本发明涉及属于角膜解剖技术领域，具体涉及一种三维打印技术在角膜缘组织体外三维建模中的应用。
背景技术：
角膜缘是角膜和巩膜的移行区，宽约1毫米，其解剖结构从上到下依次为上皮细胞层和基质层。其中上皮细胞层为10余层排列不规则的小圆柱状细胞，位于基底部的部分上皮细胞向下突出伸入基质，同时基质呈指突状伸入上皮层内，形成上皮-基质交错排列的vogt栅栏结构(vogtpalisades)。角膜缘干细胞分布于vogt栅栏结构的基底层细胞中，是具有自我更新并定向分化为角膜上皮细胞能力的成体干细胞，它是维持角膜上皮细胞正常更新的重要保障，一旦其功能失代偿(例如角膜化学伤等)，将会导致角膜反复上皮糜烂、感染、穿孔等严重并发症。角膜缘干细胞失代偿的治疗非常棘手，其原因在与对角膜缘干细胞微环境的解剖结构、功能重建尚未完全了解。
基于角膜缘的重要机构和功能，如果能通过生物三维打印技术重建角膜缘的显微结构，用于角膜缘干细胞的体外培养，对深入认识角膜缘干细胞的结构和功能，进而作为模型揭示角膜缘干细胞的微环境调控机制，从而对治疗角膜缘干细胞失代偿这类疾病具有重要意义。
目前，尚未有技术能在体外模拟角膜缘组织的三维数字结构。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种三维打印技术在角膜缘组织体外三维建模中的应用。该应用方法是通过对角膜缘标本行连续组织切片、染色并通过高倍显微镜采集高清显微图像，然后将这些连续的二维切片图像通过计算机数字化，进而重建真实的人类角膜缘三维结构，可以显示角膜缘上皮细胞层、基质层、vogt栅栏结构等的整体形象。
为实现上述目的，本发明所设计一种三维打印技术在角膜缘组织体外建立三维结构数字化模型中的应用。
本发明还提供了一种基于三维打印技术体外建立角膜缘组织的三维结构数字化模型的方法，包括以下步骤：
1)标本固定
选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，将标本置于固定液中固定；
2)组织包埋及切片
a.将标本用滤纸包裹好后，首先放入乙醇中脱水，然后浸入二甲苯i中，再浸入二甲苯ii中直至透明；
b.将标本放入电烤炉的液体蜡i中透蜡，再在液体蜡ii中透蜡；将标本取出放入包埋框中，待蜡油固定后放入水中冷却成形，修整蜡块，以垂直于角膜做连续切片，将裱好的切片置于染色架上并依次编号；
3)he染色
a.以每间隔2张的顺序选取编号为1、4、7、10、14……的切片，放入烤箱中烘烤；
b.将上述所有切片(包括烘烤的切片和未烘烤的切片)依次放入二甲苯i和二甲苯ii液中浸泡，然后置于乙醇中浸泡，再用水冲洗；
c.首先将切片浸入苏木素染液中，水冲洗；然后浸入盐酸乙醇中，水冲洗；再氨水返蓝，水冲洗；浸入伊红溶液中，水冲洗；
d.首先将切片浸入乙醇中脱水，然后依次放入二甲苯i和二甲苯ii中透明化，再中性树胶封固切片标本并按序号依次排列；角膜缘组织在he染色下表现为：上皮细胞层内的细胞胞核呈深蓝色，胞浆呈紫红色，基质层内的胶原纤维呈淡粉红色。
4)图像采集、数字化和三维重建
a.光学显微镜下观察he染色后的角膜缘结构，通过40倍视野找到角膜缘，利用相关照相软件采集每张切片的原图并依次编号；40倍视野照片中含角膜和角膜缘组织，由于低倍镜下每张照片中角膜的大体形态较为一致，所以通过角膜重合将每张照片按顺序对齐，然后在角膜缘组织旁边画一个三角形作为定位的标准轴，这个三角从第一张到最后一张的位置必须一致。
b.将光学显微镜转换成200倍视野，重新采集每张切片的角膜缘组织图像并依次编号；由于高倍镜下无法采集角膜缘组织的完整显微照片，只需保证每张照片上有角膜缘的上皮细胞层及下方的部分基质层。
c.通过adobephotoshop软件将40倍视野照片放大5倍作为比照，在同一切片的200倍视野照片上的相同部位画上三角形；
d.以上述三角形作为定位标准轴，将所有200倍视野照片旋转对齐后重新裁剪，并以tiff文件格式保存，保证所有照片的三角都在同一位置；
e.按顺序将裁剪后的图片导入unigraphicsnx软件，将每张图片上的上皮细胞层和基质层的边界描绘出来，选择重建的层厚，以此层厚将保存的草图进行等间距分开，通过unigraphicsnx将草图按照顺序进行三维重建，得到角膜缘组织的三维结构数字化模型。
进一步地，所述步骤2)第a小步中，标本酒精脱水具体方法为：将标本依次放入体积分数为75％、85％、95％和100％的乙醇中各脱水4h。
再进一步地，技术体外建立角膜缘组织的三维结构数字化模型的方法，其特征在于：所述步骤2)第b小步中，切片的数量为80～200片，切片厚度为3～6μm。
再进一步地，所述步骤3)第b小步中，切片浸泡具体方法为：将切片依次放入体积分数为100％、95％和85％的乙醇中各1分钟浸泡。
再进一步地，所述步骤3)第c小步中，盐酸乙醇的质量分数为1～3％，伊红溶液质量分数为0.1～1.0％。
再进一步地，所述步骤3)第d小步中，将切片依次放入体积分数为75％、85％、95％和100％的乙醇中各脱水1～2min。
