生物试样摄像方法及生物试样摄像装置的制作方法

专利名称：生物试样摄像方法及生物试样摄像装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于以适当的分辨率来解析发出微弱光的生物试样内的观 察对象部位的解析方法及解析装置。另外，本发明在本申请中适用本申请
人的国际申请PCT/JP2006/319589中记载的方法和装置，由此在本发明中 引入其记载。
本发明涉及对发出微弱光的生物试样内的观察对象部位进行摄像的生 物试样摄像方法和生物试样摄像装置。
本发明涉及对细胞或组织等生物试样中的生物学活性在尽量不损害其 活性的情况下长时间或连续地进行检测的方法。本发明还包括用于通过该 方法执行的自动化装置的软件。
背景技术：
目前，利用荧光的生物试样的成像手法对于生命科学的研究发挥着 巨大的作用。通过标记特定的蛋白质并利用发光，可以观察在细胞内外发 生的各种生命现象，另外，可以实时地了解各种生命现象的动态行为。特 别是，最近通过使用GFP (绿色荧光蛋白)等荧光蛋白质，可以稳定且容 易地实现细胞内的结构物的成像，各种生命现象的阐释着实地有所发展。
另外，还经常将表达生物发光性蛋白(具体而言有荧光素酶和水母发 光蛋白等)的发光相关基因用于细胞内的各种功能解析(具体而言是将发 光相关基因作为蛋白质表达的报告分子来活用)。而且，在进行这种功能解 析的方面，非常重要的是将透镜的焦点对准细胞内的特定部位而描绘出鲜 明的图像，或高效地接收来自导入细胞内的特定的生物发光性蛋白质的发 光。然而，由于来自生物试样的本身发光的光强度一般极其微弱，因此通 常多难以用肉眼直接确认来自生物试样的发光。当然，即使相对于发出这 种微弱光的试样调整光学元件(例如检测体系的透镜等)，也难以用肉眼将 透镜的焦点对准试样内的特定部位。
这里，对于将光聚焦在试样容器内的试样上的方法已公开了各种方法。
5但是，均为能够用肉眼(目视)确认来自试样的光的情况下的方法。例如， 专利文献1和专利文献2公开了下述方法检测试样容器的底面位置，基 于所检测的位置信息，将光聚焦在试样容器内的试样上。专利文献1中， 透过物镜向试样容器的底面照射光，边上下移动光的照射位置边依次检测 来自试样容器底面的镜面反射光的强度，基于所检测的光的强度来检测试 样容器的底面位置，基于所检测的位置信息来推断试样容器内的试样的位 置，将光聚焦在所推断的位置上。另外，在专利文献2中，透过物镜从下 方斜向地向试样容器的底面照射光，利用光检测器检测来自试样容器底面 的镜面反射光在XY平面上的偏离量，基于所检测的偏移量来检测试样容 器在光轴上的底面位置，基于所检测的位置信息来推断试样容器内的试样 的位置，将光聚焦在所推断的位置上。由此，可以将物镜的焦点位置对准 试样容器内的试样。
另外，专利文献3和专利文献4公开了下述方法使用在明视野中观 察细胞等相位物体的显微镜，将物镜的位置从通常的聚焦位置向前后偏移 并固定，获得散焦所产生的高对比度的观察图像，从而观察细胞。由此， 能够以高对比度获得作为相位物体的细胞的观察图像。在生物学领域和医学领域的研究中， 一直广泛利用通过报告基因分 析来检测细胞等生物试样的生物学活性的技术。使用报告基因分析时，能 够将视觉上无法研究的各种生物学活性可视化。以往的临床检查中，通过 各种分离方法从生物试样中仅分离出想要研究的生物体相关物质(核酸、 血液、激素、蛋白质等)，并使该分离的生物体相关物质的量或活性与试剂 反应。但是，生命体中，只有多样生物体相关物质之间的相互作用才显示 真正的生物学活性。近年来，在研究或开发医疗用药剂时，对活生物试样 中的生物学活性最有效地发挥作用的药剂成为决定性条件。在以活生物试 样为对象的报告基因分析中，将生物试样和想要研究的生物体相关物质图 像化、并经时地观察生物试样内外的动态变化的必要性有所提高。
具体地说，在利用使用作为报告物质的发光(生物发光、化学发光) 或荧光的观察的研究领域中，为了捕获试样内的蛋白质分子的动态功能表
达，需要延时(time lapse)或动态摄像。现状下， 一直进行的是以荧光试 样为对象而拍摄的图像的动态变化的观察(例如利用荧光的蛋白质1分子的动态观察)。进行荧光试样的摄像时，具有由于连续照射激发光，从荧光 试样发出的光量随着时间的经过而减少的性质，因此难以经时地拍摄能够 用于定量评价的稳定的图像，但是可以在很短的曝光时间内拍摄鲜明、即 空间分辨率高的图像。另一方面，在以发光试样为对象的图像的动态变化 经时观察中，由于来自发光试样的发光极小，因此在发光试样的观察中， 使用安装有图象增强器的CCD相机来进行。为发光试样的摄像时，由于不 需要照射激发光，因此可以经时地拍摄能够用于定量评价的稳定的图像。
以往，在发光试样的观察中， 一直进行来自发光试样的发光量的测定。 例如，在导入有荧光素酶基因的细胞的观察中，为了研究荧光素酶基因的 表达强度(具体地为表达量)， 一直进行的是荧光素酶活性所引起的来自细 胞的发光量的测定。并且，荧光素酶活性所引起的来自细胞的发光量的测 定按照以下顺序进行首先使溶解有细胞的细胞溶解液与含有荧光素或 ATP或镁等的底物溶液发生反应，接着利用使用了光电倍增管的亮度计来 定量来自与底物溶液反应过的细胞溶解液的发光量。即，发光量在溶解细 胞后进行测定。由此，可以将某个时间点的荧光素酶基因的表达量作为整 个细胞的平均值来测定。这里，将荧光素酶基因等发光基因作为报告基因
导入细胞内的方法例如有磷酸钙法、脂质体(Lipofectin)法或电穿孔法等， 各方法根据目的和细胞种类的不同而分开使用。另外，在导入荧光素酶基 因作为报告基因的细胞中，将荧光素酶活性所引起的来自细胞的发光量作 为指标来研究荧光素酶基因的表达强度时，通过在导入细胞内的荧光素酶 基因的上游或下游连接目标DNA片段，可以研究该DNA片段对荧光素酶 基因的转录带来的影响，另外，通过将认为对导入细胞内的荧光素酶的转 录有影响的转录基因等基因连接于表达载体，使其与荧光素酶共表达，从 而可以研究该基因的基因产物对荧光素酶基因的表达带来的影响。
另外，随着时间经过捕获发光基因的表达量时，有必要经时地测定来 自活细胞的发光量。而且，来自活细胞的发光量的经时测定按照以下顺序 进行首先对培养细胞的培养箱赋以亮度计的功能，接着利用亮度计每隔 一定时间对来自正在培养的总细胞集团的发光量进行定量。由此，可以测 定具有一定周期性的表达节奏等，由此，可以捕获整个细胞中的发光基因 的表达量的经时变化。另一方面，当发光基因的表达为一过性时，各个细胞内的表达量有很大偏差。例如，即便是HeLa细胞等经克隆化的培养细胞， 介由细胞膜表面的受体的药剂的响应在各个细胞中有时也有偏差。即，即 便没检测出作为细胞整体的响应，也有数个细胞发生响应的情况。由此可 知，在发光基因的表达为一过性时，重要的是经时地对来自各个细胞而并 非对来自整体细胞的发光量进行测定。而且，使用显微镜的对来自活的各 个细胞的发光量的经时测定由于各细胞的发光极弱，因此一直利用液氮温 度水平的冷却CCD相机来进行长时间曝光、或者使用安装有图象增强器的 CCD相机和光子计数装置来进行。由此，可以捕获活的各个细胞中的发光 基因表达量的经时变化。
在以上的说明中，例如专利文献5中公开了使用荧光蛋白质作为报告 基因的基因表达的解析方法和装置。另外，专利文献6中公开了使用亮度 计并利用生物发光的基因表达的解析方法和装置。
专利文献1:日本特表2002-541430号公报
专利文献2:日本特表2002-542480号公报
专利文献3:日本特开2004-354650号公报
专利文献4:日本特开2005-173288号公报
专利文献5:日本特表2004-500576号公报
专利文献6:日本特开2005-118050号公报 但是，以试样内的特定部位作为观察对象部位来进行该观察对象部 位的发光观察时，由于在设置试样的时间点，来自试样的发光微弱或还未 发生，因此在现有的技术中，在设置试样的时间点无法确定对准该观察对 象部位的物镜的焦点位置，因此具有无法使物镜的焦点位置对准该观察对 象部位、无法迅速且准确地进行生物试样的解析的问题。

发明内容
本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于提供迅速且准确地进行微弱 光的生物试样的解析的微弱光图像的解析方法和解析装置。
另外，本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于提供迅速且准确地进 行微弱光的生物试样的摄像的生物试样摄像方法和生物试样摄像装置。 但是，对微弱发光的发光试样进行摄像时，由于来自发光试样的发光量极少，因此无论如何用肉眼也无法观察，具有如果不使用CCD等蓄积 型摄像装置来蓄积光量，则无法生成图像的限制。而且，在单一的细胞或 构成组织的细胞群中，由每个细胞发出的微弱光过弱，因此具有拍摄鲜明 图像所需的曝光时间延长的问题。S口，由于摄像的时间间隔受到每单位时 间的光量的制约，因此对微弱发光的发光试样进行摄像时，具有即便能够
以长时间间隔、例如60分钟的间隔经时地拍摄鲜明的图像，也无法以10 30 分钟左右的短曝光时间、甚至1 5分钟的曝光来实时地进行摄像的问题。 特别是对活细胞进行长时间(例如50分钟以上)曝光时，有时甚至在培养 容器等支撑体上细胞本身也会移动而无法形成鲜明的图像。 一般来说，为 了进行使用图像的解析，必须识别准确的轮廓。因此，在图像不鲜明吋， 有可能解析结果会不准确。
本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于提供即便是发光量少的发光 材料，也可以在短的曝光吋间内、甚至实时地拍摄鲜明图像的生物试样的 摄像方法及摄像装置。为了解决上述课题以达成目的，本发明的微弱光图像的解析方法的 特征在于，在对发出微弱光的生物试样进行图像解析时，对生物试样的预 解析对象部位使用与上述微弱光不同种类的电磁能以确定与上述对象部位 相关的至少一个基准位置，然后确定相对于上述基准位置的对应于上述对 象部位的微弱光用的焦点位置，瞄准所确定的焦点位置，执行利用上述微 弱光的图像化，从微弱光图像中提取必要的测定参数的数值，基于所提取 的参数数值进行对象部位的评价。另外，本发明的微弱光图像的解析方法 为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在于，上述基准位置的确定包括 利用上述电磁能来获取基准图像。另外，本发明的微弱光图像的解析方法 为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在于，所述基准图像的获取是对 包括上述对象部位的试样区域获取图像。另外，本发明的微弱光图像的解 析方法为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在于，上述电磁能为对生 物体的损伤小的可见光、近红外线、超声波、磁力线中的任一种。
另外，本发明的微弱光图像的解析方法的特征在于，对发出直接可视 化困难的微弱光的生物试样照射易于可视化的照射光来进行可视化，对于 上述经可视化的生物试样所产生的基准图像，确定接收来自上述基准图像的光的物镜的近点侧的焦点位置和/或物镜的远点侧的焦点位置为基准位 置，确定与由上述生物试样的预解析对象部位发出的微弱光的图像化所需 要的距离相当的位置作为利用上述物镜的微弱光用焦点位置，将上述物镜 瞄准所确定的微弱光用焦点位置，蓄积微弱光直至获得必要的图像，从而 形成上述生物试样的微弱光图像，然后由所形成的上述微弱光图像来评价 上述对象部位的微弱光的有无或光强度。另外，本发明的微弱光图像的解 析方法为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在于，直接可视化在用于 形成光学图像的曝光时间为IO秒以上时定义为可视化困难。另外，本发明 的微弱光图像的解析方法为上述记载的微弱光图像的解析方法，其特征在 于，基于上述照射光的图像信号为透射光或荧光。
