常规光学显微镜。因此一次成像可涵盖较大体积的血液样液，计数样本的增大降低了偶然因素引入的误差，有助于使用过量稀释的方法减少细胞粘连、增加散布距离。
目前借助数字全息图重建方法对细胞等微观生物体分类、计数、跟踪观察的应用近年来多有见报，但其目标物体种类往往单一，同时物体尺寸往往大至十余甚至数十、上百微米(如大草履虫、血吸虫、变形虫等)，不契合血常规检测中血细胞的分布特征。
以男性正常成年人血样为例，其红细胞、白细胞与血小板浓度与主要尺寸参考值为：
红细胞(6-8um)4.3-5.8×1012/l
白细胞(10-20um)3.5-9.5×109/l
血小板(2-4um)100-300×109/l
其中红细胞分布密度最大，高出血小板密度1个数量级、白细胞密度3个数量级，故可通过将血样稀释至一个合适的计数浓度对红细胞单独计数。此时白细胞与血小板由于与红细胞数量差异显著，干扰因素相对很弱，并可根据面积、圆形度等特征加以识别剔除。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于全息成像的红细胞多项生理参数的检测方法，用于对待检测血样中红细胞的红细胞数(rbc)、红细胞压积(hct)、平均红细胞体积(mcv)、红细胞体积分布宽度cv(rdw-cv)、红细胞体积分布宽度sd(rdw-sd)等多项生理参数的测量；此外该方法还可计算红细胞的圆形度，借助形态信息进一步用于地中海贫血症的检测。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于全息成像的红细胞多项生理参数的检测方法，首先使用半窗长重建的方法将大幅红细胞全息图分块重建，通过区分细胞与背景进而对应进行增强或平滑处理。然后再次对整幅重建图进行分块，使用对数正态分布曲线拟合各重建图像素灰度曲线，根据曲线曲率设置灰度阈值提取红细胞区域，并通过形态学手段进一步精确细胞分布，仍将各块拼接整合为整幅图像。之后计算整幅图像所有红细胞区域中各像素点距离背景的最短欧氏距离作为该区域的形态学距离分布，依据形态学距离分布的极值点进行粘连细胞的辨认，并完成红细胞数量、面积统计。最后将独立红细胞的数量、面积等参数结合样液的稀释倍数、成像所用样液体积等，计算整合得到血样中红细胞的各项生理指标参数。
该方法具体包括以下步骤：
s1：制备血液稀释样液，使用细胞缓冲液或生理盐水，将血样稀释至目标倍数t；通过全息成像装置获取记录有血细胞衍射信息的全息图，并进行预处理；
s2：设置分块尺寸，将全息图进行分块处理，提取有效成像区域，用于后续半窗长分块重建；
s3：对两次分得全息图块分别重建，对细胞与背景加以区分，分别增强或平滑，并拼接整合为一整幅重建图；
s4：沿用分块尺寸l，对整幅重建图rec再次分块；对所分得图块进行像素灰度统计，使用对数正态分布函数拟合灰度曲线，并设置灰度阈值提取红细胞的可能区域；
s5：将各块红细胞区域提取，拼接整合成为整幅图像；使用形态学手段，将红细胞区域进一步精确；
s6：对所得各连通域内像素进行形态学距离计算，依据形态学距离极值点分布对粘连细胞加以去粘连处理，并对红细胞数量进行累加；
s7：结合样液体积与稀释倍数，计算上述步骤所得红细胞各生理参数项。
进一步，所述步骤s1具体包括：
将全息图从rgb彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
gray(i,j)＝0.229×r(i,j)+0.587×g(i,j)+0.114×b(i,j)
其中i、j为行列坐标，r、g、b分别为三原色中红、绿、蓝通道信息。
进一步，所述步骤s2具体包括以下步骤：
s21：设置图像块分块边长l；
s22：第一次图像分块；
整幅图像行、列值分别为m和n，单位为像素pixel；对应整除取其行、列所能排布的最大图像块个数row和col：
row＝m|l
col＝n|l
取整幅图像中心row×l行、col×l列区域，即区域较原图上、下留有(m-row×l)/2行，左、右留有(n-row×l)/2列无效区域，进行边长为l的平铺分块；
s23：第二次图像分块；
对于上述步骤所得区域，以其最左上角的图像块中心位置为第二次图像分块起始点，仍进行边长为l的图像分块，超出区域边界的块不予记录；
两次分块所得结果应互有四分之一部分的交叠，第一次分块分得row×col个图像块，第二次分块分得(row-1)×(col-1)个图像块。
进一步，所述步骤s3具体包括以下步骤：
s31：使用卷积重建法，对s22和s23两次分块所分得全息图块进行重建，并分别拼接整合成为两幅整幅图像；
s32：将两幅图像对应重叠部分取出，记为rec1和rec2；
s33：遍历rec1与rec2，对其中对应位置像素点加以判断，将其归类于表征物体与表征背景；并将两幅图像整合为一幅图像rec；
具体判断方法如下：
①、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)同时大于图像灰度级level的二分之一，则该坐标(i,j)像素点用以表征背景；
