微波炮制狗脊的在线评价方法和应用与流程

本发明涉及中药制备方法质量分析领域，特别是涉及微波炮制狗脊的在线评价方法和快速确定微波炮制狗脊工艺参数的方法。

背景技术：

狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊cibotiumbaronetz(l.)j.sm.干燥根茎，具有补肝肾、强筋骨、舒经络、除湿痛的功效。自古以来其炮制品有砂烫狗脊、蒸狗脊、酒狗脊和盐狗脊等。2015年版《中华人民共和国药典》收载了狗脊及烫狗脊两个炮制品种。传统炮制烫狗脊的方法为取洁净河砂置炒制容器内，用武火加热至滑利状态时，投入生狗脊片，不断翻动，炒至表面鼓起，除去残余绒毛。狗脊经砂烫后质地变得疏松，便于粉碎和煎出有效成分，外观性状上表现为颜色明显加深。按照2015年版《中华人民共和国药典》一部规定，烫狗脊饮片按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.020％。据文献报道，5-羟甲基糠醛有较好的抗氧化及心血管系统作用，经砂烫炮制后，原儿茶酸、5-羟甲基糠醛的含量均有不同程度的增加，其补肝肾作用增强。

微波炮制的原理是利用高频电磁波以一定的高频率振荡穿透物品，使物品内的极性分子(比如水，蛋白质)被吸引共振，从而相互碰撞产生大量的热量，并在药材的内外同时发生发热过程，最终达到炮制的目的。这种新型炮制方法相较传统砂烫法，具有炮制饮片洁净度高、工艺指标可量化，操作方便、效率高、节约能源与成本、降低污染、便于工业化自动化生产等优点，虽然微波炮方法目前已应用在一些中药炮制过程中，但目前尚无采用微波技术炮制烫狗脊的相关报道。

而且，已报道的微波炮制方法进行中药炮制工艺的评价方法多为经验观察法，对微波炮制过程中关键参数的确定带有主观性，工艺指标难以量化，对工艺参数考察时，研究周期较长，花费的资源和时间成本较高。而现代质量评价方法如高效液相色谱法、电泳法、代谢组学、分子生物学等均具有样品处理复杂、成本高、结果反馈不及时等缺点。在线监控技术有近红外光谱技术，但其前期建模所需样品量较多。

专利cn110261323a为本申请人曾报道过的狗脊炮制工艺的在线评价方法，以炮制品与基准炮制品的色差δe为指标，对传统方法炮制的狗脊的质量进行在线评价，提高了检测的时效性。然而，该方法需根据原儿茶酸、原而茶醛、5-羟甲基糠醛的含量计算综合评价值，并根据最大值确定最优制品，然后还要计算基准炮制品和炮制品的色差，造成评价方法复杂繁琐。

技术实现要素：

基于此，本发明提供一种微波炮制狗脊的在线评价方法，建立了狗脊炮制品中指标成分含量与其色度值l、a之间的相关性，便于快速确定微波炮制狗脊工艺参数，所述评价方法具有量化指标，避免人工判断的主观性和不确定性，同时精简操作、处理样品简单、效率高、成本低、结果反馈及时。

具体技术方案为：

一种微波炮制烫狗脊的在线评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取待测炮制品的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478；

