一种添加DNA溯源码的DNA油墨及其使用、检测方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种添加dna溯源码的dna油墨。

背景技术：

1、dna条形码(dna barcoding)产地溯源技术是近几年迅速发展的一项分子生物学技术，以遗传物质为检测对象，具有操作简便、结果可靠，特异性强的优势，具有较好的重现性。携带外源dna溯源码的溯源标志物具备dna条形码防伪性强的突出优势，同时可结合dna密码学实现信息的编写和读取。

2、目前国内应用于地理标志产品的溯源手段主要有在商品外包装粘贴地标产品标识、通过条码技术标识产品信息、利用rfid技术进行物流信息管理等。目前常见产品溯源防伪一般通过在外包装打防伪标识的方式，但无法识别包装为真但内容物为假的情况。二维条码以信息容量大、价格低廉等优点，在农产品溯源中得到广泛应用。但标签外露存在非法贸易商扫描和转载加密的二维码的风险，难以保证农产品标识的独特性。无线射频识别即射频识别技术(radio frequency identification，rfid)是一种利用无线电波的射频信号自动识别目标对象并获取相关数据的无线射频身份识别技术，在动物溯源领域有较为广泛的应用。但该技术存在使用成本高、电子标签信息有非法读取和恶意篡改风险、技术标准不统一等问题，在农产品追踪溯源领域的适用度较低，并未实现普遍推广。

3、目前地理标识产品认证的标识方法主要是在外包装印制认证标签，独占性差、防伪性低，假冒成本低廉。假冒商品通过冒贴标等方式伪造产品，侵害消费者合法权益、损害地理标识产品品牌形象、不利于地理标识产品的品质控制和销售市场安全监管。

4、因此，需要建立一种防伪性高、实用性强、认证可靠的溯源标识方法，用于满足食品产地溯源的市场需求。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的缺陷，本发明包括以下方面的内容：

2、本发明的第一方面提供一种添加dna溯源码的dna油墨的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

3、(1)确定携带认证商品信息的dna溯源码；

4、(2)根据dna溯源码序列信息设计合成特定的dna及其鉴别引物和测序引物；

5、(3)利用铵功能化二氧化硅微粒包埋dna溯源码作为溯源标志物，加入食用印字油墨中，制得用于印制在溯源样本表面的dna油墨；

6、(4)建立包含溯源样本、dna溯源码、鉴别引物，与所述溯源样本溯源源头信息和/或批次物流信息对应关系的在线查询网站，将网站转化为二维码图案；

7、(5)将dna油墨以二维码图案的形式印制溯源样本表面。

8、优选的，所述步骤(1)中dna溯源码包含信息区、特征身份标识区及扩增特异引物片段，所述信息区包含商品产地信息，参考邮政编码实现来源定位；溯源信息参考索引表格将数字化信息转换为碱基序列。

9、优选的，所述索引表格为下述索引表格1和/或索引表格2，

10、索引表格1

11、 0 gac 5 gtt 1 cat 6 tat 2 aag 7 cct 3 ggt 8 ctg 4 taa 9 atg

12、索引表格2

13、 0 gat 5 acc 1 agc 6 ctc 2 cct 7 aag 3 atc 8 agt 4 gcc 9 tcc

14、。

15、更优选的，所述索引表格为索引表格1。

16、优选的，所述步骤(1)中dna溯源码序列如seq id no.1或seq id no.4所示。

17、优选的，所述步骤(2)中合成特定dna的pcr引物序列如seq id no.2和seq idno.3、或者seq id no.13和seq id no.14所示。

18、优选的，所述步骤(2)中合成特定dna的pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环，最后72℃延伸5min；4℃保存；pcr反应体系为：2×taq pcr master预混液10μl，10μm上、下游引物各0.15μl，10mm dna模板0.25μl，加超纯水至20μl。

19、优选的，所述步骤(2)中构建携带dna溯源码的质粒的方法如下：将dna溯源码接入质粒，对携带成功接入完整dna溯源码质粒的感受态细胞进行扩增，通过质粒提取进行富集，得到溯源标志物。