这里，作为本发明的微弱光图像的解析方法，在上述记载的微弱光图 像的解析方法中，上述微弱光用焦点位置的确定优选在每个上述生物试样 的观察部位处进行。另外，本发明的微弱光图像的解析方法为上述的微弱 光图像的解析方法，其中，上述基准位置和上述焦点位置在物镜的同一光 束路径上确定。
另外，作为本发明的微弱光图像的解析方法，在上述的微弱光图像的 解析方法中，优选在对应于检查项目的多个时刻执行上述微弱光图像的获 取，从而蓄积多个微弱光图像，对照所蓄积的多个上述微弱光图像中的观 察对象部位，按照每个时刻比较所对照的多个微弱光图像。
另外，作为本发明的微弱光图像的解析方法，在上述的微弱光图像的 解析方法中，优选在脱离将上述基准图像和上述微弱光图像的各自焦点位 置进行比较而设定的距离范围时，再次执行基准图像和/或微弱光图像的获 取。另外，本发明的微弱光图像的解析方法的特征在于，上述微弱光图像 的评价进一步包括从上述基准图像获取测定参数，与来自上述基准图像的 测定数据相关联，评价上述微弱光参数。另外，对于作为变形例的本发明 的微弱光图像的解析方法，通过与上述基准图像中的对象部位的轮廓信息 相关联来评价上述微弱光图像，从而将使用2个以上不同种类图像的图像 处理进行组合，由此可以最大限度地发挥出与微弱光相关的评价能力。
另外，本发明的微弱光图像的解析方法为上述的微弱光图像的解析方 法，其中，评价是相当于上述对象部位轮廓的单位面积的微弱光强度。另
10外，作为本发明的微弱光图像的解析方法，可以为上述的微弱光图像的解 析方法，其特征在于，评价是确定上述对象部位的轮廓中的微弱光的位置 或分布。
另外，作为本发明其它形态的微弱光图像的解析方法为上述的微弱光 图像的解析方法，其特征在于，上述生物试样被分别收容在多个收容部中， 按照各个收容部执行上述基准位置。该收容部可以举出将多个作为收容部 的孔一体化而成的微孔板。另外，还包括将多个收容部分别载置并根据需 要进行搬送的情况。本发明提供适于评价来自收容在多个收容部中的生物 试样的微弱光的解析方法。这里，本发明的微弱光图像的解析方法如果使 用以在包括多个收容部的广角视野下执行上述微弱光图像的获取为特征的 上述微弱光图像的解析方法，则不仅没有必要按照每个收容部获取微弱光 图像，而且可以在不放过每个收容部的微弱光变化的情况下进行评价。本 发明的微弱光图像的解析方法为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在 于，通过以光学的方式和/或以电的方式放大上述微弱光图像，从而从上述 对象部位获得测定参数。
以上的本发明的微弱光图像的解析方法中，作为本发明的微弱光图像 的解析方法，以上述生物试样为活细胞或组织为特征，由此，可以进行细 胞学或遗传学的解析，从此方面来说是优选的。另外，本发明的微弱光图 像的解析方法为上述的微弱光图像的解析方法，其特征在于，所述微弱光 为伴随生物发光性蛋白质的表达的发光，由此可以进行每个细胞的基因表 达的解析，从此方面来说是优选的。
另外，本发明涉及生物试样摄像方法，本发明的第1方面的生物试样 摄像方法为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板的所述收容部中的发 出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像方法，其特征在于，移动上 述基板和/或上述物镜直至所需的上述收容部进入上述物镜的视野内，测量 上述物镜的近点侧的焦点位置和域上述物镜的远点侧的上述焦点位置，基 于所测量的上述焦点位置，确定与收容在上述所需的上述收容部中的上述 生物试样内的观察对象部位对准的上述物镜的上述焦点位置，并使上述物 镜的上述焦点位置对准所确定的上述焦点位置，介由上述物镜对上述生物 试样进行摄像，从而获得该生物试样的发光图像。另外，本发明的第2方面的生物试样摄像方法是如上述第1方面所述 的生物试样摄像方法，其特征在于，移动上述基板和/或上述物镜直至上述 所需的上述收容部进入上述物镜的视野内时，测量该基板和/或该物镜的移 动到达地的位置，使有关所测量的上述移动到达地的上述位置的移动到达 地位置信息与用于识别该所需的上述收容部的收容部识别信息相关联，并 进行存储。
另外，本发明涉及生物试样摄像方法，本发明的第3方面的生物试样 摄像方法为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板的所述收容部中的发 出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像方法，其特征在于，包括以 下步骤移动步骤，其将上述基板和/或上述物镜进行移动直至所需的所述
收容部进入上述物镜的视野内；光照射步骤，其向上述生物试样照射光； 焦点位置改变步骤，其将上述物镜的焦点位置进行改变；焦点位置测量步 骤，其对上述焦点位置改变步骤中改变了的焦点位置进行测量；光照射试 样摄像步骤，其在上述焦点位置改变步骤中改变了的焦点位置处，对在上 述光照射步骤中照射光后的上述生物试样进行摄像；特征量计算步骤，其 基于上述光照射试样摄像步骤中摄像得到的摄像图像，计算使该摄像图像 具有特征的特征量；执行步骤，其反复执行上述焦点位置改变步骤、上述 焦点位置测量步骤、上述光照射试样摄像步骤和上述特征量计算步骤；焦 点位置选择步骤，其基于上述执行而蓄积的多个上述特征量，由执行上述 执行步骤而蓄积的多个上述焦点位置中选择至少1个上述焦点位置；焦点 位置确定步骤，其基于在上述焦点位置选择步骤中选出的上述焦点位置， 确定与收容在上述所需的上述收容部内的上述生物试样内的观察对象部位 对准的上述物镜的上述焦点位置；焦点位置对准步骤，其使上述物镜的上 述焦点位置对准在上述焦点位置确定步骤中确定的上述焦点位置；以及， 发光图像获取步骤，其介由上述物镜对上述生物试样进行摄像，从而获取 该生物试样的发光图像。
另外，本发明的第4方面的生物试样摄像方法是如第3方面所述的生 物试样摄像方法，其特征在于，在上述移动步骤中，移动上述基板和/或上 述物镜直至上述所需的上述收容部进入上述物镜的视野内，测量该基板和/ 或该物镜的移动到达地的位置，使有关所测定的上述移动到达地的上述位置的移动到达地位置信息与用于识别该所需的上述收容部的收容部识别信 息相关联，并进行存储。
另外，本发明涉及生物试样摄像装置，本发明的第5方面的生物试样 摄像装置为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板的所述收容部中的发 出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像装置，其特征在于，其具备 以下机构移动机构，其用于将上述基板和/或上述物镜进行移动直至所需 的所述收容部进入上述物镜的视野内；光照射机构，其用于向上述试样照 射光；焦点位置改变机构，其用于将上述物镜的焦点位置进行改变；焦点 位置测量机构，其用于对上述物镜的上述焦点位置进行测量；试样摄像机 构，其用于对上述生物试样进行摄像；特征量计算机构，其用于基于用上 述试样摄像机构摄像得到的摄像图像来计算使该摄像图像具有特征的特征 量；控制机构，其用于按照使上述焦点位置改变机构、上述焦点位置测量 机构、上述试样摄像机构和上述特征量计算机构反复执行的方式来控制各 个机构；焦点位置选择机构，其用于基于通过上述重复执行而蓄积的多个 上述特征量，由通过用上述控制机构使上述各个机构反复执行而蓄积的多 个上述焦点位置中选择至少l个上述焦点位置；以及，焦点位置确定机构， 其用于基于用上述焦点位置选择机构选出的上述焦点位置来确定与收容在 上述所需的上述收容部内的上述生物试样内的观察对象部位对准的上述物 镜的上述焦点位置。
另外，本发明的第6方面的生物试样摄像装置是如第5方面所述的生 物试样摄像装置，其特征在于，其进一步具有移动到达地位置测量机构， 其用于测量通过上述移动机构移动上述基板和/或上述物镜时该基板和/或 该物镜的移动到达地的位置；和存储机构，其用于使有关用上述移动到达 地位置测量机构测量的上述移动到达地的上述位置的移动到达地位置信息 与用于识别上述所需的上述收容部的收容部识别信息相关联，并进行存储。为了解决上述课题而达成目的，本发明的生物试样的摄像方法的特 征在于，将由高开口数(NA)和放大倍率决定的光学条件与需要应用的方 法或装置相联合，将与利用微弱光的摄像的联合最优化。这里，优选上述 摄像包括进行间隔条件的设定的工序，从而在不同时间内获取多个与生物 试样相关的多个图像。这里，上述方法中，通过至少含有产生微弱光的细胞，还可以进行含有细胞的图像解析。另外，本发明还是使用上述方法的 摄像装置。该装置优选与用于对产生微弱光的细胞进行解析的软件相联合。 另外，将上述的摄像装置和摄像方法具体化的发光试样摄像方法是对 发光试样进行摄像的发光试样摄像方法，其特征在于，使用以开口数(NA)
和投影倍率(|3)表示的(NA+p) 2的值为0.01以上、优选为0.039以上的 物镜。另外，本发明可以具体化为发光细胞摄像方法，其为对导入有荧光 素酶基因的发光细胞进行摄像的发光细胞摄像方法，其特征在于，使用以 开口数(NA)和投影倍率(p)表示的(NA+p) 2的值为0.01以上、优选 为0.039以上的物镜。
另外，本发明还涉及物镜，本发明的物镜为在对发光试样进行摄像的 上述发光试样摄像方法中使用的物镜，其特征在于，以开口数(NA)和投 影倍率((3)表示的(NA+p) 2的值为0.01以上，优选为0.039以上。
另外，本发明还涉及物镜，本发明的物镜为在对导入有荧光素酶基因 的发光细胞进行摄像的上述发光细胞摄像方法中使用的物镜，其特征在于， 该物镜的以开口数(NA)和投影倍率(卩)表示的(NA+(3) 2的值为0.01 以上，优选为0.039以上。
另外，本发明还涉及物镜，本发明的物镜为在对发光试样进行摄像的 上述发光试样摄像方法中使用的物镜，其特征在于，在该物镜和/或包装该 物镜的包装容器上标识有以开口数(NA)和投影倍率(p)表示的(NA^p) 2的值。通过本发明的微弱光图像的解析方法，可以迅速且准确地进行生物 试样的解析。另外，通过本发明的生物试样摄像方法和生物试样摄像装置， 可以迅速且准确地对在基板所具有的各收容部(例如微孔板所具有的各孔) 内收容的生物试样进行摄像。另外，通过本发明的生物试样摄像方法和生 物试样摄像装置，由于在移动基板和/或物镜直至所需的收容部进入物镜的 视野内时，测量该基板和/或该物镜的移动到达地的位置，使与所测量的移 动到达地的位置相关的移动到达地位置信息与用于识别该所需收容部的收 容部识别信息相关联，并进行存储，因此可以基于该移动到达地位置信息 和该收容部识别信息，移动基板和/或物镜直至所需的收容部进入物镜的视 野内。[II]根据本发明的将摄像装置和摄像方法具体化的发光试样摄像方法，
使用以开口数(NA)和投影倍率(|3)表示的(NA+p) 2的值为0.01以上、 优选为0.039以上的物镜。由此，发挥以下效果即便是发光量少的发光试
样(例如发光蛋白质(例如由所导入的基因(例如荧光素酶基因)表达的 发光蛋白质)、发光性细胞或发光性细胞的集合体、发光性的组织试样、发 光性的个体(例如动物或脏器等)等)，也可以在很短的曝光时间内、甚至 实时地拍摄鲜明的图像。另外，本发明的将摄像装置和摄像方法具体化的
发光细胞摄像方法中，由于使用以开口数(NA)和投影倍率(P)表示的 (NA+卩)2的值为0.01以上、优选为0.039以上的物镜，因此发挥以下效