当0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，判断所述待测炮制品制品质量合格。

在一些优选的实施方式中，当0.325≤y1≤0.686且0.325≤y2≤0.686时，判断所述待测炮制品制品质量优异。

在一些优选的实施方式中，获取待测炮制品的色度值l和a的方法为：

以d65光源作为光源，以白色作为背景，拍照，获得所述待测炮制品的图像；

通过软件读取所述图像的色度值l和a。

在一些优选的实施方式中，所述拍照设备为canoneos77d照相机。

在一些优选的实施方式中，所述软件为adobephotoshop6.0。

在一些优选的实施方式中，所述微波炮制狗脊的方法包括以下步骤：

取生狗脊药材，于400w～600w的功率下，微波炮制6min～16min。

本发明还提供一种快速确定微波炮制狗脊工艺参数的方法。

具体技术方案为：

一种快速确定微波炮制狗脊工艺参数的方法，包括以下步骤：

于不同工艺参数下，对狗脊进行微波炮制，得若干炮制品；

获取若干所述炮制品的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478；

当0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，记录相应的工艺参数，即为标准工艺参数。

在一些优选的实施方式中，当0.325≤y1≤0.686且0.325≤y2≤0.686时，记录相应的工艺参数，即为指标工艺参数。

在一些优选的实施方式中，获取若干所述炮制品的色度值l和a的方法为：

以d65光源作为光源，以白色作为背景，拍照，获得若干所述炮制品的图像；

通过软件读取所述图像的色度值l和a。

在一些优选的实施方式中，所述拍照设备为canoneos77d照相机。

在一些优选的实施方式中，所述软件为adobephotoshop6.0。

在一些优选的实施方式中，所述微波炮制狗脊的方法包括以下步骤：

取生狗脊药材，于400w～600w的功率下，微波炮制6min～16min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种微波炮制狗脊的在线评价方法，建立了狗脊炮制品中指标成分含量与其色度值l、a之间的相关性，便于快速确定微波炮制狗脊工艺参数，所述评价方法具有量化指标，避免人工判断的主观性和不确定性，同时精简操作、处理样品简单、效率高、成本低、结果反馈及时。

可通过上述在线评价方法，确定微波炮制功率和炮制时间等工艺参数，简化考察其工艺参数的过程，并加快狗脊炮制品的检测速度，是一种狗脊炮制品的质量控制的有效手段。

附图说明

图1为混合对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图；

图2为微波炮制烫狗脊炮制品中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量分布图；

图3为狗脊、砂烫狗脊和微波炮制烫狗脊炮制品的图像。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

目前，已报道的微波炮制方法进行中药炮制工艺的评价方法多为经验观察法，对微波炮制过程中关键参数的确定带有主观性，工艺指标难以量化，对工艺参数考察时，研究周期较长，花费的资源和时间成本较高。而现代质量评价方法如高效液相色谱法、电泳法、代谢组学、分子生物学等均具有样品处理复杂、成本高、结果反馈不及时等缺点。在线监控技术有近红外光谱技术，但其前期建模所需样品量较多。

专利cn110261323a为本申请人曾报道过的狗脊炮制工艺的在线评价方法，以炮制品与基准炮制品的色差δe为指标，对传统方法炮制的狗脊的质量进行在线评价，提高了检测的时效性。然而，该方法需根据原儿茶酸、原而茶醛、5-羟甲基糠醛的含量计算综合评价值，并根据最大值确定最优制品，然后还要计算基准炮制品和炮制品的色差，造成评价方法复杂繁琐。

基于此，本发明提供一种微波炮制狗脊的在线评价方法和快速确定微波炮制狗脊工艺参数的方法。具体如下：

1仪器

型号为eg823mf3-nw的微波炉、型号为canoneos77d的照相机、型号为waterse2695高效液相色谱仪、安捷伦zorbaxsb-c18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)

2狗脊炮制品的制备

2.1传统砂烫炮制

参照2015年版《中华人民共和国药典》炮制通则，取生狗脊饮片，将洁净河砂置炒制容器内，用武火加热至滑利状态时(红外测温仪测定温度为200℃)，投入生狗脊片，不断翻动，砂烫至表面鼓起、颜色呈棕褐色，取出，筛去河砂，放凉，除去残存绒毛。

2.2微波炮制

取大小、厚薄均匀的生狗脊饮片，适当破碎，过3.0cm筛网。取规格相近的狗脊碎块，共11份，约50g，置于托盘内，于500w(中高火)功率下，在微波炉内进行微波炮制，炮制时间分别为0min、2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、20min、24min，得到11份烫狗脊炮制品，同时采用红外测温仪测定样品取出时的温度。

比较两种炮制方法中原儿茶酸含量、炮制品颜色和性状，结果如表1所示。

表1

注：药典规定本品按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.2mg·g^-1

由表1可知，狗脊微波炮制品在6～16min之内表面鼓起或轻微裂开、外观颜色呈浅棕褐色或棕褐色，原儿茶酸含量不低于0.2mg·g^-1，饮片的性状变化，指标成分含量均符合药典要求，且与传统砂烫制品接近。

3指标成分的含量测定

本发明以原儿茶酸和5-羟甲基糠醛作为指标成分进行试验。

3.1对照品溶液的制备

取原儿茶酸对照品和5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸溶液(70:30)制成每1ml含原儿茶酸100μg、5-羟甲基糠醛30μg的混合对照品溶液。