20、优选的，所述步骤(2)中接入dna溯源码的质粒为pmdtm19-t载体。

21、优选的，所述步骤(3)中铵功能化二氧化硅微粒包埋dna溯源码的方法如下：制备二氧化硅微粒，将二氧化硅微粒进行铵功能化处理，溯源标志物包埋于铵功能化二氧化硅微粒中，即得。

22、更优选的，上述用铵功能化二氧化硅微粒包埋溯源标志物的方法如下：使用乙醇、氨溶液、无菌去离子水和正硅酸乙脂的混合物制备二氧化硅微粒，将二氧化硅微粒用n-三甲氧基硅烷基丙基-n,n,n-三甲基氯化铵溶液进行铵功能化处理，溯源标志物与铵功能化二氧化硅微粒混合后，加入食用油墨专用稀释剂，制备得到包埋溯源标志物的铵功能化二氧化硅微粒。

23、优选的，所述食用油墨专用稀释剂符合gb10343-2008要求。

24、优选的，所述制备二氧化硅微粒的方法如下：将乙醇、氨溶液、无菌去离子水和正硅酸乙脂的混合物震荡后离心，弃去上清液，加入异丙醇涡旋，超声，离心，丢弃上清液，将颗粒悬浮在异丙醇中，制得含二氧化硅微粒的溶液。

25、优选的，所述溶液中二氧化硅微粒的浓度为50mg/ml。

26、优选的，所述将二氧化硅微粒进行铵功能化处理的方法如下：在含二氧化硅微粒的溶液中加入n-三甲氧基硅烷基丙基-n,n,n-三甲基氯化铵溶液(tmaps，50％甲醇溶液，wt/wt)，震荡后离心，弃去上清液，加入异丙醇，涡旋后超声处理，离心，弃去上清液，最终将铵功能化二氧化硅微粒悬浮在异丙醇中，制得含铵功能化二氧化硅微粒的溶液。

27、优选的，所述溶液中铵功能化二氧化硅微粒的浓度为50mg/ml。

28、优选的，所述步骤(3)中的食用印字油墨颜色为黑色。

29、优选的，所述步骤(3)中的食用印字油墨在与食用油墨专用稀释剂按体积比1:1稀释后使用。

30、优选的，所述食用油墨专用稀释剂符合gb10343-2008要求。

31、更优选的，所述食用油墨专用稀释剂为xj稀释剂(028)。

32、优选的，所述步骤(3)中的食用印字油墨中添加2种及以上使用不同鉴别引物的dna溯源码。

33、优选的，所述步骤(4)中的鉴别引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

34、优选的，所述步骤(5)中印制溯源样本的方法如下：将溯源样本经喷蜡处理，待表层喷蜡风干后，将dna油墨加入移印机，对溯源样本进行二维码图案印制。

35、本发明的第二方面提供一种添加dna溯源码的dna油墨的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

36、(1)通过扫描溯源样本表面的二维码获得商品信息；

37、(2)回收溯源样本表面的dna油墨；

38、(3)从dna油墨中分离dna溯源码，在鉴别引物参与下对溯源标志物中的dna溯源码进行跨越式滚环等温扩增，鉴定标注溯源信息的真实性；

39、(4)对于溯源成功的溯源对象，针对dna溯源码进行测序，获得dna溯源码片段的序列信息，将dna溯源码片段的序列信息输入扫描商品表面印制的二维码后显示的在线查询网站，获取dna溯源码溯源信息；如果dna溯源码所对应的源头信息和/或批次物流信息可以完整读取，则溯源成功。

40、优选的，所述步骤(2)包括以下步骤：使用蘸有食用油墨专用稀释剂的棉签从溯源样品表面做无污染取样，收集在超纯水中，从取样中分离dna溯源码。

41、优选的，所述食用油墨专用稀释剂符合gb10343-2008要求。

42、更优选的，所述食用油墨专用稀释剂为xj稀释剂(028)。

43、优选的，所述步骤(3)中从dna油墨中分离dna溯源码的方法如下：取溶于超纯水中的dna油墨样本，添加蚀刻溶液以释放dna溯源码，使用dna纯化试剂盒处理已释放的dna溯源码。