rec(i,j)＝max(rec1(i,j),rec2(i,j))
②、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)同时小于图像灰度级level的二分之一，则该坐标(i,j)像素点用以表征物体；
rec(i,j)＝min(rec1(i,j),rec2(i,j))
③、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)数值分跨图像灰度级level的二分之一，则根据两者灰度值距level/2的灰度差加以判断；
进一步，步骤s31中，所述的卷积重建法具体包括：
卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
其中，
r(x,y)＝exp[-ima·k(xsinα+ysinβ)]
其中，k＝2π/λ，α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅可以表示为如下卷积形式：
其中，g为自由空间脉冲响应；
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
u＝ft-1[ft(h·c)·ft(g)]
进一步，所述步骤s4具体包括以下步骤：
s41：使用分块尺寸l，对整合后重建图rec进行分块，共分得(row-1)×(col-1)块重建图块，每一独立重建图像块记为rec；
s42：统计重建图像块rec灰度分布直方图，记录在一维数组data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
其中，x表示记录的图像灰度信息，对应于data；μ为分布的数学期望，σ为分布的方差，两者需要经过非线性拟合方可得以确定。
拟合函数各点数值：f(x)，x＝1,2,…,level；计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标即灰度作为灰度阈值thr；
一阶导数：
dy(x)＝f(x+1)-f(x)
二阶导数：
d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
曲率：
s43：依据灰度阈值thr将图像块进行二值化处理，得到红细胞可能区域的二值图recbw；
进一步，所述步骤s5具体包括以下步骤：
s51：将经过s43二值化处理的图像块加以拼接，得到整图对应有效区域的重建图中红细胞的可能区域；
s52：使用形态学滤波的方法，去除像素点数少于9个的连通域，更小的物体非红细胞；
s53：使用形态学滤波的方法，去除像素点多于100个的连通域，更大的物体为气泡、杂物；
进一步，所述步骤s6具体包括以下步骤：
s61：构建与rec尺寸等大的矩阵dis，记录连通域各点形态学距离；计算各独立连通域内所含各点距离最近背景区域的欧式距离dis(i,j)；
其中(i,j)为连通域内像点坐标，(i0,j0)为与(i,j)平面距离最近的像点坐标；
s62：统计一个连通域中形态学距离极值点的分布个数，记为num；若num＝1，则该连通域由一个单独的红细胞形成；若num>1，则该连通域存在红细胞粘连，并且粘连的细胞个数为num；
s63：对于整合后重建图中，共有p个连通域，每个连通域形态学距离极值点个数构成集合{num1,num2,…,nump}，加以记录用于红细胞计数；
s64：对于上述p个连通域共检测出q个红细胞，记录每个红细胞占用像素点个数pixel；对于某一连通域，若num>1，即该连通域存在红细胞粘连的情况，其对应所含各个细胞面积均分连通域占用像元个数；每个红细胞占用像元个数构成集合{pixel1,pixel2,…,pixelq}，加以记录用于红细胞面积或体积计算。
进一步，步骤s7中所述的计算红细胞各生理参数项具体包括：
s71：计算红细胞数量rbc；
统计成像区域内红细胞总数rbc，即s64步骤中q值；
结合血液样液稀释倍数t与成像区域对应样液体积v，即ccd尺寸m、n与液体腔室厚度h的乘积，单位：um3，换算得到血样中红细胞数rbc；
s72：计算红细胞平均体积mcv；
计算所有成像红细胞占用像元总数pixel，
结合成像像元边长尺寸sizeccd，计算所有成像红细胞实际投影面积area，
红细胞平均厚度mct结合area计算得到红细胞平均体积mcv，
s73：计算红细胞压积hct；
hct反应红细胞体积占据血样体积的百分比，结合血样样液稀释倍数t与成像区域对应样液体积v，计算得到血样中红细胞压积hct；
s74：计算红细胞体积分布rdw-sd：
rdw-sd反应的是个体红细胞间体积分布差异的标准，结合统计得到的成像区域红细胞数量rbc、先验mct以及红细胞占据像元数量集合，计算得到红细胞体积分布rdw-sd；
s75：计算红细胞体积分布rdw-cv；