3.2供试品溶液的制备

分别取上述11份烫狗脊炮制品(过三号筛)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-1％冰醋酸溶液(70:30)25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇-1％冰醋酸溶液(70:30)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得11份供试品溶液。

3.3色谱条件

安捷伦zorbaxsb-c18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-1％冰醋酸溶液(5:95)；流速0.8ml·min^-1；柱温30℃；检测波长260nm；进样量10μl。理论塔板数按原儿茶酸计算，不低于3000。

3.4线性关系考察及含量的测定

分别精密量取“3.1”项下混合对照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按“3.3”项下色谱条件测定，其中一个混合对照品溶液的色谱图如图1a所示。以各成分峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)进行回归，结果见表2，可知各成分线性关系良好。

表2

取“3.2”项下的11份供试品溶液，按“3.3”项下色谱条件测定，其中一个供试品溶液的色谱图如图1b所示，分别将峰面积代入到表1中相应的回归方程中，得到11份烫狗脊炮制品中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量，如图2所示。

由图2可知：

1)随着微波炮制时间的延长，温度逐渐升高，炮制4min～16min过程中原儿茶酸的含量逐渐升高，16min之后开始下降，可能由于原儿茶酸在炮制过程中存在双向转化：生品中原儿茶酸-3-o-糖苷受热分解为原儿茶酸和糖，同时原儿茶酸受热又分解为其他物质。

炮制4min～8min过程中，温度升高明显，原儿茶酸的生成速率大于原儿茶酸分解速率，原儿茶酸含量上升；炮制8min～16min过程中，温度变化较小，原儿茶酸的生成与分解逐渐达到动态平衡，此时原儿茶酸含量最高；炮制16min～24min过程中，烫狗脊表面鼓起裂开，游离水分减少，温度迅速升高，原儿茶酸的生成速率小于原儿茶酸分解速率，原儿茶酸含量下降。

2)烫狗脊中5-羟甲基糠醛是由果糖脱水而成，而5-羟甲基糠醛具有一定的挥发性，炮制前期，生成速率大于挥发速率，含量上升；14min后，随着温度升高，挥发速率大于生成速率，含量下降。

3.5精密度考察

分别精密吸取原儿茶酸和5-羟甲基糠醛混合对照品溶液10μl，连续进样5次，按“3.3”项下色谱条件测定原儿茶酸和5-羟甲基糠醛色谱峰面积，rsd分别为0.178％、0.230％，表明仪器精密度良好。

3.6稳定性考察

取烫狗脊粉末1g，按“3.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μl，分别于0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h注入高效液相色谱仪，按“3.3”项下色谱条件测定，计算原儿茶酸和5-羟甲基糠醛含量，rsd分别为0.343％、0.669％，表明供试品溶液在36h内具有良好的稳定性。

3.7重复性考察

取同一批号烫狗脊药材，按“3.2”项下方法，平行制备供试品溶液6份，按“3.3”项下色谱条件测定，计算原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量，rsd分别为1.89％、1.61％，表明该方法的重复性良好。

4炮制品的色度值测定

4.1色度值l、a、b的测定

分别取上述11份烫狗脊炮制品，粉碎，95％以上过四号筛，无法过筛粉末与已过筛粉末混合。以国际照明委员会认可的d65光源作为光源，白色作为背景，通过型号为canoneos77d的照相机对炮制饮片粉末图像进行采集，如图3所示，其中，(生)狗脊饮片即对应为微波炮制0min。通过adobephotoshop6.0软件读取所述图像的色度值l、a和b，平行测定3次，取平均值。

取传统砂烫炮制的砂烫狗脊饮片粉碎，95％以上过四号筛，无法过筛粉末与已过筛粉末混合。以国际照明委员会认可的d65光源作为光源，白色作为背景，通过型号为canoneos77d的照相机对炮制饮片粉末图像进行采集，如图3所示。

4.2精密度考察

取同一烫狗脊饮片粉末，按“4.1”项下色度值l、a、b的测定方法，连续测定颜色6次，rsd为3.51％，表明该方法精密度良好。

4.3稳定性考察

取同一烫狗脊饮片粉末，按“4.1”项下色度值l、a、b的测定方法，分别在1h、4h、6h、8h、12h测定其色度值，rsd为3.25％，表明样品在12h内稳定性良好。