果以导入有荧光素酶基因的发光细胞作为摄像对象，可以在很短的曝光 时间内、甚至实时地拍摄鲜明的图像。
另外，本发明的将摄像装置和摄像方法具体化的发光试样摄像方法和
发光细胞摄像方法中所使用的物镜由于以开口数(NA)和投影倍率(p) 表示的(NA+p) 2的值为0.01以上、优选为0.039以上，因此发挥以下效 果即便是发光量少的发光试样(例如发光蛋白质(例如由所导入的基因 (例如荧光素酶基因)表达的发光蛋白质)、发光性细胞或发光性细胞的集 合体、发光性的组织试样、发光性的个体(例如动物或脏器等)等)，也可 以在很短的曝光时间内、甚至实时地拍摄鲜明的图像。具体地说，发挥以
下效果以导入有荧光素酶基因的发光细胞作为摄像对象，可以在很短的
曝光时间内、甚至实时地拍摄鲜明的图像。
另外，本发明的将摄像装置和摄像方法具体化的发光试样摄像方法和 发光细胞摄像方法中所使用的物镜与以往的物镜相比，由于具备开口数大、 倍率小这两者，因此使用该物镜时，可以分辨率良好地摄像较宽的范围。 由此，例如可以将移动的发光试样或分布在很宽范围的发光试样作为摄像 对象。另外，该物镜在该物镜和/或包装该物镜的包装容器(包装)上标识
有以开口数(NA)和投影倍率(P)表示的(NA+f3) 2的值(例如为0.01 以上、优选为0.039以上)。由此，发挥以下效果例如进行发光图像观察 的人如果确认所标识的(NA二卩)2的值，可以容易地选择适于在很短的曝 光时间内、甚至实时地对发光试样进行摄像的物镜。


图1为示意地表示物点、光学体系的入射光瞳、射出光瞳、成像面的图。
图2为表示边移动物镜边用CCD相机摄像细胞时的CCD相机各像素 的输出信号变化方式的一例以及对应于该变化方式示意地描绘出的培养皿 的位置和细胞的位置的图。
图3为表示在图2的位置a处摄像细胞时的CCD相机的特定像素列所 含的各像素的光强度分布以及在图2的位置|3处摄像细胞时的CCD相机的 特定像素列所含的各像素的光强度分布的图。
图4为表示关于摄像2个照明图像时的物镜光轴上的焦点位置和摄像 发光图像时的物镜光轴上的焦点位置的测定结果的图。
图5为示意地表示物镜的焦点位置对准培养皿外侧底面的位置时的物 镜焦点位置的图。
图6为表示在近点侧摄像的最高对比度的照明图像和发光图像的图。
图7为示意地表示摄像图6的图像时的物镜焦点位置的图。
图8为表示在中心点摄像的最高对比度的照明图像和发光图像的图。
图9为示意地表示摄像图8的图像时的物镜焦点位置的图。
图10为表示在远点侧摄像的最高对比度的照明图像和发光图像的图。
图11为示意地表示摄像图10的图像时的物镜焦点位置的图。
图12为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1的基本构成的图。
图13为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的图。
图14为表示配置在试样台17附近的各部的构成的一例的图。 图15为表示开口单元24的构成和物镜30的光瞳的开口投影像的一例 的图。
图16为表示开口单元24的另一构成和物镜30的光瞳的开口投影像的
一例的图。
图17为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1的构成的另一具体例 的图。
图18为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1所进行的焦点位置确定处理的一例的流程图。
图19为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1所进行的焦点位置再 确定处理的一例的流程图。
图20为表示第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的图。
图21为表示第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的另一具体例的图。
图22为表示第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的又一具体例 的图。
图23为表示导入有质粒载体的HeLa细胞的照明图像和荧光图像的图。
图24为表示导入有质粒载体的HeLa细胞的照明图像和发光图像的图。
图25为表示来自所选定的序号1的HeLa细胞的发光强度的时间变化 的图。
图26为表示用于实施本实施方式的发光试样摄像方法的装置的构成 的一例的图。
图27为表示标识有(NA+(3) 2的值的物镜2A的一例的图。
图28为表示将图26所示的微弱光样本摄像装置配置在遮光装置内并
从外部进行自动控制时的构成的图。
图29为表示内部保持有图28所示的样品1B且环境条件可变的收容器
的构成的图。
图30为表示作为本实施方式应用例的高通量摄像装置的整体构成的 概念图。
图31为将可适用于本实施方式的培养装置和显微镜装置一体化而成 的本发明的摄像装置的内部构成图。
图32为表示高通量摄像装置的可电控单元的模块图。
图33为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装 置1的构成的具体一例的图。
图34为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的图。
图35为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装 置1的构成的具体一例的图。
图36为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装
置1的构成的具体一例的图。
图37为表示第3实施方式的检査系统的构成的具体一例的图。 图38为表示在第3实施方式的检査系统中使用的微孔板的构成的具体 一例的图。
图39为表示第3实施方式的检査系统的变形例的构成的具体一例的图。
图40为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装 置1所进行的生物试样摄像-解析处理的一例的流程图。
图41为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装 置1所进行的焦点位置确定处理的一例的流程图。
符号说明
1焦点位置确定装置 10试样(生物细胞) 10a观察对象部位 20光照射部(光源) 30物镜
40焦点位置改变部(物镜z轴移动机构) 50焦点位置测量部 60试样摄像部(CCD相机) 70信息处理装置(个人计算机) 70a控制部
70al特征量计算部
70a2焦点位置选择部
70a3焦点位置确定部
70a4特征量比较部
70a5焦点位置再确定部70b存储部
70bl摄像图像数据库 70b2焦点位置管理文档 80激发光照射部(激发用光源)
具体实施例方式以下，基于附图详细地说明本发明的微弱光图像的解析方法和解析 装置及生物试样摄像方法和生物试样摄像装置的实施方式(第1实施方式、 第2实施方式和第3实施方式)。另外，该实施方式并不会限定本发明。
首先，参照附图详细地说明本发明的基本原理。本发明是确定成为基 准的物镜的焦点位置，以所确定的焦点位置为基准，测量物镜的近点侧焦 点位置(大致焦点位置)和/或物镜的远点侧焦点位置(大致焦点位置)， 基于所测量的焦点位置来确定与试样内的观察对象部位对准的物镜的焦点 位置，将物镜的焦点位置对准(移动)至所确定的焦点位置。
具体地说，本发明中，(1)向试样照射光，(2)例如在光轴方向上移 动试样的位置和/或物镜的位置、和/或改变物镜的焦点距离(此时采用可变 焦物镜)，从而仅以例如一定量改变物镜的焦点位置，(3)测量所改变的焦 点位置，(4)在所改变的焦点位置上使用CCD相机对经光照射的试样进行 摄像，(5)基于所摄像的摄像图像，计算使摄像图像带有特征的特征量(例 如摄像图像的对比度、摄像图像的亮度积分值、由摄像图像的亮度分布获 得的统计量、具有超过摄像图像的规定阈值的亮度的像素数与总像素数之 比等)，(6)反复执行(2) (5)， (7)基于执行后所蓄积的多个特征量， 从反复执行后蓄积的多个焦点位置(表示物镜焦点位置的光轴上的坐标值) 中选择至少一个焦点位置(具体地为物镜的近点侧焦点位置和/或物镜的远 点侧焦点位置)，(8)基于所选出的焦点位置，确定对准试样内观察对象部 位的物镜的焦点位置，(9)例如在光轴方向上移动试样的位置和域物镜的 位置、和/或改变物镜的焦点距离(此时采用可变焦物镜)，从而使物镜的 焦点位置对准(移动)至所确定的焦点位置。这里，本发明也可以在上述(7)中，基于执行后蓄积的多个特征量， 从执行后蓄积的多个焦点位置中选择2个焦点位置(具体地为物镜的近点 侧焦点位置(大致焦点位置)和物镜的远点侧焦点位置(大致焦点位置))，
在上述(8)中，基于所选出的2个焦点位置，将该2个焦点位置的中央位
置(大致中央位置)确定为对准试样内观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明中也可以在上述(7)中，基于执行后蓄积的多个特征量， 从执行后蓄积的多个焦点位置中选择1个焦点位置(具体地为物镜的近点 侧焦点位置(大致焦点位置)或物镜的远点侧焦点位置(大致焦点位置))， 在上述(8)中，基于所选出的1个焦点位置和预先确定的距离，将离开该 焦点位置恰好为该距离的位置确定为对准试样内观察对象部位的物镜的焦 点位置。
另外，本发明中也可以(10)在上述(8)中确定的焦点位置上使用 CCD相机对试样的发光图像进行摄像，(11)基于所摄像的摄像图像计算 特征量，(12)改变上述(8)中所确定的焦点位置，(13)在所改变的焦点 位置上使用CCD相机对试样的发光图像进行摄像，(14)基于所摄像的摄 像图像计算特征量，(15)比较(11)中所计算的特征量和(14)中所计算 的特征量，(16)当比较的结果是上述(14)中计算的特征量更大时，将(12) 中改变的焦点位置确定为对准试样内观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明中还可以在上述(1)中使用的含有光源的照明光学体系 的光瞳位置上配置开口，使其例如相对于光轴偏芯，还可以在上述(1)中 使用的含有光源的照明光学体系中配置狭带通滤波器。另外，本发明中， 作为上述(1)中使用的光源，还可以使用发出单色可见光的光源。另外， 本发明中，作为试样，还可以使用生物细胞或组织等。
这里，以使用生物细胞作为试样的情况作为一例，参照图1说明在摄 像图像(利用照明光得到的图像)中产生与生物细胞的相位分布成比例的 对比度的原理。图1为示意地表示物点、光学体系的入射光瞳、射出光瞳、 成像面的图。
将生物细胞(物体)配置在聚焦位置后向物体照射光时，如图1所示， 由物点发出的光如实线所示扩散成球面状并入射到入射光瞳中，入射至入 射光瞳的光从射出光瞳射出，从射出光瞳射出的光如实线所示成为球面状的会聚光并聚光在成像面上，从而最终形成物体的像。另外，在成像之前 的过程中，在透过光学体系的各光线之间不会产生光路差(相位差)，图像 不会出现模糊。接着，将物点移动至虚线所示的位置后向物体照射光时， 如图1所示，由物点射出的光如虚线所示扩散成球面状并入射到入射光瞳 中，入射至入射光瞳的光从射出光瞳射出，从射出光瞳射出的光如虚线所 示成为球面状的会聚光并聚光在移动后的成像面上，从而最终形成物体的 像。由上所述，将移动后的成像面位置作为观察点来观察物体时，在透过 光学体系的各光线之间不会产生光路差(相位差)，但以当初的成像面位置 作为观察点来观察物体时，在各光线之间就会产生光路差(相位差)。