44、优选的，所述蚀刻溶液包含nh4fhf和nh4f。更优选的，每ml蚀刻水溶液中含有0.046g nh4fhf和0.038g nh4f。

45、优选的，所述步骤(3)中dna溯源码包含信息区、特征身份标识区及扩增特异引物片段，所述信息区包含商品产地信息，参考邮政编码实现来源定位；溯源信息参考索引表格将数字化信息转换为碱基序列。

46、优选的，所述索引表格为上述索引表格1和/或索引表格2。

47、优选的，所述步骤(3)中dna溯源码序列如seq id no.1或seq id no.4所示。

48、优选的，所述步骤(3)中的dna溯源码从dna油墨中分离前以包埋溯源标志物的铵功能化二氧化硅微粒的形式存在。

49、优选的，所述溯源标志物以携带dna溯源码的质粒形式存在，构建携带dna溯源码的质粒的方法如下：将dna溯源码接入质粒，对携带成功接入完整dna溯源码质粒的感受态细胞进行扩增，通过质粒提取进行富集，得到溯源标志物。

50、优选的，接入dna溯源码的质粒为pmdtm19-t载体。

51、优选的，所述铵功能化二氧化硅微粒包埋dna溯源码的方法如下：制备二氧化硅微粒，将二氧化硅微粒进行铵功能化处理，溯源标志物包埋于铵功能化二氧化硅微粒中，即得。

52、更优选的，上述用铵功能化二氧化硅微粒包埋溯源标志物的方法如下：使用乙醇、氨溶液、无菌去离子水和正硅酸乙脂的混合物制备二氧化硅微粒，将二氧化硅微粒用n-三甲氧基硅烷基丙基-n,n,n-三甲基氯化铵溶液进行铵功能化处理，溯源标志物与铵功能化二氧化硅微粒混合后，加入食用油墨专用稀释剂，制备得到包埋溯源标志物的铵功能化二氧化硅微粒。

53、优选的，所述食用油墨专用稀释剂符合gb10343-2008要求。

54、更优选的，所述食用油墨专用稀释剂为xj稀释剂(028)。

55、优选的，所述制备二氧化硅微粒的方法如下：将乙醇、氨溶液、无菌去离子水和正硅酸乙脂的混合物震荡后离心，弃去上清液，加入异丙醇涡旋，超声，离心，丢弃上清液，将颗粒悬浮在异丙醇中，制得含二氧化硅微粒的溶液。

56、优选的，所述溶液中二氧化硅微粒的浓度为50mg/ml。

57、优选的，所述将二氧化硅微粒进行铵功能化处理的方法如下：在含二氧化硅微粒的溶液中加入n-三甲氧基硅烷基丙基-n,n,n-三甲基氯化铵溶液(tmaps，50％甲醇溶液，wt/wt)，震荡后离心，弃去上清液，加入异丙醇，涡旋后超声处理，离心，弃去上清液，最终将铵功能化二氧化硅微粒悬浮在异丙醇中，制得含铵功能化二氧化硅微粒的溶液。

58、优选的，所述溶液中铵功能化二氧化硅微粒的浓度为50mg/ml。

59、优选的，所述步骤(3)中跨越式滚环等温扩增的反应体系为：浓度为100mm的mgso41.2μl、浓度为10mm的dntps 2.8μl、10×thermopol缓冲液2μl、浓度为10μm的上、下游引物各1μl、dna溯源码(≥20ng/μl)1.5μl和8u的bst dna聚合酶1μl，用超纯水将体系补足至20.0μl；扩增的反应条件为：94℃预变性3min，冰浴2min；62℃反应60min；80℃灭活5min以终止反应。