rdw-cv反应的是个体红细胞间体积分布差异的变异系数，结合rdw-sd与mcv，计算得到红细胞体积分布rdw-cv；
s76：计算红细胞平均圆形度rd；
对于s6中各连通域，设共存在r个独立无红细胞粘连区域，仅使用这部分连通域进行圆形度rd的计算统计，对于某一无红细胞粘连连通域，其圆形度c计算方法如下：
其中，pn为红细胞或连通域周长，即最外层像素点个数；an为红细胞或连通域面积，即占据像素点数量；
则样液中红细胞平均圆形度rd计算如下：
本发明的有益效果在于：本发明不仅能检测血样中红细胞的红细胞数(rbc)、红细胞压积(hct)、平均红细胞体积(mcv)、红细胞体积分布宽度cv(rdw-cv)、红细胞体积分布宽度sd(rdw-sd)等多项生理参数；还能计算红细胞的圆形度，借助形态信息可进一步用于地中海贫血症的检测。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明所述的红细胞多项生理参数检测方法流程图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
图1为基于全息成像的红细胞生理参数检测方法流程图，如图1所示，该方法具体包括以下步骤：
s1：制备血液稀释样液，使用细胞缓冲液或生理盐水，将血样稀释至目标倍数t；通过全息成像装置获取记录有血细胞衍射信息的全息图，并进行预处理；
将全息图从rgb彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
gray(i,j)＝0.229×r(i,j)+0.587×g(i,j)+0.114×b(i,j)
其中i、j为行列坐标，r、g、b分别为三原色中红、绿、蓝通道信息。
s2：设置分块尺寸，将全息图进行分块处理，提取有效成像区域，用于后续半窗长分块重建；
s21：设置图像块分块边长l；
鉴于重建算法使用的是卷积重建法，运算主要涉及傅里叶变换，而长度为2的整数次幂的信号最宜进行快速傅里叶变换；实验验证能够良好成像的重建边长取256或512，考虑到较小的分块形成的块间差异较为微弱，推荐取l＝256。
s22：第一次图像分块；
整幅图像行、列值分别为m和n，单位为像素pixel；对应整除取其行、列所能排布的最大图像块个数row和col：
row＝m|l
col＝n|l
取整幅图像中心row×l行、col×l列区域，即区域较原图上、下留有(m-row×l)/2行，左、右留有(n-row×l)/2列无效区域，进行边长为l的平铺分块；
s23：第二次图像分块；
对于上述步骤所得区域，以其最左上角的图像块中心位置为第二次图像分块起始点，仍进行边长为l的图像分块，超出区域边界的块不予记录；
两次分块所得结果应互有四分之一部分的交叠，第一次分块分得row×col个图像块，第二次分块分得(row-1)×(col-1)个图像块。
s3：对两次分得全息图块分别重建，对细胞与背景加以区分，分别增强或平滑，并拼接整合为一整幅重建图；
s31：使用卷积重建法，对s22和s23两次分块所分得全息图块进行重建，并分别拼接整合成为两幅整幅图像；
卷积重建法具体包括：
卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
其中，
r(x,y)＝exp[-ima·k(xsinα+ysinβ)]
其中，k＝2π/λ，α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅可以表示为如下卷积形式：
其中，g为自由空间脉冲响应；
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
u＝ft-1[ft(h·c)·ft(g)]
具体的，对于稀释样液，红细胞沉降速率很快，均位于腔室底部。故设置腔室底部距离ccd面距离为重建距离，进行单层重建即可良好的还原细胞形态。
s32：将两幅图像对应重叠部分取出，记为rec1和rec2；
s33：遍历rec1与rec2，对其中对应位置像素点加以判断，将其归类于表征物体与表征背景；并将两幅图像整合为一幅图像rec；
具体判断方法如下：
①、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)同时大于图像灰度级level的二分之一(通常图像level＝256，也即128)，则该坐标(i,j)像素点用以表征背景；
rec(i,j)＝max(rec1(i,j),rec2(i,j))
②、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)同时小于图像灰度级level的二分之一，则该坐标(i,j)像素点用以表征物体；
rec(i,j)＝min(rec1(i,j),rec2(i,j))
③、如果rec1(i,j)与rec2(i,j)数值分跨图像灰度级level的二分之一，则根据两者灰度值距level/2的灰度差加以判断；