另外，生物细胞通常作为光学上的相位物体来处理。生物细胞通常为 大致相同的形状。因此，向例如分布在培养皿内的培养生物细胞入射照明 光时，生物细胞起到衍射光栅的作用，依赖于生物细胞的形状，照射光在 特有方向上衍射，可观察到衍射光。即，从特定方向向培养皿内的细胞入 射照明光时，由于细胞，入射光发生衍射，在入射光的方向上产生0次衍 射光(透射光)，进而在相对于透射光为特定角度的方向上产生1次衍射光。
由上所述，通过将生物细胞配置在偏离光学体系聚焦位置的位置上， 可以在透过光学体系的各光线之间产生相位差。另外，通过在从观察光学 体系的聚焦位置前后偏离的位置上观察生物细胞，在透过生物细胞的光与 在生物细胞上衍射的光之间可以产生对应于从聚焦位置的偏离量(散焦量) 的相位差。具体地说，按照物镜的焦点位置对准作为通常观察的聚焦位置 的位置的方式使物镜沿光轴移动，通过将物镜从该移动的位置进一步仅移 动微小量，可以在观察光学体系的透过的各光线之间产生与移动量成比例 的相位差。另外，该相位差在透过物镜的最大NA的光线中为最大。另外，
此时，由于偏射照明，衍射光的一部分被衍射到物镜的NA夕卜，不会透过
观察光学体系，因此与折射光的情况相同，可以形成具有浮凸感的对比度的像。
艮口，利用这些现象，可以获得生物细胞的鲜明的、利用照明光的图像 (照明图像)，可以进行与相位差显微镜或微分干涉显微镜同样的观察。另 外，作为结果，所产生的相位差量发挥与相位差观察法中所用相位膜相同 的作用，可以对观察图像赋予与生物细胞的相位分布成比例的对比度，可以以高对比度观察无色透明的生物细胞。
另外，以更高对比度观察生物细胞时，如果降低观察光学体系的倍率， 则透过观察光学体系的衍射光的角度受限，因此可以提高观察图像的对比
另外，观察生物细胞等相位物体时，与相位物体的相位分布成比例的 对比度与相位物体的相位量和赋予至透射光和衍射光之间的相位差量成比 例。另外，透射光和衍射光之间的角度依赖于相位物体的形状而改变。而 且，当透射光和衍射光之间的角度改变时，即便是相同的散焦量，在2个 光束之间产生的相位差量也会不同。因此，通过在显微镜的照明光学体系 的光瞳位置处配置开口，使其相对于照明光学体系的光轴偏芯，可以生成 以相对于物体为特定的角度照射的照明光。而且，通过使开口偏芯，由于 可以将与透过向物体的入射光方向的透射光相比更具有角度的衍射光入射 到光学体系的入射光瞳，因此可以进一步增大透射光和衍射光的相位差。 换而言之，通过使开口从照明光学体系的光轴偏芯地配置，可以使衍射光 相比较于透射光带有更大角度，因此可以进一步增大透射光和衍射光的相
位差(参照日本特开2004-354650号公报)。即，通过这些方法增大透射光 和衍射光的相位差时，可以进一步提高观察图像的对比度。
另外，对于通过散焦所产生的各光线间的相位差，在物体从观察光学 体系的聚焦位置偏离至近点侧的情况和偏离至远点侧的情况下，其符号发 生改变。因此，通过散焦，可以在光轴上的2个位置获得物体的高对比度 图像。另外，对于图像的对比度，在将培养细胞等相位物体从观察光学体 系聚焦位置偏离至近点侧而观察到的图像以及偏离至远点侧而观察到的图 像中，相当于该相位物体的相位分布而发生反转。另外，由于吸收来自吸 附于培养皿底面的垃圾等的光的物体并非相位物体，因此即便通过散焦赋 予该物体相位差，图像的对比度也不会发生变化。因此，通过散焦，可以 明确地区分相位物体和非相位物体。因此，通过对偏离至近点侧而摄像的 图像和偏离至远点侧而摄像的图像进行图像间演算，可以分离对通过散焦 赋予的相位差没有影响的图像成分。特别是，通过在2个图像的各像素间 进行差演算，可以使相当于物体相位分布的图像成分的对比度达到2倍， 因此，可以消除垃圾、异物、照明不均等不具有相位信息的图像成分。艮口，通过这些方法，可以进一步提高观察图像的对比度。
接着，参照图2和图3说明边移动物镜边用CCD相机对生物细胞进行 摄像时的来自CCD相机的各像素的输出信号(对应于各像素所捕获的光的 光强度的数字信号)变化方式的一例、以及基于该输出信号变化方式的对 准生物细胞内特定部位(观察对象部位)的物镜焦点位置的确定方式的一 例。在将生物细胞浸渍于放入试样容器(培养皿)的培养液中的状态下， 向生物细胞照射照明光，将物镜沿着光轴(z轴)从培养皿的下侧向上侧移 动，同时用CCD相机对生物细胞进行摄像时，来自CCD相机的全部像素 的输出信号(光强度、光检测信号)的积分值与物镜的焦点位置(z轴上的 坐标)的关系如图2 (A)所示。另外，使培养皿的位置与生物细胞的位置 与图2 (A)对应并示意地描绘时，如图2 (B)所示。
具体地说，将物镜沿着光轴向上侧移动时，来自CCD相机的全部像素 的光强度的积分值首先在照射光强烈反射的试样容器的外侧底面的位置处 极大且达到最大。然后，将物镜沿着光轴进一步向上侧移动时，来自CCD 相机的全部像素的光强度的积分值逐渐降低，在试样容器的内侧底面的位 置处再次达到极大。另外，由于试样容器的内侧底面和与其相接触的培养 液之间的折射率差小于试样容器外侧底面与空气接触面之间的折射率差， 因此试样容器内侧底面位置处的积分值小于试样容器外侧底面位置处的积 分值。然后，将物镜沿着光轴进一步向上侧移动时，来自CCD相机的全部 像素的光强度的积分值急剧降低，在图2 (A)所示的位置a处再次达到极 大。该位置a是可以获得散焦所引起的高对比度的摄像图像的z轴上的位 置。另外，在该位置a处，物镜的焦点对准生物细胞大致下侧的深处部分 (下侧边缘部)。然后，将物镜沿着光轴进一步向上侧移动时，来自CCD 相机的全部像素的光强度的积分值降低，在图2 (A)所示的位置(3处达到 极小。在该位置(3处，物镜的焦点对准生物细胞的大致中央的位置。然后， 将物镜沿着光轴进一步向上侧移动时，来自CCD相机的全部像素的光强度 的积分值增加，在图2 (A)所示的位置Y处再次达到极大。该位置Y也是 可以获得散焦所引起的高对比度的摄像图像的z轴上的位置。在该位置Y 处，物镜的焦点对准生物细胞的大致上侧的边缘部分(上侧边缘部)。
艮口，图2 (A)所示的位置a至位置Y的区域(包括位置卩)中，由于
23物镜的焦点对准生物细胞的内部，因此基于该位置a和该位置Y，可以确定 对准生物细胞内特定部位的物镜的焦点位置。另外，还可以将位置(3确定 为对准生物细胞内规定部位的物镜的焦点位置。
这里，从在图2 (A)所示位置a处对生物细胞进行摄像时的来自CCD 相机各像素的输出信号(对应于各像素捕获的光的光强度的数字信号)和 在图2 (A)所示位置(3处对生物细胞进行摄像时的来自CCD相机各像素 的输出信号中，仅将超过预先设定的阈值的输出信号作为有效的输出信号 分别选择出来，然后求得所选择的各输出信号的强度分布(参照图3)。图 3为表示在图2 (A)所示位置a处对生物细胞进行摄像时的CCD相机特 定像素列中所含各像素的光强度的分布(图3 (A))、和在图2 (A)所示 位置(3处对生物细胞进行摄像时的CCD相机的特定像素列中所含各像素的 光强度的分布(细胞内部中央附近处的输出信号的强度分布图3 (B)) 的图。另外，图3中虚线表示阈值。通过对图3所示强度分布进行统计处 理，可以确定可获得高对比度图像的物镜的焦点位置。而且，可以在光轴 上移动物镜的焦点位置的同时，执行超过高于图3所示阈值的阈值的光强 度的像素数的计算以及所计算的像素数相对于总像素数的比例(所计算的 像素数+总像素数)的计算，将该比例最高时的物镜的焦点位置确定为可获 得最高对比度图像的物镜的焦点位置。
接着，对细胞的发光图像进行实际地摄像，确认基于对高对比度的2 个图像(照明图像)进行摄像时的物镜焦点位置所确定的物镜焦点位置与 生物细胞内的中心部位(例如发光的部位)以何种程度相对准。另外，这 里所用的生物细胞为添加lmM的荧光素而导入有荧光素酶(pGL3-contro1 vector: Promega公司)的HeLa细胞。另外，发光图像为将该HeLa细胞在 室温下曝光1分钟后摄像得到的图像。
首先，在将物镜沿着光轴移动的同时用照明光源照明HeLa细胞进行 摄像，选择出在物镜远点侧处摄像的对比度最高的摄像图像(照明图像) 和在物镜近点侧处摄像的对比度最高的摄像图像(照明图像)。另一方面， 在将物镜沿着光轴移动的同时不进行照明而对HeLa细胞进行摄像，选择出 对比度最高的摄像图像(发光图像)。然后，测量对所选出的2个照明图像 进行摄像时的物镜(20倍、40倍)在光轴上的焦点位置和对所选发光图像进行摄像时的物镜(20倍、40倍)在光轴上的焦点位置。测量结果如图4
所示。另外，如图5所示，所测量的焦点位置与距离物镜的焦点位置对准
试样容器(培养皿)的外侧底面位置时的物镜在光轴上的位置(基准位置) 的距离相同。
如图4所示，对所选出的发光图像(图8 (B))进行摄像时的物镜焦 点位置(图4所示"中心点" 一栏中所记载的10.507、 10.506:图9所示的 "Zb")处于对对应于远点侧的照明图像(图10 (A))进行摄像时的物镜的 焦点位置(图4所示"远点侧" 一栏中所记载的10.512、 10.590:图11所 示"Za")和对对应于近点侧的照明图像(图6 (A))进行摄像时的物镜的 焦点位置(图4所示"近点侧"一栏中所记载的10.500、 10.503:图7所示 "Zc")的大致中央。由此可以确认，基于对所选出的2个照明图像(图6 (A)和图10 (A))进行摄像时的物镜焦点位置(图7所示"Zc"和图11所 示"Za")而确定的物镜的焦点位置对准细胞内的大致中央部位(例如发光 的部位)。即，通过上述计算，可以使物镜的焦点位置对准细胞内的大致中 央部位(例如发光的部位)。另外，图6为表示在近点侧处摄像的最高对比 度的照明图像(A)和发光图像(B)的图。图7为示意地表示对图6的图 像进行摄像时的物镜焦点位置的图。图8为表示在中心点摄像的最高对比 度的照明图像(A)和发光图像(B)的图。图9为示意地表示对图8的图 像进行摄像时的物镜焦点位置的图。图IO为表示在远点侧处摄像的最高对 比度的照明图像(A)和发光图像(B)的图。图11为示意地表示对图10 的图像进行摄像时的物镜焦点位置的图。
至此，结束本发明基本原理的说明。
接着，参照图12~图17详细地说明第1实施方式的焦点位置确定装置 1的构成。首先，参照图12说明第1实施方式的焦点位置确定位置1的基 本构成。图12为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1的基本构成的图。 焦点位置确定装置1在进行发光观察时，在设置有生物细胞或组织等试样 10时，确定对准试样10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。焦 点位置确定装置1如图12所示，由光照射部20、物镜30、焦点位置改变 部40、焦点位置测量部50、试样摄像部60和信息处理装置70构成。光照射部(光源)20向试样10照射光。光照射部20为发出可见光区
域的波长的光(可见光)的不相干光源，具体地为卤灯、LED、钨灯、汞 灯等。另外，光照射部20也可以使用激光等相干光源。但此时，由相干光 源发出的光(激光等)使用扩散板等变化成不相干的光后照射到试样10上。 另外，光照射部20还可以使用发出红外光的光源。此时，利用红外光的焦 点确定可在维持不迸行照明的状态下进行，因此可以防止发生自身荧光所 导致的图像噪音，并且可以获得较可见光更为鲜明的物体信息。gP，利用 红外光的焦点确定具有可精密地进行该焦点确定的优点。另外，即便是波 长与预检测的微弱光部分重叠的光、或者波长与该微弱光相同的光，只要 是相对于该微弱光为显著强的光强度、且可以在短时间(例如0.5秒以内) 检测的光，则也可以用作焦点确定用的照射光。