4.4重复性考察

分别采用同一方法制备6份烫狗脊粉末，按“4.1”项下色度值l、a、b的测定方法，测定其色度值，rsd为3.91％，表明该方法重复性良好。

5炮制品指标成分与色度值的相关性

参照“3.4”项下11份烫狗脊炮制品中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量与“4.1”项下11份烫狗脊炮制品的色度值l、a、b的测定结果，数据汇总于表3。

表3

微波炮制16min后，烫狗脊表面鼓起裂开，温度升高，水分减少，内部开始灰化，且随微波时间的延长，灰化程度逐渐严重，已不满足炮制品的性状要求。综合考虑。采用spss20.0软件分析表3中0min～16min所记录的烫狗脊各指标成分含量与色度值的关联性，以原儿茶酸含量为自变量(x)，5-羟甲基糠醛含量为因变量(y)，进行多元线性回归。相关性分析结果表明，原儿茶酸含量与5-羟甲基糠醛含量有较强相关性(r＝0.970)，因此当原儿茶酸含量范围确定，5-羟甲基糠醛含量范围随之确定，故只需满足原儿茶酸含量范围即可，原儿茶酸与5-羟甲基糠醛含量相关分析结果如表4所示。

表4

以原儿茶酸为自变量(x)，l，a和b为因变量(y)，进行多元线性回归。相关性分析结果表明，原儿茶酸含量与色度值l有较强相关性(r＝0.922)，同时，原儿茶酸含量与色度值a有一定的相关性(r＝0.889)，因此，色度值a和l可作为狗脊微波炮制过程中监测炮制品质量评价的依据。原儿茶酸与l，a和b相关分析结果如表5所示。

表5

结合表3中，在6min～16min，原儿茶酸的含量范围为0.325mg·g^-1～0.686mg·g^-1，结合药典原儿茶酸含量不低于0.2mg·g^-1的要求，可将狗脊微波炮制后原儿茶酸含量范围定为0.2mg·g^-1～0.686mg·g^-1。进一步结合原儿茶酸与色度值a和l的回归方法，得到一种微波炮制狗脊的在线评价方法，包括以下步骤：

获取待测炮制品的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478；

当0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，即可判断所述待测炮制品制品为合格。

进一步地，当0.325≤y1≤0.686且0.325≤y2≤0.686时，即可判断所述待测炮制品制品为优异。

6快速确定微波炮制狗脊工艺参数

根据上述评价方法，可以快速确定微波炮制狗脊工艺参数。

可以理解地，所述方法为：

于相同功率，不同炮制时间下，对狗脊进行微波炮制，得若干炮制品i；

获取若干所述炮制品i的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478；

若0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，记录相应的炮制时间t，炮制时间t即为微波炮制狗脊的标准炮制时间。

进一步地，若0.325≤y1≤0.686且0.325≤y2≤0.686，记录相应的炮制时间tmax，炮制时间tmax即为微波炮制狗脊的指标炮制时间(最佳工艺)。

同理，所述方法还可为：

于不同功率，相同炮制时间下，对狗脊进行微波炮制，得若干炮制品ii；

获取若干所述炮制品ii的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478；

若0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，记录相应的炮制功率p，炮制功率p即为微波炮制狗脊的标准炮制功率。

进一步地，若0.325≤y1≤0.686且0.325≤y2≤0.686，记录相应的炮制功率pmax，炮制功率pmax即为微波炮制狗脊的指标炮制功率(最佳工艺)。

以下结合实施例和对比例作具体说明。

实施例1

取狗脊饮片，适当破碎，过3.0cm筛网。取约50g，置于托盘内，于500w(中高火)功率下，在微波炉内进行微波炮制，随机取样，得烫狗脊炮制品，按“4.1”项下色度值测定方法，得到本实施例烫狗脊炮制品的色度值l＝54和a＝16；

将所述l和a代入下式，计算y1＝0.454和y2＝0.504：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478

