一种土壤细菌数量的精确提取方法

1.本发明涉及一种土壤细菌数量的精确提取方法。


背景技术：

2.土壤细菌在土壤的形成和土壤的发育过程中起着非常重要的作用，在土壤有机质的分解、循环及转化过程中表现非常活跃，是评价和衡量土壤质量和土壤健康程度的重要指标参数之一。与此同时，土壤细菌极易受到土壤酸碱度，环境温度，土壤湿度，土壤质地特征和矿物成分及植被根系等多因素的影响，这会导致不同的土壤细菌的数量及其分泌的酶等成分可以通过对土壤动物和植被根系的作用，直接或间接影响植被的生长状况和粮食作物的产量。因此，通过对土壤细菌数量的测定，可以科学地判断土壤的活力、土壤的有效性及土壤的肥力等土壤质量状况。现有的土壤细菌数量测定方法主要有显微镜计数器测量法、测定细胞重量法、电子计数器测量法、比浊法、活细胞计数法、测定细胞总氮量方法、颜色改变单位法等。然而，现有的细胞数量测定方法主要依赖与显微镜等仪器对土壤细菌进行肉眼观察直接计数，这些方法有的利用不同浓度的细菌悬浊液的密度差异进行稀释培养和比对测量，有的利用细菌悬浊液的透光度等级进行估测，有的依据不同稀释梯度的细菌溶液对比进行估测，这些方法不仅需要有专业的人员消耗大量的时间和精力进行提取和识别，还容易受到实验人员主观的测量失误、细菌培养液浓度差异、细菌粘附成团及测量过程中实验室环境变化对细菌数量的影响，同时每次测量只能在一定的时间段和实验室环境下缓慢进行，极大地增加了土壤细菌数量的提取难度，也降低了细菌数量的提取效率，测量精度往往也只能够确定土壤细菌数量的分布范围，难以准确提取土壤细菌的具体数量。


技术实现要素：

3.为了克服现有的土壤细菌数量测量方法的局限性，本发明提供一种土壤细菌数量的精确提取方法，解决了现有的细菌数量目视提取过程费时费力，工作效率低下，难于保存的缺点；以及必须在实验室进行实时测量的缺点，这种测量方式往往会影响细菌培养实验室的其他操作进程，且难以实现重复性的测量和提取等一系列的操作和技术问题。
4.本发明所采用的技术如下：一种土壤细菌数量的精确提取方法，步骤如下：
5.步骤1、获取标准土壤细菌培养皿发育图像
6.采用一个正方形的黑白的棋盘格网定标板，利用数码相机对定标板进行拍照作为定标板图像，然后利用数码相机对放置在定标板的中心位置的细菌培养皿依次进行拍照，以此获取标准化的细菌图像，将定标板图像和标准化细菌图像传输到电脑并保存；
7.步骤2、对土壤细菌图像进行标准化预处理
8.对定标板图像进行多项式几何校正，当所有定标网格线都互相垂直且不再存在变形时，记录当前几何校正结果的校正多项式方程系数，同时将该校正多项式方程用于所有的细菌图像，对所有细菌图像进行统一的标准化几何校正处理，对校正后的图像进行灰度图转化处理；
9.步骤3、确定细菌图像单个像素实际尺度
10.设置统一的裁剪比例系数，对定标板图像及细菌图像进行标准化裁剪操作，以保证裁剪后的棋盘格网定标板图像区域大小和所有细菌图像相匹配，且所有图像的行列号完全一致；
11.步骤4、土壤细菌数量的精确提取
12.对标准化预处理和裁剪后的细菌图像进行统一的图像增强，对图像的像元建立统计直方图并根据直方图结果分割系数，对图像进行二值化处理，利用分水岭算法将图像中细菌体进行分割使其变成独立个体，然后对图像进行连通区域的标注，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取。
13.本发明还具有如下技术特征：
14.1、如上所述的步骤4具体如下：
15.对标准化预处理和裁剪后的细菌图像利用直方图均衡化处理进行统一的图像增强，对图像的像素建立土壤细菌灰度图像m的灰度级进行统计直方图处理，由于培养皿背景灰度级和土壤细菌灰度级差异较大，因此在对土壤细菌图像的统计直方图中会出现两个明显的峰值，在两个峰值之间选择灰度级频次最小的直方图图像的谷值点并记录该谷值点对应的灰度级d作为分割系数，对图像进行二值化处理，将灰度级大于d的所有像元点的灰度级设置为1，将灰度级小于d的所有像元点的灰度级设置为0，实现对土壤细菌灰度图像的二值化处理，将处理结果的二值图像记录为f；