物镜30用于形成试样10的像。另外，物镜30还可以使用可变焦透镜。 为了使利用微弱光的图像化成为可能，优选物镜的以开口数(NA)和投影 倍率(:(3)表示的(NA+f3) 2的值为0.01以上、特别优选为0.071以上。通 过设定这种光学条件，可以在实用的曝光时间(l分钟 90分钟)内短时间 地获取利用微弱光的图像，可以获得相比较于通过更长曝光而获得的图像 更为鲜明的微弱光图像，因此使得利用微弱光图像的图像解析更为有利。
焦点位置改变部40具体地通过在光轴方向上移动试样10的位置和/或 物镜30的位置、及/或改变物镜30的焦点距离，来改变物镜30的焦点位 置。
焦点位置测量部50与焦点位置改变部40相连接，例如基于试样10在 光轴上的位置、物镜30在光轴上的位置、物镜30的焦点距离中的至少1 个来测量物镜30的焦点位置。
试样摄像部60对试样10进行摄像。试样摄像部60具体地为具有摄像 元件的高感度CCD相机。
信息处理装置70具体地为市售的个人计算机，并与焦点位置改变部 40、焦点位置测量部50和试样摄像部60相连接。信息处理装置70具有控 制部70a和存储部70b。控制部70a为整个控制该控制部70a的CPU等， 具有用于存储OS (操作系统)等控制程序、规定各种处理顺序等的程序和 所需数据的内部存储器，基于这些程序来进行用于执行各种处理的信息处理。
控制部70a按照反复执行焦点位置改变部40、焦点位置测量部50、试 样摄像部60、后述的特征量计算部70al的方式来控制这些各部、或控制该 控制部70a所具备的各部。另外，当键盘、鼠标等输入装置或TV监控器 等输出装置与该信息处理装置70相连接时，控制部70a获取由输入装置输 入的信息、或向输出装置输出信息。控制部70a由特征量计算部70al、焦 点位置选择部70a2、焦点位置确定部70a3、特征量比较部70a4和焦点位 置再确定部70a5构成。特征量计算部70al对基于用试样摄像部60摄像的 摄像图像而赋予摄像图像以特征的特征量(例如摄像图像的对比度、摄像 图像的亮度的积分值、由摄像图像的亮度分布获得的统计量、摄像图像中 具有超过规定阈值的亮度的像素数与总像素数之比等)进行计算。焦点位 置选择部70a2从利用控制部70a反复执行各部(具体地为焦点位置改变部 40、焦点位置测量部50、试样摄像部60、特征量计算部70al)所蓄积的多 个焦点位置(用焦点位置测量部50测量的焦点位置)中，基于反复执行所 蓄积的特征量，选择出至少l个焦点位置。焦点位置确定部70a3基于通过 焦点位置选择部70a2所选出的焦点位置，确定对准试样10内观察对象部 位10a的物镜的焦点位置。特征量比较部70a4对通过特征量计算部70al 预先分别计算出的2个特征量的大小进行比较。焦点位置再确定部70a5基 于通过特征量比较部70a4所比较的结果，再次确定对准试样10内观察对 象部位10a的物镜的焦点位置。
存储部70b为存储机构，具体地可以使用RAM或ROM等存储装置、 硬盘等固定盘装置、软盘、光盘等。存储部70b如图所示，存储摄像图像 数据库70bl和焦点位置管理文档70b2。摄像图像数据库70bl使用于唯一 识别摄像图像的图像识别信息、摄像图像、对该摄像图像进行摄像时的物 镜焦点位置、该摄像图像的特征量互相关联来存储。焦点位置管理文档70b2 存储对准试样10内观察对象部位10a的物镜焦点位置(具体地为通过焦点 位置确定部70a3确定的焦点位置或通过焦点位置再确定部70a5再次确定 的焦点位置)。这里，摄像图像包括照明图像、发光图像、荧光图像。
接着，参照图13说明第1实施方式的焦点位置确定装置1的构成的具 体一例。另外，对于与上述说明重复的部分，有时省略其说明。图13为表
27示第1实施方式的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的图。图13所示 的焦点位置确定装置1为以倒置型显微镜为基础的构成，与图12所示的焦 点位置确定装置1同样，用于进行发出微弱光的生物细胞的发光观察。图
13所示的焦点位置确定装置1除了上述各部(光照射部20、物镜30、焦点 位置改变部40、焦点位置测量部50、试样摄像部60、信息处理装置70) 之外，还具有照明光学体系、观察光学体系、目镜43等而构成。以下详细 地说明构成该焦点位置确定装置1的各部。
试样IO浸渍于放入在试样容器11的培养液中。
试样容器11具体地为培养皿，至少其底面在光学上透明(用通常的物 镜可以对应者)。另外，该底面具体地为与显微镜用盖玻片相同的材料、且 厚度为0.17mm。这里，试样容器11除了培养皿之外，还可以使用载玻片、 微孔板等。另外，对于试样容器ll，如图14所示，还可以配置盖子18。 再返回至图13，试样容器11配置在装满通过喷嘴13提供的纯水的水槽12 内。另外，该纯水是以保持试样容器11内的湿度为目的而放在水槽12内 的。
从气瓶14排出的混合气体(含有5%二氧化碳(C02)、 95%氧气(02) 的气体)通过供气管15从图示水槽12的上方以50mL/min的流速被供给至 水槽12内。另外，水槽12的形状还可以是图14所示的覆盖试样容器11 整体而将其遮掩起来的形状。此时，在水槽12的上部配置可以装卸的盖子 19。再返回至图13，水槽12配置在加热板16上。
加热板16用于设定环境温度，并配置在试样台17上。另外，加热板 16可以通过与该加热板16连接的温度控制器(未图示)的控制，以0.5。C 的间隔设定环境温度。
试样台17为用于设置试样10等的板状物，如图所示垂直于光轴(z 轴)而配置。试样台17可以通过在相互垂直的方向(90°方向)上安装于 该台规定位置的2个步进电动机(未图示)的驱动力，从配置该台的位置 沿垂直于光轴(z轴)的方向(例如x方向或y方向)移动。另夕卜，各步进 电动机由连接于该各电动机的试样台控制器(未图示)来控制。另外，试 样台控制器与信息处理装置70相连接，基于来自信息处理装置70的指令， 适当驱动各步进电动机，从而移动试样台17。照明光学体系用于将从光源20发出的照明光导向试样10，并由集光
透镜21、将照明光的光轴偏转的偏转镜22、投影光源20的像的聚光透镜 23构成。
这里，在聚光透镜23的光瞳位置上装卸自如地配置有图15 (A)所示 的开口单元24。图15为表示开口单元24的构成和物镜30的光瞌的开口投 影像的一例的图。开口单元24由部分环形的开口 24a和具有遮光性的遮光 板24b构成。开口 24a按照相对于光瞳的中心成为偏芯的状态的方式相对 于光轴配置，成为可以自如地发生横向偏移的构成。开口24a的开口径按 照该开口 24a的投影像如图15 (B)所示大致内切于物镜30的光瞳的外周 部分的方式来确定。开口24a的宽度(图15 (A)所示"Ro-Ri")优选为处 于共轭关系的物镜30的光瞳半径的1/3以下。由此，通过根据所观察的生 物细胞的种类来适当设定物镜30的移动量，可以获得最佳对比度的像。
另外，开口单元24如图16 (A)所示，也可以具有矩形的开口 24a。 图16为表示开口单元24的另一构成和物镜30的光瞳的开口投影像的一例 的图。该矩形开口 24a以相对于光瞳的中心偏芯的状态配置在仅距离光瞳 中心位置规定距离的位置上。通过使用具有该矩形开口 24a的开口单元24 来偏射照明试样IO，使开口24a的像投影于物镜30的光瞳。另夕卜，矩形开 口 24a由于相对于光瞳的中心配置为同心圆状，因此例如所观察的生物细 胞为细长时，可以获得高对比度的图像。这里，偏射照明光入射到具有立 体大小的生物细胞中，被分离成透射光、折射光和衍射光，并从生物细胞 中射出。在生物细胞内，从作为接近球或椭圆体形状的轮廓的部分，折射 光增多，从扁平部分，透射光和衍射光增多。细胞内的作为接近球或椭圆 体形状的部分处折射的折射光的一部分由于大于物镜30的NA，因此不会 进入物镜30。
另夕卜，如图17所示，还可以在偏转镜22的下侧配置用于使光源20成 为准单色的干涉滤波器25。由此，由光源20发出的照明光的行进方向通过 偏转镜22而偏转，所偏转的照明光通过干涉滤波器25，成为波段区域带宽 极窄的单色光，并朝向聚光透镜23。另外，并非限于干涉滤波器，还可使 用狭带通滤波器。
再返回至图13，观察光学体系用于形成试样10的像，并倒立配置在试样台17的下方。观察光学体系除了物镜30之外，由使物镜30所形成的
像(试样10的像)在成像面上成像的中继透镜31、将来自物镜30的光偏 转的偏转镜32、及与中继透镜31 —起使物镜30所形成的像(试样10的像) 在成像面上成像的中继透镜33构成。因此，作为与上述和后述的物镜相关 的光学条件的"(NA+p) 2"的值是指综合这些光学体系的全部透镜的条件。 另外，本发明中，在确定除了物镜以外的观察光学体系时，说明的是交换 成低倍率或高倍率的物镜时的物镜的选择条件，并非单独用物镜确定的光 学条件。本发明的实施方式中，作为除物镜以外的观察光学要素，例如可 以举出图13所示的中继透镜31、 33或图26所示的集光透镜3A。通过具 备这种观察光学体系，将用高开口数(NA)和放大倍率确定的光学条件与 应适用的方法或装置相联合，可以将与利用微弱光的摄像的联合最优化。
焦点位置改变部40具体地是利用齿条齿轮机构(未图示)使物镜30 沿光轴方向(z轴方向)移动(驱动)的物镜z轴移动(驱动)机构。齿条 齿轮机构所含的旋钮用被计算机控制的步进电动机(未图示)使其旋转。 另外，物镜z轴移动机构除了齿条齿轮机构之外，还可以通过摩擦辊机构 使物镜30沿光轴方向移动。另外，焦点位置改变部40除了使物镜30沿光 轴移动的构成之外，还可以是使试样台17沿光轴移动的构成。物镜z轴移 动机构如图所示具有物镜加热器41 。
物镜加热器41如图所示，接触于物镜30而安装在物镜30的周围。物 镜加热器41通过与该物镜加热器41连接的温度调节装置(未图示)来控 制。物镜加热器41通过从物镜30的外侧以0.5"C间隔进行物镜30的温度 设定，从而将物镜30的温度保持在恒定。
目镜43用于放大试样10的像，使观察者通过目视观察试样10的像。
转换镜44如图所示，配置在目镜43和中继透镜33之间。由此，可以 任意地转换利用目镜43的试样10的目视观察和利用试样摄像部60的试样 IO的观察。另外，作为转换镜44，除了机械地转换2个光路的形式的转换 镜之外，还可以使用利用半透明反射镜来分离2个光路的形式的转换镜。
红外线阻断滤波器45如图所示，装卸自如地配置在试样摄像部60的 受光面的上方，阻断成为背景光的红外线。换而言之，红外线阻断滤波器 45根据需要防止成为背景的红外线入射到试样摄像部60。试样摄像部60具体地为在其受光面上具有摄像元件60a的CCD相机。 该摄像元件60a的像素数为1360x1024。该CCD相机尽量使用高感度者， 以使得可以检测由试样IO所发出的微弱光。这里，作为CCD相机，为了 摄像彩色的明视野图像，还可以使用3片式滤色器。另外，试样摄像部60 并非局限于CCD相机，例如还可以使用CMOS成像传感器或SIT相机等。 试样摄像部60介由信息处理装置70 (与该信息处理装置70相连接的TV 监视器)和信号电缆而连接。为了抑制由CCD相机所发出的暗电流，在试 样摄像部60的底部上配置有冷却装置61 。
冷却装置61由珀耳帖元件构成，将试样摄像部60的温度冷却至0°C 左右并进行保温。
信息处理装置70还具有输入输出装置(TV监视器、键盘、鼠标等)。 信息处理装置70将用试样摄像部60摄像的摄像图像描绘在TV监视器中。
以上，在图13所示的焦点位置确定装置1中，首先，由光照射部20 发出的光通过集光透镜21成为平行光，该平行光被投影在聚光透镜23的 光瞳位置。然后，由光照射部20发出的光的像通过聚光透镜23作为柯拉 照明对试样10进行照明。接着，照明试样IO的光透过试样IO，入射到物 镜30。接着，入射至物镜30的光(测定光)通过物镜30、中继透镜31和 中继透镜32在成像面上形成试样10的像。然后，形成在成像面上的试样 10的像直接入射到目镜43，同时通过转换镜44成像在CCD相机60的摄 像元件60a上。