60、优选的，所述步骤(3)中跨越式滚环等温扩增的反应鉴别引物序列如seq idno.11和seq id no.12所示。

61、优选的，所述步骤(3)中的真实性鉴别标准为：如果获取不到所述保密引物或所述保密引物扩增失败，则溯源失败；如果获取到所述保密引物并扩增成功，则溯源成功，后续可以通过测序鉴定法进一步溯源。

62、优选的，所述步骤(4)中针对溯源标识物进行测序过程中使用的鉴别引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

63、优选的，所述步骤(4)中针对溯源标识物进行测序过程中使用的pcr引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示。

64、优选的，所述步骤(4)中针对溯源标识物进行测序过程中使用的测序引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示。

65、优选的，所述步骤(4)中针对溯源标识物进行测序过程中使用的pcr反应体系为：2×pcr reaction预混液10μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，加超纯水至20μl；pcr反应条件为：96℃预变性5min；96℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min；35个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。

66、优选的，所述步骤(4)中针对溯源标识物进行测序过程中使用的测序反应体系为：5×sequencing buffer 1μl，big dye terminator v3.11μl，10μm上、下游引物共0.16μl，无核酸酶水6.84μl，pcr纯化产物1μl，测序反应条件为：96℃2min；96℃15s，54℃10s，60℃4min，30个循环；4℃保存。

67、优选的，所述步骤(4)中获得dna溯源码片段的序列信息的方法如下：将得到的序列利用dnasart软件中的seq man功能进行序列拼接，将拼接好的序列经过mega6.0软件进行多序列比对，去掉序列两端的低质量区；处理好的序列依据pmdtm19-t载体说明书定位dna溯源码插入位点，读取溯源信息。

68、本发明的第三方面提供一种用于产品产地溯源的溯源标志物微粒，其包括溯源标志物以及用于包埋溯源标志物的铵功能化二氧化硅微粒。

69、优选的，所述溯源标志物为携带dna溯源码的质粒，所述dna溯源码序列如seq idno.1或seq id no.4所示。

70、优选的，合成特定dna溯源码的pcr引物序列如seq id no.2和seq id no.3或者seq id no.13和seq id no.14所示。

71、优选的，所述dna溯源码使用的鉴别引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

72、优选的，所述铵功能化二氧化硅微粒是将二氧化硅微粒用n-三甲氧基硅烷基丙基-n,n,n-三甲基氯化铵溶液进行铵功能化处理后得到的微粒。

73、本发明的第四方面提供一种用于产品产地溯源的dna油墨，其包括食用印字油墨以及分散于食用油墨专用稀释剂中的上述溯源标志物微粒。

74、优选的，所述食用油墨专用稀释剂符合gb10343-2008要求。

75、更优选的，所述食用油墨专用稀释剂为xj稀释剂(028)。

76、本发明的有益效果如下：

77、1、本发明首次将利用质粒构建携带dna溯源码的溯源标志物添加到食用印字油墨中，为外源dna溯源码标识物应用于认证商品提供便捷、可行的技术方案。

78、2、本发明首次提出将dna油墨通过印制二维码图案的方式用于认证商品。区别于普通的二维码标识，添加dna溯源码的油墨具备唯一性和独占性，避免非法贸易商扫描和转载加密二维码的风险，保证认证标识商品的独特性。

79、3、本发明提供了基于跨越式滚环扩增技术的溯源标志物检测方案。区别于普通pcr扩增，基于跨越式滚环扩增技术的检测方案可在实验室外进行现场检测。该检测方案结合sybr green i荧光染料使用，通过肉眼观察反应扩增产物颜色变化即可对检测结果进行判定，使商品标识鉴定更加简便、直观。

80、4、本发明建立的dna油墨-二维码商品认证标识方案可实现对标识对象身份的精准判别，兼顾二维码扫描信息读取的便捷性和dna溯源码标识的防伪性，可有效解决现有标识方法存在的使用成本高、防伪特异性低、检测时间长等问题，为地理标志产品溯源系统的建立提供了技术支持，市场应用前景广阔。