16.要提取不同尺寸范围的土壤细菌数量，按照下列方法确定提取面积范围的计算标准：设置土壤细菌尺寸参数范围q1毫米和q2毫米作为想要提取细菌的尺寸边界，提取细菌尺寸在q1毫米和q2毫米之间的细菌数量，首先确定细菌最小尺寸q1毫米和最大尺寸q2毫米之间分别对应的像元大小q1和q2就分别为q1＝q1/c和q2＝q2/c，则利用matlab软件的膨胀腐蚀算法先将所有面积小于q1个像元的单个细菌体作为噪声点去除，并将图像结果保存为r1，再将所有面积小于q2个像元的单个细菌体作为噪声点去除并将结果保存为r2，那么对图像r1减r2的处理结果r’＝r1
‑
r2就是实际单个细菌尺寸大小q在q1≤q≤q2之间的所有细菌图像，
17.要提取该范围内的所有细菌数量，直接对r’图像进行8连通区域的标注并计算标记矩阵，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取。
18.2、当要将q1到q2之间的土壤细菌按大小划分为n个层次单独统计细菌数量，则需要对r’图像进一步处理，设想要提取第i个层次的细菌数量，对于第i个层次细菌而言，其具体的细菌实际尺寸范围ki满足k1≤ki≤k2，其中k1＝q1+(i
‑
1)*(q2
‑
q1)/n，k2＝q1+i*(q2
‑
q1)/n，对应第i个尺寸细菌的最小像素尺寸k1和最大像素尺寸k2分别为k1＝k1/c和k2＝k2/c，利用matlab软件的膨胀腐蚀算法先将所有面积小于k1个像素的单个细菌体作为噪声点去除并将图像结果保存为t1，再将所有面积效于k2个像素的单个细菌体作为噪声点去除并将结果保存为t2，那么对图像t1减t2的处理结果ti＝t1
‑
t2就是实际尺寸在q1和q2范围内的第i个层次的细菌图像，如果想要提取该层次内的所有细菌数量，直接对ti图像进行8连通区域的标注并计算标记矩阵，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取，通过该方法，即能够将实际尺寸在q1和q2之间的所有土壤细菌按照n个层次的大小分别提取。
19.本发明突出的有益效果及优点如下：第一，本方法实时性强，能够大量的节省细菌
数量提取的时间，传统的土壤细菌方法只能够针对一个培养皿的土壤细菌样本进行观察和细菌数量的提取，但本方法可以实现同时对细菌图像的批量处理，能够大幅提高土壤细菌数量的提取效率；第二，本方法还可以克服传统方法处理过程繁琐，细菌个体容易在测量过程中发生变化，细菌数量的提取结果容易受到环境影响等缺点；第三，本方法可以精确提取和识别培养早期不容易被人眼识别和提取的细菌个体，克服了传统土壤细菌数量提取方法对于细菌个体较小或细菌个体较多的情况测量结果的误差，提取精度显著提高；第四，与传统的土壤细菌数量提取方法相比，本方法可以针对同一培养皿中不同发育状态和体积的细菌个体数量进行分类提取，从而更容易确定不同生长发育阶段的细菌数量，以便于在不同的应用领域对土壤细菌的发展过程、发育条件、培养环境及影响因素的进一步分析和研究。本发明既能够保证土壤细菌数量的提取精度，又能够大幅度提高土壤细菌数量的提取效率，具有灵活性强，造价低，可重复操作等优点。
附图说明
20.图1为本实施例的土壤细菌灰度图像；
21.图2为本实施例的土壤细菌二值图像；
22.图3为本实施例的土壤细菌二值图像中所有4毫米
‑
8毫米的细菌个体图；
23.图4为本实施例的土壤细菌二值图像中所有2毫米
‑
4毫米的细菌个体图；
24.图5为本实施例的土壤细菌二值图像中1所有毫米
‑
2毫米的细菌个体图；
具体实施方式
25.下面根据附图举例对本发明做进一步的说明：
26.实施例1