至此，结束第1实施方式的焦点位置确定装置1的构成的说明。 [3.焦点位置确定装置1的处理]
接着，参照图18说明第1实施方式的焦点位置确定装置1所进行的焦 点位置确定处理。图18为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1所进行 的焦点位置确定处理的一例的流程图。另外，这里，对使用图13所示的焦 点位置确定装置1进行生物细胞的发光观察时的焦点位置确定处理进行说 明。
观察者将放入有作为试样10的生物细胞的试样容器11设置在试样台 17上，启动焦点位置确定装置1和光源20，则焦点位置确定装置l进行以 下的处理。首先，焦点位置确定装置1将由光源20发出的照明光照射至生物细胞 (步骤SA-1)。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使作为 焦点位置改变部40的物镜z轴移动机构动作，利用物镜z轴移动机构将物 镜30从初期位置沿着光轴仅移动一定量，从而改变物镜30的焦点位置(步 骤SA-2)。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点 位置测量部50动作，通过焦点位置测量部50来测定物镜30的焦点位置(步 骤SA-3)。
接着，焦点位置确定位置1通过信息处理装置70的控制部70a使作为 试样摄像部60的CCD相机动作，通过CCD相机对生物细胞进行摄像(步 骤SA-4)。
接着，焦点位置确定位置1通过信息处理装置70的控制部70a使特征 量计算部70al动作，通过特征量计算部70al，基于在步骤SA-4中摄像的 摄像图像，计算该摄像图像的对比度(步骤SA-5)。
这里，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使步骤 SA-3中测量的焦点位置、步骤SA-4中摄像的摄像图像和步骤SA-5中计算 的对比度相互关联，并存储在存储部70b的摄像图像数据库70bl中。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a，反复 执行步骤SA-2 步骤SA-5，直至步骤SA-2中所改变的物镜30的焦点位置 越过光轴上的预先设定的位置(步骤SA-6)。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点 位置选择部70a2动作，通过焦点位置选择部70a2，选择出存储在摄像图像 数据库70b 1中多个对比度中成为极大的2个对比度，对应所选出的对比度， 获得存储在摄像图像数据库70bl中的焦点位置(步骤SA-7)。换而言之， 焦点位置确定位置1通过焦点位置选择部70a2，基于存储在摄像图像数据 库70bl中的多个特征量，从存储在摄像图像数据库70bl中的多个焦点位 置中选出物镜30的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)和物镜30的远点 侧的焦点位置(大致焦点位置)。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点位置确定部70a3动作，通过焦点位置确定部70a3，基于步骤SA-7中选出 的2个焦点位置，将这2个焦点位置的中央位置(大致中央的位置)确定 为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置(步骤SA-8)。
接着，焦点位置确定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使物镜 z轴移动机构动作，通过物镜z轴移动机构，按照物镜30的焦点位置对准 在步骤SA-8中所确定的中央的位置(大致中央的位置)的方式，调整物镜 30的位置(步骤SA-9)。使用如此调整后的焦点位置获取作为微弱光图像 的发光图像，并对发光图像进行图像解析(步骤SA-IO、 11)。该图像解析 通过与进行光照射而获得的照明图像一起进行图像解析，可以进行更为迅 速且准确的解析。
如以上说明，第1实施方式的焦点位置确定装置1通过光源20向生物 细胞照射照射光。然后，焦点位置确定装置1在通过物镜z轴移动机构沿 着光轴每次一定量地反复移动物镜30的同时，在每次移动时通过焦点位置 测量部50来测量物镜30的焦点位置，通过CCD相机照明生物细胞并进行 摄像，通过特征量计算部70al，计算所摄像的摄像图像的对比度。然后， 焦点位置确定装置1通过焦点位置选择部70a2选择出2个在通过反复移动 物镜30而蓄积的多个对比度中成为极大的对比度，从反复移动物镜30而 蓄积的多个焦点位置中获取对对应于所选对比度的摄像图像进行摄像时的 物镜30的焦点位置。然后，焦点位置确定装置1通过焦点位置确定部70a3， 基于所获得的2个焦点位置，将这2个焦点位置的中央位置(大致中央的 位置)确定为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，通 过物镜z轴移动机构，移动物镜30，使物镜30的焦点位置对准所确定的焦 点位置。由此，将生物细胞内的特定部位作为观察对象部位10a进行该观 察对象部位10a的发光观察时，在设置有生物细胞时，可以确定对准该观 察对象部位10a的物镜30的焦点位置，结果，可以使物镜30的焦点位置 对准该观察对象部位10a。具体地说，通过焦点位置确定装置l，利用使用 包括透镜的放大成像光学机构来观察发出微弱光的生物细胞、或测定来自 该生物细胞的发光、例如观察来自生物细胞内的生物发光蛋白所产生的微 弱发光的显微镜，即便不确认来自生物细胞的发光，也可以使物镜的焦点 自动地对准生物细胞内的发光的部位(生物发光蛋白质局部存在的部位)。
33因此，使用包括透镜的放大成像光学机构来观察发出微弱光的试样时，与 依靠手动进行的情况相比，可以迅速且精度良好地将物镜的焦点位置设定 在试样内的目标部位。另外，在焦点位置确定装置1中，在确定物镜焦点 位置时使用试样的照明图像，但该照明图像由于明亮且对比度高，因此与 目视进行的情况相比，可以容易且迅速地确定对准试样10内观察对象部位
10a的物镜30的焦点位置。另夕卜，焦点位置确定装置l中，由于对对比度 高的试样10的照明图像进行摄像时的物镜30的焦点位置对应于试样10的 大致上下边缘部，因此可以将其中央位置(大致中央位置)确定为对准试 样10内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。由此，可以容易且简便 地确定对准试样10内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。
这里，测定生物(生物细胞等)的发光现象时，在设置试样时，来自 生物的发光由于其强度极其微弱，因此即便是高性能的CCD相机也几乎无 法检测。目卩，如通常的显微镜观察那样，无法在确认生物体内观察对象部 位(细胞等)的同时对准物镜的焦点。即，在设置生物时，通常无法观察 生物的内部结构。另外，在观察荧光或发光(化学发光或生物发光)的显 微镜中，在细胞间同时观察细胞内的发光蛋白质局部存在的部位(微弱发 光的部位)时，在基于细胞等相位物体的照明图像而检测出的物镜的焦点 位置处，不会对准局部存在于细胞内的发光蛋白质的发光部位，观察图像 变得模糊不清。另外，在荧光观察中，对于通过荧光激发光产生荧光的相 位物体，将荧光强度最大的位置确定为焦点位置。但是，为该确定方法时， 由于激发光所引起的光毒性很强，因此对于活细胞等具有生物活性的试样， 不优选反复地确定焦点位置，因而有必要尽量减少焦点位置的确定次数。 但是，在长时间的荧光观察中，当减少焦点位置的确定次数时，有观察图 像的鲜明度变得不稳定的可能。因此，在焦点位置确定装置1中，作为利 用照明光的图像观察，将由卤灯等光源20发出的光照射于生物，利用显微 镜获取生物的照明图像，基于所得照明图像，确定物镜30的焦点位置。艮口， 在照明下对生物细胞进行摄像，推断生物细胞的内部位置。由此，在设置 生物时可以观察生物的内部结构。另外，在细胞间同时观察细胞内的发光 蛋白质局部存在的部位(微弱发光的部位)时，可以使物镜的焦点对准局 部存在于细胞内的发光蛋白质的发光部份。另外，由于不用荧光确定物镜的焦点位置，因此可以进行长时间的荧光观察。
另外，焦点位置确定装置1在步骤SA-7中通过焦点位置选择部70a2， 基于存储在摄像图像数据库70bl中的多个特征量，从存储在摄像图像数据 库70M中的多个焦点位置中选出物镜30的近点侧的焦点位置(在物镜30 的近点侧处获得对比度高的摄像图像时的物镜30的焦点位置)，在步骤 SA-8中，通过焦点位置确定部70a3，将距离所选出的物镜30近点侧的焦 点位置仅为预先测定的生物细胞厚度的一半距离的光轴上方的位置确定为 对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。换而言之，焦点 位置确定装置1选出利用照明下的观察获得近点侧的高对比度图像时的物 镜30的焦点位置，将距离所选出的焦点位置仅细胞厚度的一半左右距离的 光轴上方的位置确定为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点 位置。另外，焦点位置确定装置1在步骤SA-7中，通过焦点位置选择部 70a2，基于存储在摄像图像数据库70bl中的多个特征量，从存储在摄像图 像数据库70bl的多个焦点位置中选出物镜30的远点侧的焦点位置(在物 镜30的远点侧处获得对比度高的摄像图像时的物镜30的焦点位置)，在步 骤SA-8中，通过焦点位置确定部70a3，将距离所选出的物镜30远点侧的 焦点位置仅为预先测定的生物细胞厚度的一半距离的光轴下方的位置确定 为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。换而言之，焦 点位置确定装置1选出利用照明下的观察获得远点侧的高对比度图像时的 物镜30的焦点位置，将距离所选焦点位置仅细胞厚度的一半左右距离的光 轴下方的位置确定为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点位 置。由此，与移动物镜30或试样10、选择近点侧和远点侧的散焦位置的情 况相比，可以容易且简便地确定对准试样10内观察对象部位10a的物镜的 焦点位置。
这里，焦点位置确定装置1也可以通过执行以下的工序1~工序6来确 定对准配置于试样容器11中的生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的 焦点位置。
(工序l)通入光源20的电源，开合光源20的光闸(shutter),从试 样容器11的上方照射照明光。
(工序2)确定对准试样容器ll的底面(外侧底面或内侧底面)的物镜30的焦点位置(对应于图14的"Zd")。具体地说，通过物镜Z轴移动机 构，将物镜30沿着光轴每次一定量地移动，同时在每次移动一定量时，利
用CCD相机在照明下对生物细胞进行摄像，利用特征量计算部70al计算 来自所摄像的摄像图像总像素的光强度的积分值(来自CCD相机的输出信 号的强度)，利用控制部70a来确认所计算的积分值是否为极大值，在确认 为极大值时，对成为该极大值基础的摄像图像进行摄像时，看作物镜30的 焦点对准试样容器11的底面，通过焦点位置测量部50来测量该摄像时的 物镜30的焦点位置(对应于图14的"Zd")。 g卩，在沿着光轴移动物镜30 的同时，用照明图像来确定来自试样容器11底面的反射光的极大值。
