定量评价坛紫菜耐高温能力的方法

1.本发明涉及海藻育种技术领域，尤其是涉及一种定量评价坛紫菜耐高温能力的方法。


背景技术：

2.坛紫菜是我国最重要的经济海藻之一，广泛栽培于浙江、福建和广东等地，近年来江苏也开始大量栽培坛紫菜。在坛紫菜栽培过程中常常面临严重的高温胁迫，特别是下海栽培初期的高温回暖天气往往导致大规模脱苗和烂苗，给坛紫菜产业带来巨大的经济损失。因此，评价坛紫菜的耐高温能力，进而选育耐高温品种对坛紫菜产业的可持续发展具有重要意义，相关研究一直是领域热点。
3.坛紫菜叶状体正常生长的温度上限为28℃。因此，每年9月下旬到10月上旬海区水温降到28℃后开始大规模采苗和下海养殖。这个时期常常受台风或高温回暖天气的影响，可导致海水温度升高1～2℃，并持续几天。而高温天气持续4天以上就会引起大规模病烂。传统的耐高温评价实验一般以2～5cm长的坛紫菜叶状体或叶状体中部为研究材料，用26～30℃的高温处理7～15天。然后分析高温对某品系坛紫菜叶状体的生长、形态和光合作用速率等生理指标的影响，进而对该品系的耐高温能力进行评价。这种评价方法的实验步骤繁琐、周期较长，难以用于大规模筛选工作。传统方法最大的问题在于，不同实验处理条件得出的结果无法进行比较，无法评判两个耐高温品系那个更好。此外，耐高温能力不仅体现在高温耐受能力上，还体现在快速恢复能力上。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种定量评价坛紫菜耐高温能力的方法，以解决上述问题中的至少一种。
6.第一方面，本发明提供了一种定量评价坛紫菜耐高温能力的方法，包括以下步骤：
7.a.对不同品系坛紫菜进行高温胁迫处理，然后进行恢复培养，分别获得高温胁迫处理前的最大光化学效率fv/fm(0)、高温胁迫处理后的最大光化学效率fv/fm(ht)和恢复培养后的最大光化学效率fv/fm(r)；
8.b.获得与a步骤相应品系坛紫菜正常生长温度条件和高温胁迫条件下的日增重速度差δμ；
9.c.将fv/fm(0)、fv/fm(ht)、fv/fm(r)和δμ代入如下公式：
10.拟合得出常数a、b和c的值；
11.d.将c步骤得出的常数a、b和c的值代入如下公式：
[0012][0013]
e.将待测坛紫菜按照a步骤获得fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)，并代入d步骤中的公式，根据htd值评价坛紫菜的耐高温能力。
[0014]
作为进一步技术方案，a步骤中，所述高温胁迫处理的温度为32-35℃，优选为34℃；
[0015]
优选地，所述高温胁迫处理的时间为2-6h，优选为4h；
[0016]
优选地，所述恢复培养的温度为20-25℃，优选为21℃；
[0017]
优选地，所述恢复培养的时间为24-48h，优选为24h。
[0018]
作为进一步技术方案，采用叶绿素荧光技术获得fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)。
[0019]
作为进一步技术方案，a步骤中，所述坛紫菜的品系包括高温耐受品系和高温敏感品系；
[0020]
优选地，所述坛紫菜的品系在3种以上。
[0021]
作为进一步技术方案，a步骤和b步骤中以相同长度的坛紫菜为研究材料；
[0022]
优选地，所述坛紫菜的长度为2-10cm。
[0023]
作为进一步技术方案，b步骤中，所述δμ的获得方法包括如下步骤：
[0024]
将坛紫菜分别在正常生长温度条件和高温胁迫条件下培养7-15天，获得两个条件下的日增重速度差δμ。
[0025]
作为进一步技术方案，所述正常生长温度为20-25℃，优选为21℃；
[0026]
所述高温胁迫条件下培养的温度为26-30℃，优选为30℃。
[0027]
作为进一步技术方案，所述拟合的拟合优度r2》0.5。
[0028]
作为进一步技术方案，htd计算公式中常数为：常数a＝-0.3616，常数b＝-0.1278，常数c＝0.004112。
[0029]
作为进一步技术方案，根据htd值分布情况，设定若htd《0.06，则待测坛紫菜为高温耐受品系；
[0030]
若htd》0.12，则待测坛紫菜为高温敏感品系。
[0031]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032]
本发明提供的定量评价坛紫菜耐高温能力的方法简单方便，能够在48h内定量一个坛紫菜品系的耐高温能力，克服了以往实验条件不同导致的无法进行定量比对、评价时间长、方法复杂等问题，大大提高了坛紫菜耐高温品系的筛选效率。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]