s4：沿用分块尺寸l，对整幅重建图rec再次分块；对所分得图块进行像素灰度统计，使用对数正态分布函数拟合灰度曲线，并设置灰度阈值提取红细胞的可能区域；
s41：使用分块尺寸l，对整合后重建图rec进行分块，共分得(row-1)×(col-1)块重建图块，每一独立重建图像块记为rec；
s42：统计重建图像块rec灰度分布直方图，记录在一维数组data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
其中，x表示记录的图像灰度信息，对应于data。μ为分布的数学期望，σ为分布的方差，两者需要经过非线性拟合方可得以确定。
拟合函数各点数值：f(x)，x＝1,2,…,level；计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标即灰度作为灰度阈值thr；
一阶导数：
dy(x)＝f(x+1)-f(x)
二阶导数：
d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
曲率：
s43：依据灰度阈值thr将图像块进行二值化处理，得到红细胞可能区域的二值图recbw；
s5：将各块红细胞区域提取，拼接整合成为整幅图像；使用形态学手段，将红细胞区域进一步精确；
s51：将经过s43二值化处理的图像块加以拼接，得到整图对应有效区域的重建图中红细胞的可能区域；
s52：人类红细胞直径分布为4um至9um，6um至8um最为多见。以实验使用的ccd为例，像元尺寸为1.4um×1.4um，取人类红细胞直径最小值对应像素点个数应为3×3，即9个像素。使用形态学滤波的方法，去除像素点数少于9个的连通域，更小的物体非红细胞；
s53：使用显微镜对稀释的血液样液进行观测，发现对于红细胞的结团情况，多见2、3个细胞粘连，少见4、5个细胞粘连，未有更多血细胞粘连的情况出现。使用形态学滤波的方法，去除像素点多于100个的连通域，更大的物体为气泡、杂物；
s6：对所得各连通域内像素进行形态学距离计算，依据形态学距离极值点分布对粘连细胞加以去粘连处理，并对红细胞数量进行累加；
s61：构建与rec尺寸等大的矩阵dis，记录连通域各点形态学距离；计算各独立连通域内所含各点距离最近背景区域的欧式距离dis(i,j)；
其中(i,j)为连通域内像点坐标，(i0,j0)为与(i,j)平面距离最近的像点坐标；
s62：统计一个连通域中形态学距离极值点的分布个数，记为num；若num＝1，则该连通域由一个单独的红细胞形成；若num>1，则该连通域存在红细胞粘连，并且粘连的细胞个数为num；
s63：对于整合后重建图中，共有p个连通域，每个连通域形态学距离极值点个数构成集合{num1,num2,…,nump}，加以记录用于红细胞计数；
s64：对于上述p个连通域共检测出q个红细胞，记录每个红细胞占用像素点个数pixel；对于某一连通域，若num>1，即该连通域存在红细胞粘连的情况，其对应所含各个细胞面积均分连通域占用像元个数；每个红细胞占用像元个数构成集合{pixel1,pixel2,…,pixelq}，加以记录用于红细胞面积或体积计算。
s7：结合样液体积与稀释倍数，计算上述步骤所得红细胞各生理参数项。
s71：计算红细胞数量rbc；
统计成像区域内红细胞总数rbc，即s64步骤中q值；
结合血液样液稀释倍数t与成像区域对应样液体积v，即ccd尺寸m、n与液体腔室厚度h的乘积，单位：um3，换算得到血样中红细胞数rbc；
s72：计算红细胞平均体积mcv；
计算所有成像红细胞占用像元总数pixel，
结合成像像元边长尺寸sizeccd，计算所有成像红细胞实际投影面积area，
红细胞平均厚度mct一般为2.1um，结合area计算得到红细胞平均体积mcv，
s73：计算红细胞压积hct；
hct反应红细胞体积占据血样体积的百分比，结合血样样液稀释倍数t与成像区域对应样液体积v，计算得到血样中红细胞压积hct；
s74：计算红细胞体积分布rdw-sd：
rdw-sd反应的是个体红细胞间体积分布差异的标准，结合统计得到的成像区域红细胞数量rbc、先验mct以及红细胞占据像元数量集合，计算得到红细胞体积分布rdw-sd；
s75：计算红细胞体积分布rdw-cv；
rdw-cv反应的是个体红细胞间体积分布差异的变异系数，结合rdw-sd与mcv，计算得到红细胞体积分布rdw-cv；
s76：计算红细胞平均圆形度rd；
对于s6中各连通域，设共存在r个独立无红细胞粘连区域，仅使用这部分连通域进行圆形度rd的计算统计，对于某一无红细胞粘连连通域，其圆形度c计算方法如下：
其中，pn为红细胞或连通域周长，即最外层像素点个数；an为红细胞或连通域面积，即占据像素点数量；
则样液中红细胞平均圆形度rd计算如下：
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。