(工序3)确定在物镜30的近点侧处对对比度高的摄像图像进行摄像 时的物镜30的焦点位置(对应于图14的"Zc")。具体地说，通过物镜z轴 移动机构，将物镜30从工序(2)所移动的位置进一步沿着光轴每次一定 量地移动，同时在每次移动一定量时，利用CCD相机在照明下对生物细胞 进行摄像，通过特征量计算部70al来计算所摄像的摄像图像的对比度，通 过控制部70a来确认所计算的对比度是否为极大值，在确认为极大值时， 对成为该极大值基础的摄像图像进行摄像时，看作物镜30的焦点对准生物 细胞的大致下端面，通过焦点位置测量部50来测量该摄像时的物镜30的 焦点位置(对应于图14的"Zc")。
(工序4)确定在物镜30的远点侧处对对比度高的摄像图像进行摄像 时的物镜30的焦点位置(对应于图14的"Za")。具体地说，通过物镜z轴 移动机构，将物镜30从(工序3)所移动的位置进一步沿着光轴每次一定 量地移动，同时在每次移动一定量时，利用CCD相机在照明下对生物细胞 进行摄像，通过特征量计算部70al来计算所摄像的摄像图像的对比度，通 过控制部70a来确认所计算的对比度是否为极大值，在确认为极大值时， 对成为该极大值基础的摄像图像进行摄像时，看作物镜30的焦点对准生物 细胞的大致上端面，通过焦点位置测量部50来测量该摄像时的物镜30的 焦点位置(对应于图14的"Za")。
(工序5)将(工序3)中确定的焦点位置(对应于图14的"Zc")和 (工序4)中确定的焦点位置(对应于图14的"Za")的大致中央的位置(例 如对应于图14的"Zb ((Zc+Za) +2)"确定为对准生物细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。
(工序6)按照物镜30的焦点位置对准(工序5)中确定的中央位置 的方式移动物镜30。
另外，工序4和工序5中，也可以在每次移动物镜30—定量时，通过 CCD相机在照明下摄像生物细胞，同时测量该摄像时的物镜30的焦点位 置，计算在移动物镜30的同时所摄像的多个摄像图像的对比度(来自多个 摄像图像的各像素的输出信号的总和)，比较所计算的各对比度(各总和)， 选出极大的对比度(总和)，从在移动物镜30的同时所计算的多个物镜30 的焦点位置中，选择出对对应于所选出的对比度(总和)的摄像图像进行 摄像时的物镜30的焦点位置，从而可以确定对应于图14的"Zc"或"Za"的 物镜30的焦点位置。另外，焦点位置确定装置l也可以配置光电二极管来 代替CCD相机。此时，在工序4和工序5中，也可以在每次移动物镜30 一定量时，在扩增光电二极管的输出电流而转变成电压信号的同时，测量 物镜30的焦点位置，比较在移动物镜30的同时所变换的多个电压信号的 强度，选出极大的电压信号的强度，从移动物镜30的同时测量的多个物镜 30的焦点位置中选择出对应于所选出的电压信号的强度的物镜30的焦点 位置，从而可以确定对应于图14的"Zc"或"Za"的物镜30的焦点位置。另 外，在焦点位置确定装置1中，移动物镜30或试样10的量(移动量)优 选为利用CCD相机摄像的图像不产生模糊不清的范围。具体地说，该移动 量优选为光源20所发出的光的波长除以物镜30的NA的平方所得的值 X为波长、NA为开口数)以下。
另外，在焦点位置确定装置1中，也可以使用单色性高的光源(激光 等)作为光源20。这里，当光源的单色性高时，将照明光照射于相位物体 时，波长分散几乎消失，因此获得尖锐的衍射光。因而，无论是近点侧的 摄像图像还是远点侧的摄像图像的任何一种，其对比度与使用白色光源时 相比，均变得非常高。由此，可以容易地选择出对对比度成为极大的摄像 图像进行摄像时的物镜的焦点位置。
另外，在焦点位置确定装置1中，观察者(操作者)在以手动旋转物 镜z轴移动机构的旋钮的同时，介由目镜43目视地确定生物细胞的像的对 比度增高的2个位置的物镜的位置，利用焦点位置测量部50来测量该确定时的物镜的焦点位置，利用焦点位置确定部70a3，可以将所测量的2个焦 点位置的中央位置(大致中央位置)确定为对准生物细胞内观察对象部位 10a的物镜的焦点位置。
另外，根据焦点位置确定位置l，通过将物镜30的位置从通常观察的 聚焦位置相对于试样IO仅以微小量前后地移动，即便不使用相位差用的物 镜，也可以获得与相位差观察法相同对比度的像。另外，根据焦点位置确 定装置l，由于没有必要考虑物镜30和聚光透镜23的光瞳像差，因此可以 使用低倍率的物镜。即，根据焦点位置确定装置l，即便使用相位差观察法 中无法使用的1倍或2倍倍率的物镜，也可以观察培养细胞等相位物体， 可以在以往观察法中无法实现的宽范围内进行观察。另外，根据焦点位置 确定装置1，通过偏射照明，可以获得赋予相位分布以阴影的具有浮凸感的 高对比度的像。另外，根据焦点位置确定装置l，通过转换镜44，可以转 换利用目视的观察和利用TV监视器的观察。另外，通过使用半透明反射 镜作为转换镜44，可以同时进行利用目视的观察和利用TV监视器的观察。 另外，根据焦点位置确定装置l，通过卸下开口，可以作为通常的显微镜进 行试样的观察。另外，根据焦点位置确定装置l，通过分两阶段地实施物镜 30的焦点位置的确定，即便在使用高倍率的物镜时，也可以进行焦点位置 的确定。另外，根据焦点位置确定装置l，由于不使用激发光，因此具有即 便对于发出荧光的生物学试样反复执行焦点位置确定处理，也几乎没有光 毒性影响的优点。换而言之，在对活细胞连续且经时地进行观察时，通过 反复进行焦点位置确定处理，可以持续地摄像鲜明的摄像图像。另外，根 据焦点位置确定装置1，在使用红外光进行焦点位置确定处理时，可以在维 持不进行利用可见光的照明的状态下，进行对准物镜的焦点位置和对试样 的暗视野图像进行摄像这两者，因此可以有效地防止由于自身发光而在摄 像图像中产生噪音。
另外，焦点位置确定装置1在由试样IO所发出的发光的强度达到可用 CCD相机检测的程度时，也可以重新再次确定在设置试样10时所确定的 对准试样10内观察对象部位10a的物镜的焦点位置(焦点位置再确定处 理)。这里，通过高倍率(例如40倍以上)的物镜30来观察来自试样10 的发光时，物镜30的倍率越高，则焦点深度变得极浅，因此当物镜30的
38焦点位置未精确地对准试样10内的观察对象部位10a时，试样10的图像 模糊不清。通过上述焦点位置确定处理确定的焦点位置对准试样10的大致 中心，但以更高精度获得来自试样10的发光时，有必要更加精度良好地确 定对准试样10内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。因此，通过执 行焦点位置再确定处理，不仅在设置试样10时，即便在开始试样10的发 光观察后，也可以持续地确定对准试样10内观察对象部位10a的物镜的焦 点位置，结果，可以使物镜的焦点位置时常地对准该观察对象部位10a。这 里，参照图19说明焦点位置确定装置l所进行的焦点位置再确定处理。图 19为表示第1实施方式的焦点位置确定装置1所进行的焦点位置再确定处 理的一例的流程图。
首先，焦点位置确定装置1通过控制部70a使CCD相机动作，利用 CCD相机在焦点位置确定部70a3所确定的焦点位置处(上述图18的步骤 SA-8中确定的对准试样10内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置)， 在不对试样IO进行照明的情况下进行摄像(步骤SB-1)。
接着，焦点位置确定装置1利用控制部70a使特征量计算部70al动作， 利用特征量计算部70al，基于步骤SB-1中摄像的摄像图像(发光图像)计 算特征量(例如来自发光图像的各像素的发光强度、由发光图像的发光强 度分布获得的统计量、发光图像的对比度等)(步骤SB-2)。
接着，焦点位置确定装置1利用控制部70a使物镜z轴移动机构动作， 利用物镜z轴移动机构将物镜30沿着光轴仅一定量地移动，从而改变通过 焦点位置确定部70a3所确定的焦点位置(步骤SB-3)。另外，焦点位置的 改变除了物镜30的移动之外，还可以是试样台17的移动。
接着，焦点位置确定装置l利用控制部70a使CCD相机动作，利用 CCD相机在步骤SB3中所改变的焦点位置处，在不对试样10进行照明的 情况下进行摄像(步骤SB-4)。
接着，焦点位置确定装置1利用控制部70a使特征量计算部70al动作， 利用特征量计算部70al，基于步骤SB-4中所摄像的摄像图像(发光图像) 计算特征量(例如来自发光图像的各像素的发光强度、由发光图像的发光 强度分布获得的统计量、发光图像的对比度等)(步骤SB-5)。
接着，焦点位置确定装置1利用控制部70a使特征量比较部70a4动作，利用特征量比较部70a4，对步骤SB-2中计算的特征量和步骤SB-5中计算 的特征量进行比较(步骤SB-6)。另外，在特征量的比较中，有由于试样 10的种类或特性而用对比度进行比较更为适当的情况、和用由发光强度分 布获得的统计量进行比较更为适当的情况，但最终用S/N (信噪比)进行 比较。
接着，焦点位置确定装置1在步骤SB-6中的比较结果为步骤SB-5中 所计算的特征量更大时(步骤SB-7:是)时，利用控制部70a使焦点位置 确定部70a5动作，利用焦点位置确定部70a5，将步骤SB-3中改变的焦点 位置确定为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜的焦点位置(步骤 SB-8)。
另一方面，焦点位置确定装置1在步骤SB-6中的比较结果为步骤SB-5 中所计算的特征量不是更大时(步骤SB-7:否)时，利用控制部70a来确 认步骤SB-3的执行次数是否达到规定次数(步骤SB-3中物镜30的移动量 是否达到规定量)，在达到规定次数时(步骤SB-9:是)，利用控制部70a 使物镜z轴移动机构动作，利用物镜z轴移动机构，将步骤SB-3中改变的 物镜30的焦点位置返回至通过焦点位置确定部70a3当初确定的焦点位置 (上述图18中步骤SA-8中确定的对准生物细胞内观察对象部位10a的物 镜30的焦点位置)(步骤SB-IO)。另外，焦点位置确定装置1在未达到规 定次数时(步骤SB-9:否)，利用控制部70a返回至步骤SB-3的处理。
以上，结束第l实施方式的焦点位置确定装置l的说明。
接着，参照图20~图22详细地说明第2实施方式的焦点位置确定装置 1的构成。另外，有时将与上述第1实施方式的说明重复的说明省略。
图20为表示第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的 图。图20所示的焦点位置确定装置1是以倒置型显微镜为基础的构成，用 于同时进行发出微弱光的生物细胞的发光观察和荧光观察。焦点位置确定 装置1在同时进行荧光观察和发光观察时，在设置生物细胞或组织等试样 10时，确定对准试样10内观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。焦点 位置确定装置1如图20所示，进一步具有由激发光照射部(激发用光源) 80、准直透镜81、偏转镜82和二向色镜83构成的激发用光学体系而构成。另外，在图20所示的焦点位置确定装置1中，当试样10存在于空气
中(试样10并非浸渍在培养液等液体中)时，作为物镜30，使用开口数(NA) 为0.9左右者，当试样IO为浸渍在液体中时，作为物镜40，使用开口数为 1.0以上者。另外，试样10用荧光色素(荧光物质)罗丹明绿(RhG)预 先染色。这里，作为荧光物质，除了罗丹明绿之外，还可以使用TMR(四 甲基罗丹明)、5-Tamra(5-羧基四甲基罗丹明)、FITC (荧光素异硫氰酸酯)、 TOTOl、吖啶橙、得克萨斯红等。