图1为高温胁迫下四个品系的fv/fm(t)/fv/fm(21℃)比值变化；
[0035]
图2为z-26-bg品系经34℃和35℃处理并恢复过程中fv/fm的变化；
[0036]
图3为4个坛紫菜品系在34℃下处理4h及35℃下处理2h后恢复培养24h和48h过程中的fv/fm的变化；
[0037]
图4为14个坛紫菜品系在34℃处理4h后并恢复培养24h及48h的fv/fm的变化；
[0038]
图5为39个坛紫菜品系的htd值与7天30℃处理导致的日增重速度差δμ之间的关系；
[0039]
图6为5个坛紫菜品系在21℃和30℃下培养7d后的形态图；
[0040]
图7为5个坛紫菜品系在21℃和30℃下培养7d的日增重速率。
具体实施方式
[0041]
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0042]
第一方面，本发明提供了一种定量评价坛紫菜耐高温能力的方法，包括以下步骤：
[0043]
a.对不同品系坛紫菜进行高温胁迫处理，然后进行恢复培养，分别获得高温胁迫处理前的最大光化学效率fv/fm(0)、高温胁迫处理后的最大光化学效率fv/fm(ht)和恢复培养后的最大光化学效率fv/fm(r)；
[0044]
b.获得与a步骤相应品系坛紫菜正常生长温度条件和高温胁迫条件下的日增重速度差δμ；
[0045]
c.将fv/fm(0)、fv/fm(ht)、fv/fm(r)和δμ代入如下公式：
[0046]
拟合得出常数a、b和c的值；
[0047]
d.将c步骤得出的常数a、b和c的值代入如下公式：
[0048][0049]
e.将待测坛紫菜按照a步骤获得fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)，并代入d步骤中的公式，根据htd值评价坛紫菜的耐高温能力。
[0050]
本发明提供的定量评价坛紫菜耐高温能力的方法简单方便，能够在48h内定量一个坛紫菜品系的耐高温能力，克服了以往实验条件不同导致的无法进行定量比对、评价时间长、方法复杂等问题，大大提高了坛紫菜耐高温品系的筛选效率。
[0051]
在一些优选的实施方式中，a步骤中，所述高温胁迫处理的温度例如可以为，但不限于32℃、33℃、34℃或35℃，优选为34℃；
[0052]
优选地，所述高温胁迫处理的时间例如可以为，但不限于2h、3h、4h、5h或6h，优选为4h；
[0053]
经发明人研究发现，在上述高温胁迫处理温度和处理时间条件下对坛紫菜进行处理，有助于实现对不同品系坛紫菜的区分。
[0054]
优选地，所述恢复培养的温度例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，优选为21℃；
[0055]
优选地，所述恢复培养的时间例如可以为，但不限于24h、32h、40h或48h，优选为24h。
[0056]
在上述恢复培养条件下有助于坛紫菜的快速恢复。
[0057]
在一些优选的实施方式中，采用叶绿素荧光技术获得fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)。
[0058]
在一些优选的实施方式中，a步骤中，所述坛紫菜的品系包括高温耐受品系和高温敏感品系；
[0059]
优选地，所述坛紫菜的品系在3种以上。坛紫菜的品系越多，拟合得到的计算公式越准确。
[0060]
在一些优选的实施方式中，a步骤和b步骤中以相同长度的坛紫菜为研究材料，有助于提高本发明方法的准确性。
[0061]
优选地，所述坛紫菜的长度例如可以为，但不限于2cm、4cm、6cm、8cm或10cm。
[0062]
在一些优选的实施方式中，b步骤中，所述δμ的获得方法包括如下步骤：
[0063]
将坛紫菜分别在正常生长温度条件和高温胁迫条件下培养7-15天，获得两个条件下的日增重速度差δμ。
[0064]
在一些优选的实施方式中，所述正常生长温度例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，优选为21℃；
[0065]
所述高温胁迫条件下培养的温度例如可以为，但不限于26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为30℃。
[0066]
以正常生长温度为21℃、高温胁迫的处理温度为30℃为例，δμ的获得方法可以如下：
[0067]
以与b步骤相同长度的坛紫菜为研究材料，分别在21℃和30℃培养7天，然后计算30℃高温处理7天对日增重速度的影响δμ，计算公式如下：
[0068]
δμ＝wgr
(21℃)-wgr