根据本发明的判断标准，判断所述烫狗脊炮制品质量优异。

按“3.3”项下色谱条件，“3.4”项下线性关系，计算上述烫狗脊炮制品中原儿茶酸的含量为0.496mg.g^-1，结合2015年版《中华人民共和国药典》规定烫狗脊饮片按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.020％，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

可见，本实施例中的判断结果与高效液相色谱测定结果相符，采用上述方法可快速判断炮制品是否合格。

实施例2

取狗脊饮片，适当破碎，过3.0cm筛网。取约50g，置于托盘内，于500w(中高火)功率下，在微波炉内进行微波炮制，随机取样，得烫狗脊炮制品，按“4.1”项下色度值测定方法，得到本实施例烫狗脊炮制品的色度值l＝48和a＝15；

将所述l和a代入下式，计算y1＝0.312和y2＝0.660：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478

根据本发明的判断标准，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

按“3.3”项下色谱条件，“3.4”项下线性关系，计算上述烫狗脊炮制品中原儿茶酸的含量为0.318mg.g^-1，结合2015年版《中华人民共和国药典》规定烫狗脊饮片按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.020％，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

可见，本实施例中的判断结果与高效液相色谱测定结果相符，采用上述方法可快速判断炮制品是否合格。

实施例3

取狗脊饮片，适当破碎，过3.0cm筛网。取约50g，置于托盘内，于500w(中高火)功率下，在微波炉内进行微波炮制，随机取样，得烫狗脊炮制品，按“4.1”项下色度值测定方法，得到本实施例烫狗脊炮制品的色度值l＝62和a＝16；

将所述l和a代入下式，计算y1＝0.454和y2＝0.297：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478

根据本发明的判断标准，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

按“3.3”项下色谱条件，“3.4”项下线性关系，计算上述烫狗脊炮制品中原儿茶酸的含量为0.305mg.g^-1，结合2015年版《中华人民共和国药典》规定烫狗脊饮片按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.020％，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

可见，本实施例中的判断结果与高效液相色谱测定结果相符，采用上述方法可快速判断炮制品是否合格。

对比例1

方法一：

采用spss20.0软件分析表3中0min～24min所记录的烫狗脊各指标成分含量与色度值的关联性，以原儿茶酸的含量为自变量(x)，l，a和b为因变量(y)，进行多元线性回归。相关性分析结果表明，原儿茶酸含量与l值、a值有较强相关性(r＞0.80)，原儿茶酸与l，和a相关分析结果如表6所示。

表6

故得到一种微波炮制狗脊的在线评价方法，包括以下步骤：

获取待测炮制品的色度值l和a；

将所述l和a代入下式，计算y1和y2：

a＝6.949y1+12.952

l＝-37.599y2+71.743；

当0.2≤y1≤0.686且0.2≤y2≤0.686，即可判断所述待测炮制品制品为合格。

取狗脊饮片，适当破碎，过3.0cm筛网。取约50g，置于托盘内，于500w(中高火)功率下，在微波炉内进行微波炮制，随机取样，得烫狗脊炮制品，按“4.1”项下色度值测定方法，得到烫狗脊炮制品的色度值l＝65和a＝15；

将所述l和a代入下式，计算y1＝0.295和y2＝0.179：

a＝6.949y1+12.952

l＝-37.599y2+71.743

根据本方法的判断标准，判断所述烫狗脊炮制品质量不合格。

方法二：

将所述l和a代入实施例1的回归方程，计算y1＝0.312和y2＝0.219：

a＝7.018y1+12.811

l＝-38.587y2+73.478

根据实施例1的判断方程，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

方法三：

按“3.3”项下色谱条件，“3.4”项下线性关系，计算上述烫狗脊炮制品中原儿茶酸的含量为0.294mg.g^-1，结合2015年版《中华人民共和国药典》规定烫狗脊饮片按干燥品计算，含原儿茶酸(c7h6o4)不得少于0.020％，判断所述烫狗脊炮制品质量合格。

可见，选用不同炮制区间的样本，所构建的回归方程不同，对最终的判断结果有较大影响。本发明的判断结果与高效液相色谱测定结果相符，采用本发明的判断方法可快速判断炮制品是否合格。

结合上述各实施例和对比例，我们可知，选取哪个微波炮制时间段的烫狗脊各指标成分含量，直接影响到烫狗脊各指标成分含量与色度值的相关性建立。影响判断结果的准确性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。