再进一步地，所述步骤4)第e小步中，unigraphicsnx软件中的层厚调整为9*200＝1800μm＝1.8mm(由于本发明采用组织连续切片，切片层厚3μm，每间隔三张选取切片拍照，因此实际重建的层厚为9μm，加上200倍视野照片的放大效应，所以在unigraphicsnx软件中的层厚需调整为9*200＝1800μm＝1.8mm)。
本发明的有益效果：
1.本发明重建的角膜缘三维立体图能够显示人角膜缘组织的显微结构，从而表明本发明采集切片染色后高清显微组织图像，进行三维数字重建的方法是具体可行的。
2.本发明解决了组织在连续切片后固定于载玻片的过程中由于存在平面上的旋转导致高倍视野下的显微照片难以重合对位的缺点，通过在40倍视野下的切片图像中选择好定位三角，然后在200倍视野下的切片图像中复制该三角，并以此三角作为标准轴用于连续高倍视野照片的重合对位和裁剪。本发明方法结合了低倍镜下相邻组织图像容易对位和高倍镜下的组织图像更加清晰的优点，并且简单实用，也可用于其它组织的显微结构三维重建。
3.本发明可以为角膜缘干细胞的研究提供有关组织学、解剖学等方面的数字化信息，作为将来三维打印技术体外重建角膜缘组织的基础模型。
附图说明
图1为角膜缘标本的三维结构数字化模型图；
图2为角膜缘标本的组织切片he染色原图，40x。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都科适用于本发明以下方案的实施。
本发明需要的设备和材料有：手术显微镜、显微手术器械、石蜡切片机，均由购于市场提供；光学显微镜为厦门moticba600型，配备moticam显微镜摄像头和motic数字切片扫描与应用系统软件。
本发明中涉及到的试剂及工作液的配制：固定液由无水乙醇60ml、体积分数10％中性甲醛10ml、冰醋酸10ml、氯仿20ml混匀组成，其它he染色中所用的无水乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、氨水等均为国产常规试剂。
如图1～2所示的基于三维打印技术体外建立角膜缘组织的三维结构数字化模型的方法，包括以下步骤：
1)标本固定
选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，将标本置于固定液中固定；
2)组织包埋及切片
a.将标本用滤纸包裹好后，首先将标本依次放入体积分数为75％、85％、95％和100％的乙醇中各脱水4h；然后浸入二甲苯i中，再浸入二甲苯ii中直至透明；
b.将标本放入电烤炉的液体蜡i中透蜡，再在液体蜡ii中透蜡；将标本取出放入包埋框中，待蜡油固定后放入水中冷却成形，修整蜡块，以垂直于角膜做连续切片100片，切片厚度为3μm，将裱好的切片置于染色架上并依次编号；
3)he染色
a.以每间隔2张的顺序选取编号为1、4、7、……94、97的切片，放入温度为60℃烤箱中烘烤30min；
b.将上述所有切片(包括烘烤的切片和未烘烤的切片)依次放入二甲苯i和二甲苯ii液中浸泡，然后将切片依次放入体积分数为100％、95％和85％的乙醇中各1分钟浸泡脱，再分别用自来水及蒸馏水冲洗；
c.首先将切片浸入苏木素染液中，水冲洗；然后浸入质量分数为1％盐酸乙醇中，水冲洗；再氨水返蓝，水冲洗；浸入质量分数为0.5％伊红溶液中5分钟，水冲洗；
d.首先切片依次放入体积分数为75％、85％、95％和100％的乙醇中各脱水1～2min；然后依次放入二甲苯i和二甲苯ii中透明化，再中性树胶封固切片标本并按序号依次排列；角膜缘组织在he染色下表现为：上皮细胞层内的细胞胞核呈深蓝色，胞浆呈紫红色，基质层内的胶原纤维呈淡粉红色。
4)图像采集、数字化和三维重建
a.光学显微镜下观察he染色后的角膜缘结构，通过40倍视野找到角膜缘，利用相关照相软件采集每张切片的原图并依次编号；40倍视野照片中含角膜和角膜缘组织，由于低倍镜下每张照片中角膜的大体形态较为一致，所以通过角膜重合将每张照片按顺序对齐，然后在角膜缘组织旁边画一个三角形作为定位的标准轴，这个三角从第一张到最后一张的位置必须一致。
b.将光学显微镜转换成200倍视野，重新采集每张切片的角膜缘组织图像并依次编号；由于高倍镜下无法采集角膜缘组织的完整显微照片，只需保证每张照片上有角膜缘的上皮细胞层及下方的部分基质层。
c.通过adobephotoshop软件将40倍视野照片放大5倍作为比照，在同一切片的200倍视野照片上的相同部位画上三角形；
d.以上述三角形作为定位标准轴，将所有200倍视野照片旋转对齐后重新裁剪，并以tiff文件格式保存，保证所有照片的三角都在同一位置；
e.按顺序将裁剪后的图片导入unigraphicsnx软件，将每张图片上的上皮细胞层和基质层的边界描绘出来，选择重建的层厚，unigraphicsnx软件中的层厚调整为9*200＝1800μm＝1.8mm，以此层厚将保存的草图进行等间距分开，通过unigraphicsnx将草图按照顺序进行三维重建，得到角膜缘组织的三维结构数字化模型。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。