(30℃)
；
[0069]
其中，wgr为鲜重日增长速率。
[0070]
在一些优选的实施方式中，所述拟合的拟合优度r2》0.5。
[0071]
在一些优选的实施方式中，发明人以39个品系坛紫菜进行试验，拟合后获得常数a＝-0.3616，常数b＝-0.1278，常数c＝0.004112。
[0072]
可以预想的是，随着试验坛紫菜品系的增加，拟合得到的常数会发生改变，拟合也越准确。
[0073]
在一些优选的实施方式中，根据htd值的分布情况，设定若htd《0.06，则待测坛紫菜为高温耐受品系；
[0074]
若htd》0.12，则待测坛紫菜为高温敏感品系。
[0075]
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0076]
实施例1
[0077]
(1)研究材料选择由集美大学水产学院坛紫菜课题组选育的高温耐受品系z-61和
z-26-bg，以及高温敏感品系z-26-r和wo130，将藻体培养到长度为7
±
1cm。将以上四种品系分别在t(21℃、32℃、34℃、35℃)温度下进行培养，采用叶绿素荧光技术检测fv/fm(t)/fv/fm(21℃)比值变化，结果如图1所示。将z-26-bg品系在34℃和35℃下高温胁迫处理xtime(2h、2.5h、3h、4h、4.5h、5h、6h)，然后在21℃条件下恢复培养24h和48h，结果如图2所示。将以上四种品系分别在34℃下胁迫处理4h，然后在21℃条件下恢复培养24h和48h，结果如图3中的a所示；将以上四种品系分别在35℃下胁迫处理2h，然后在21℃条件下恢复培养24h和48h，结果如图3中的b所示。
[0078]
图1表明在34℃和35℃下，四个品系的fv/fm下降较快。图2表明叶状体在34℃下培养4小时后，或在35℃下培养2小时后，恢复培养能提高fv/fm。图3表明在35℃下培养2小时及后续恢复培养中，z-26r和z-61变化趋势没有明显区分；而胁迫温度为34℃、胁迫时间为4h时，高温耐受与敏感品系的fv/fm下降幅度能够被明显区分。
[0079]
(2)为确定恢复培养时间，以包括上述4个品系的14个品系为材料，先在34℃下胁迫处理4h，然后在21℃条件下恢复培养24h和48h，对比不同恢复培养时间后fv/fm的提升幅度，结果如图4所示。图4表明24h恢复培养可以明显区分不同品系的恢复能力。
[0080]
(3)将长度为7
±
1cm的39个坛紫菜品系在34℃下处理4h，然后在21℃条件下恢复培养24h，分别获得胁迫处理前的最大光化学效率fv/fm(0)、胁迫处理后的最大光化学效率fv/fm(ht)和恢复培养后的最大光化学效率fv/fm(r)。
[0081]
(4)以长度为7
±
1cm的39个坛紫菜品系藻体为研究材料，在21℃和30℃培养7天，然后计算30℃高温处理7天对日增重速度的影响δμ。
[0082]
δμ＝wgr
(21℃)-wgr
(30℃)
。
[0083]
(5)将步骤(3)中获得的39个品系的fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)和步骤(4)中获得的39个品系的δμ代入如下公式：
[0084][0085]
得出常数a、b和c分别为-0.3616，-0.1278和-0.004112。图5表明htd与7天30℃处理导致的日增重率降幅δμ的拟合优度r2》0.5，表明本发明可以用于评估不同坛紫菜品系的耐高温能力。
[0086]
(6)将上一步所得常数代入如下关系式：
[0087][0088]
即可得定量评价公式。代入坛紫菜藻体的fv/fm值即可用于计算每个品系的htd值。htd值越小，耐高温能力越强。
[0089]
(7)以wo100-4、wo112-4、wo59-1、wo130和z-26-bg坛紫菜品系为样品，按照步骤(3)的方法获得fv/fm(0)、fv/fm(ht)和fv/fm(r)，并根据步骤(6)的公式计算htd值，结果如表1所示。
[0090]
表1 5个坛紫菜品系的htd值
[0091][0092]
注：所有实验数据均以平均值
±
标准差表示。
[0093]
基于htd值筛选出高温耐受品系wo100-4和wo112-4，以及高温敏感品系wo59-1，然后用传统方法(30℃下培养7天)评价了这3个品系的耐高温能力，并与之前发现的高温耐受品系z-26-bg和高温敏感品系wo130做了对比。图6和图7表明，高温耐受品系的藻体生长的降幅较轻，而敏感品系藻体出现腐烂，生长受大幅度抑制。验证了本发明方法的可行性。
[0094]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。