27.步骤1：采用的设备包括固定装置、数码相机、细菌培养皿、定标板、电脑和试验台，将固定装置与实验台互相之间固定好之后，将数码相机安装在固定装置的金属支架上，调整数码相机的角度，使得相机的镜头与实验台的表面平行，从而保证定标板和细菌培养皿能够与数码相机镜头的正下方垂直，然后利用autocad软件绘制一张黑白的棋盘格网定标板，用于作为对后续拍摄的土壤细菌图像进行图像畸变的统一校正，确定几何校正多项式系数，建立统一的几何校正方程标准，定标板是由2mm*2mm大小的黑白相间的正方形格网构成，其本身的大小是将培养皿外径长度s作为边长的正方形大小。将定标板放置在数码相机的正下方，保证定标板的中心与数码相机镜头中心重合，然后利用分光光度计确定并调整好实验室的光强，结合白色的比色板对数码相机进行白平衡处理，确定在该固定光强下的数码相机光圈大小和曝光时间，实现对拍照环境的统一标准，在试验台上查找并确定数码相机镜头中心的投影点，然后将数码相机与笔记本电脑相连接，先拍摄定标板的照片作为标准定标图像，然后将培养皿放置在定标板中心，拍摄土壤细菌照片作为标准化的土壤细菌图像，最后将定标板和土壤细菌的拍摄结果通过数据线传输至笔记本电脑在固定的文件夹中进行保存。
28.步骤2：在arcgis软件环境中，对棋盘格网定标板图像进行多项式几何校正，当所有定标网格线都互相垂直且不再存在变形时，记录当前几何校正结果的校正多项式方程系数，将该校正多项式方程用于所有的细菌图像，实现对所有细菌图像进行统一的标准化几
何校正处理，对校正后的图像进行灰度图转化，转化公式为m＝(r+g+b)/3，其中r，g，b分别表示由matlab软件提取的彩色细菌图像的红色分量图像，绿色分量图像和蓝色分量图像，m表示变换后的灰度图像，本实施例的土壤细菌图像处理结果的土壤细菌灰度图像如图1所示。
29.步骤3：设置统一的裁剪比例系数，对定标板图像及细菌图像进行标准化裁剪操作以保证裁剪后的图像与定标板图像区域大小和所有细菌图像的行列号完全一致，测量定标板的边长，将其结果标记为a毫米，利用matlab软件提取标准化裁剪后的定标板边长对应的图像行数，将其标记为b，根据a和b计算单个图像像元的实际长度尺寸c＝a/b毫米，由此计算单个图像像元的实际面积尺寸e＝c2平方毫米。本实施例的土壤细菌图像中定标板的边长为a＝90毫米，本实施例图像中定标板边长对应的图像行数为b＝900，因此通过该方法计算的单个图像像元的实际长度尺寸c＝0.1毫米，通过该方法计算的单个图像像元的实际面积尺寸e＝0.01平方毫米。
30.步骤4：对标准化预处理和裁剪后的细菌图像利用直方图均衡化处理进行统一的图像增强，对图像的像素建立土壤细菌灰度图像m的灰度级进行统计直方图处理，由于培养皿背景灰度级和土壤细菌灰度级差异较大，因此在对土壤细菌图像的统计直方图中会出现两个明显的峰值，在两个峰值之间选择灰度级频次最小的直方图图像的谷值点并记录该谷值点对应的灰度级d作为分割系数，对图像进行二值化处理，将灰度级大于d的所有像元点的灰度级设置为1，将灰度级小于d的所有像元点的灰度级设置为0，实现对土壤细菌灰度图像的二值化处理，将处理结果的二值图像记录为f。
31.根据对本实施例的土壤细菌图像的直方图统计结果选择分割系数d对应的灰度级为80，将本实施例的土壤细菌图像中灰度级大于80的所有像元灰度级设为1，将本实施例的土壤细菌图像中灰度级小于80的所有像元灰度级设为0，实现对本实施例的土壤细菌图像的二值化处理，图2给出了对本实施例的土壤细菌图像处理后的二值图像f。在土壤细菌的二值化图像f中，白色部分代表细菌体，黑色部分代表培养皿背景，利用分水岭算法对个别连接在一起的细菌体进行分割使其变成独立个体。然后设置土壤细菌的识别范围，根据识别范围内要提取所有尺寸的细菌，直接对二值化图像进行8连通区域的标注并计算标记矩阵，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取。
32.如果想要提取不同尺寸范围的土壤细菌数量可以按照下列具体方法确定提取面积范围的计算标准：设置土壤细菌尺寸参数范围q1毫米和q2毫米作为想要提取细菌的尺寸边界，提取细菌尺寸在q1毫米和q2毫米之间的细菌数量，首先确定细菌最小尺寸q1毫米和最大尺寸q2毫米之间分别对应的像元大小q1和q2就分别为q1＝q1/c和q2＝q2/c，则利用matlab软件的膨胀腐蚀算法先将所有面积小于q1个像元的单个细菌体作为噪声点去除，并将图像结果保存为r1，再将所有面积小于q2个像元的单个细菌体作为噪声点去除并将结果保存为r2，那么对图像r1减r2的处理结果r’＝r1
‑
r2就是实际单个细菌尺寸大小q在q1≤q≤q2之间的所有细菌图像。
33.如果想要提取该范围内的所有细菌数量，直接对r’图像进行8连通区域的标注并计算标记矩阵，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取。
34.对本实施例的土壤细菌图像处理后的二值图像进行处理，设置土壤细菌尺寸参数范围q1＝4毫米和q2＝8毫米作为想要提取细菌的尺寸边界，提取细菌尺寸在4毫米和8毫米
之间的细菌数量，首先根据q1＝4毫米和c＝0.1毫米确定细菌最小尺寸对应的像元大小q1＝q1/c＝40，根据q2＝8毫米和c＝0.1毫米确定细菌最大尺寸对应的像元大小q2＝q2/c＝80，matlab软件的膨胀腐蚀算法先将所有面积小于40个像元的单个细菌体作为噪声点去除，并将图像结果保存为r1，再将所有面积小于80个像元的单个细菌体作为噪声点去除并将结果保存为r2，那么对图像r1减r2的处理结果r’＝r1
‑
r2就是实际单个细菌尺寸大小q在4毫米和8毫米之间的所有细菌图像。
35.如图3给出了根据本实施例的土壤细菌二值图像选取的单个细菌尺寸在4毫米和8毫米间的图像，根据该图像进行连通区域的标注，最后标记单给细菌尺寸在4毫米和8毫米间的每个细菌体，得出本实施例的土壤细菌在4毫米和8毫米间的总数量为10。
36.如图4给出了根据本实施例的土壤细菌二值图像选取的单个细菌尺寸在2毫米和4毫米间的图像，根据该图像进行连通区域的标注，最后标记单个细菌尺寸在2毫米和4毫米间的每个细菌体，得出本实施例的土壤细菌在2毫米和4毫米间的总数量为25。
37.如图5给出了根据本实施例的土壤细菌二值图像选取的单个细菌尺寸在1毫米和2毫米间的图像，根据该图像进行连通区域的标注，最后标记单给细菌尺寸在1毫米和2毫米间的每个细菌体，得出本实施例的土壤细菌在1毫米和2毫米间的总数量为41。如不对实际细菌尺寸的范围进行设定，根据细菌二值化图像进行所有单个细菌连通区域的标注，最后标记所有单个细菌的数量为，对本实施例的土壤细菌二值图像进行所有单个细菌的连通区域标注和细菌数量的标记处理，得到本实施例的土壤细菌图像总数量为76。
38.如想要将q1到q2之间的土壤细菌按大小划分为n个层次单独统计细菌数量，则需要对r’图像进一步处理，设想要提取第i个层次的细菌数量，对于第i个层次细菌而言，其具体的细菌实际尺寸范围ki满足k1≤ki≤k2，其中k1＝q1+(i
‑
1)*(q2
‑
q1)/n，k2＝q1+i*(q2
‑
q1)/n，对应第i个尺寸细菌的最小像素尺寸k1和最大像素尺寸k2分别为k1＝k1/c和k2＝k2/c，利用matlab软件的膨胀腐蚀算法先将所有面积小于k1个像素的单个细菌体作为噪声点去除并将图像结果保存为t1，再将所有面积效于k2个像素的单个细菌体作为噪声点去除并将结果保存为t2，那么对图像t1减t2的处理结果ti＝t1
‑
t2就是实际尺寸在q1和q2范围内的第i个层次的细菌图像，如果想要提取该层次内的所有细菌数量，直接对ti图像进行8连通区域的标注并计算标记矩阵，最后通过标记矩阵对每个细菌体进行提取，通过该方法，即能够将实际尺寸在q1和q2之间的所有土壤细菌按照n个层次的大小分别提取。