激发光照射部80为发出可见光区域波长的激光的气体激光(例如氩激 光、氦氖激光(He-Ne激光)等)，具体地为波长488nm下输功率为10mW 的氩激光。这里，用荧光物质TMR染色试样IO时，为了激发该TMR，使 用波长514.5nm的氩激光作为激发光照射部80。另外，用荧光物质5-Tamra 染色试样10时，为了激发该5-Tamra，使用波长543.5nm的He-Ne激光作 为激发光照射部80。
准直透镜81将由激发光照射部80发出的激光变换成具有光束宽度的 圆形平行光束。
偏转镜82将通过准直透镜81变换成平行光束的激光的光轴偏转。
二向色镜83具体地为转换式二向色镜，将通过偏转镜82偏转了的激 光入射至物镜30。另外，转换式二向色镜具有反射激发用光源80的激发波 长的光、从而透过荧光信号和发光信号的光谱的光谱特性。这里，二向色 镜83装在支架上(未图示)，以对应于激光的激发波长可交换的方式配置。 另外，当不必改变从激发光照射部80发出的激光的波长时，作为二向色镜 83，可以并非是转换式，可以使用通常的二向色镜。
以上，在图20所示的焦点位置确定装置1中，从试样10所发出的荧 光和发光透过物镜30到达二向色镜83。然后，到达二向色镜83的荧光和 发光透过二向色镜83，通过中继透镜31和中继透镜33，被转换镜44反射， 在处于CCD相机60受光面上的摄像元件60a处聚焦。另外，将转换镜44 从光路中卸下时，由试样10发出的荧光和发光到达目镜43。由此，观察者 可以直接观察试样10的像。
接着，参照图21详细地说明第2实施方式的焦点位置确定装置1的构 成的另一具体例。图21为表示第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的另一具体例的图。
如图21所示，焦点位置确定装置1的主体(光学体系部分)固定在主
体架台106上。另外，主体架台106为可上下移动的构成。主体架台106 安装于支柱105上。支柱105固定在底板100上。焦点位置确定装置1的 观察光学体系或CCD相机60等装在镜筒中。镜筒由镜筒上部107和与该 镜筒上部107相连接的镜筒下部108构成。镜筒上部107固定在主体架台 106上。镜筒下部108固定在底架台104上。镜筒按照可上下方向移动的方 式安装。底架台104固定在底板100上。焦点位置确定装置1的主体被具 有遮光性的遮光箱101覆盖。遮光箱101固定在底板100上。遮光箱101 的上面安装有遮光盖102。遮光盖102的一端通过铰链103与遮光箱101 相连接，按照可开合的方式安装。
放入有试样10的试样容器11配置在试样台17上。这里，如图22所 示，还可以将试样容器11放入在水槽12中后配置在试样台17上。
再返回至图21，光照射部20例如使用卤灯、金属卤化物灯等，从光 照射部20发出的光通过光纤26后照射于试样台17上的含有试样10的试 样容器ll。
在观察光学体系中，不使用偏转镜32，使物镜30所形成的像(试样 10的像)成像的中继透镜34如图所示配置在镜筒下部108。
这里，图21所示的焦点位置确定装置1如图22所示，作为焦点位置 改变部40，可以不用物镜z轴移动机构，而可以具备使试样台17沿着z 轴移动的台z轴移动机构。这里，图22中，在主体架台106上设置具有台 z轴移动机构的Z轴移动台。该Z轴移动台在可在XY方向上移动的XY 试样台的下方以支撑该XY试样台的形态安装。该Z轴移动台的上方配置 有试样容器11，试样容器11随Z轴移动台的上下移动在上下方向上移动。 Z轴移动台通过齿条齿轮机构上下运动。另外，齿条齿轮机构的动作通过 用步迸电动机旋转驱动齿条齿轮机构的旋钮(未图示)来实施。而且，步 进电动机的驱动受计算机的控制。由此，可以进行与使物镜30上下移动的 情况相同的操作。这里，Z轴移动台的上下移动也可以通过手动来进行。 另外，齿条齿轮机构的动作也可以旋转该齿条齿轮机构的旋钮(未图示) 来进行。再返回图21， CCD相机60按照其受光面的中心大致与光轴对准的方 式配置。从试样(生物细胞)10发出的荧光和发光透过二向色镜83，通过 中继透镜34后集光在CCD相机60的受光面。这里，取出红外光时，在启 动焦点位置确定装置1之前卸下安装在CCD相机60前面的红外线阻断滤 波器45。 CCD相机60介由电缆连接于对来自CCD相机60的输出信号进 行处理的信号处理装置70。
信息处理装置70由CCD相机的输出信号描绘发光图像并对其进行解 析，或测定发光强度的时间变化，或解析输出信号。另外，信息处理装置 70在物镜30的焦点位置对准试样10内的观察对象部位10a后，为了接收 来自试样10的荧光和发光，通过控制部70a使CCD相机动作。
激发光照射部80为波长488nm下输出功率为10mW的氩激光，如图 所示，配置在遮光箱101的外面。另外，遮光箱101上设有通过光纤的激 光入射口 84。由激发光照射部80发出的激光通过准直透镜81后在光纤内 传播，所传播的激光到达二向色镜83。到达二向色镜83的激光被二向色镜 83反射，从下方入射至物镜30，入射的激光发生集光，照射至试样IO。 二 向色镜83被装在支架85内，并以对应激光的激发波长可交换的方式配置。
以上，在图21所示的焦点位置确定装置1中，从试样10发出的荧光 和发光通过物镜30后到达二向色镜83。然后，到达二向色镜83的荧光和 发光透过二向色镜83，通过中继透镜34，在处于CCD相机受光面的摄像 元件60a处聚焦。
至此，结束第2实施方式的焦点位置确定装置1的构成的说明。
接着，对于第2实施方式的焦点位置确定装置1所进行的焦点位置确 定处理和焦点位置再确定处理，由于与上述第1实施方式的说明相同，因 此省略其说明。
以上，如说明所述，第2实施方式的焦点位置确定装置1进一步具有 激发用光学体系。第2实施方式的焦点位置确定装置1通过光源20将照射 光照射于生物细胞。然后，焦点位置确定装置1通过物镜z轴移动机构将 物镜30沿着光轴每次一定量地反复移动，同时在每次移动时利用焦点位置 测量部50来测量物镜30的焦点位置，利用CCD相机在照明下对生物细胞 进行摄像，利用特征量计算部70al对所摄像的摄像图像的对比度进行计算。然后，焦点位置确定装置1利用焦点位置选择部70a2来选择2个通过反复 移动物镜30而蓄积的多个对比度中成为极大的对比度，从通过反复移动物 镜30而蓄积的多个焦点位置中获得对对应于所选出的对比度的摄像图像进 行摄像时的物镜30的焦点位置。然后，焦点位置确定装置1利用焦点位置 确定部70a3，基于所获得的焦点位置，将这2个焦点位置的中央位置(大 致中央的位置)确定为对准生物细胞内观察对象部位10a的物镜30的焦点 位置，然后利用物镜z轴移动机构移动物镜30，使物镜30的焦点位置对准 所确定的焦点位置。由此，将生物细胞内的特定部位作为观察对象部位10a 来同时进行该观察对象部位10a的荧光观察和发光观察时，在设置生物细 胞时，可以确定对准该观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，结果，可 以使物镜30的焦点位置对准该观察对象部位10a。
这里，对于使用第2实施方式的焦点位置确定装置1边同时观察生物 细胞的发光图像和荧光图像、边测定生物细胞内的ATP量的方法，以下说 明数个方法。由于荧光素酶的发光反应(发光的强度)依赖于ATP量，因 此一直以来都进行利用荧光素酶的发光反应对ATP进行定量。而且，在生 物、临床检查、食品卫生等领域中， 一直进行使用了荧光素酶的细胞内的 ATP量的测定。另外，ATP (三磷酸腺苷)是细胞内的能量供给源，是与 生命现象密切相关的物质。另一方面，萤火虫的荧光素酶在ATP、 02、 Mg2+ 的存在下，将D-荧光素作为发光底物，催化产生羟基荧光素、C02、 AMP、 焦磷酸的反应，通过该反应而发光。
生物细胞内的ATP量的测定通常通过以下的(1A) ~ (1C)的工序进 行(H. J. Kennedy, A. E. Pouli, E. K. Ainscow, LS. Jouaville， R.Rizzuto, G. A. :Rutter， "Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet卩-cells"， Journal of Biological Chemistry, vol.274, pp. 13281-13291， 1999)。
(IA) 将细胞或细菌溶解以提取ATP。
(IB) 将该提取液添加至含有荧光素和荧光素酶的反应液中。
(IC) 测定由添加有提取液的反应液产生的发光量，从而对细胞内的 ATP进行定量。
另外，细胞内的ATP量的测定通常通过以下的(2A) ~ (2C)的工序进行。
(2A)将荧光素酶基因导入细胞内并使其表达。
(2B)在含有细胞的培养液中添加荧光素。
(2C)检测由添加有荧光素的培养液产生的发光量，从而对细胞内的 ATP进行定量。
另外，活细胞内规定部位(具体地为线粒体)的ATP量的经时测定通 过以下的GA)和(3B)的工序进行(H. J. Kennedy, A. E. Pouli, E. K. Ainscow, L.S. Jouaville, R.Rizzuto， G. A. Rutter, "Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet p-cells"， Journal of Biological Chemistry, vol.274, pp. 13281-13291, 1999)。
(3A)在荧光素酶基因中融合线粒体转移信号基因，将该融合的基因 导入细胞内。导入至细胞的融合基因除了转移碱基序列和发光相关基因之 外，还融合有表达荧光蛋白质的荧光相关基因。
(3B)以荧光素酶局部存在于细胞内的线粒体为前提，通过经时地测 定来自细胞的发光量，对细胞内的线粒体的ATP量的时间变动迸行测定。 具体地说，对导入有该融合基因的细胞的荧光图像进行摄像，基于所得荧 光图象来判断发光蛋白质是否局部存在于规定部位。当判定结果为局部存 在时，对来自细胞的发光量进行检测。由此，可以判定发光蛋白质是否局 部存在于该细胞的规定部位。即，对于导入有融合基因的活细胞确认发光 蛋白质的局部存在，同时对来自该细胞的发光量进行测定。另外，可以确 认所测定的发光量来自于规定的部位。
另外，当导入有融合基因的活细胞在摄像视野的范围内存在多个时， 对多个细胞的荧光图像和发光图像进行摄像，基于该荧光图像对每个细胞 判定发光蛋白质是否局部存在于规定部位，通过重叠所摄像的荧光图像和 所摄像的发光图像，从判定结果判定为局部存在的细胞中选择测定对象的 细胞，测定来自所选出的细胞的发光量。由此，可以从多个细胞中识别各 个细胞，将来自单一细胞内的规定部位的发光量与其它相分离而进行测定。 另外，通过同时获得荧光图像和发光图像，可以同时获得测定对象细胞的 发光蛋白质的局部存在和由该细胞所发出的发光强度。因此，可以进行排 除了由于基因导入效率、细胞周期所导致的各个细胞生理状态不同所带来
45的影响的解析。这里，作为一例，还可以在摄像荧光图像后，进行发光蛋 白质是否局部存在于规定部位的判定，当判定为局部存在时，对发光图像 进行摄像。而且，还可以在对荧光图像和发光图像进行摄像后进行局部存 在的判定。
以上，结束第2实施方式的焦点位置确定装置1的说明。
首先，详细地说明本发明的生物试样摄像方法和生物试样摄像装置的 基本原理。本发明介由物镜对收容在具有多个收容部的基板的收容部内的 发出微弱光的生物试样进行摄像。本发明中，移动基板和/或物镜直至所需 收容部进入物镜的视野内，测量物镜的近点侧焦点位置和/或物镜的远点侧 焦点位置，基于所测量的焦点位置来确定对准的收容在所需收容部内的生 物试样内观察对象部位的物镜的焦点位置，使物镜的焦点位置对准所确定 的焦点位置，介由物镜对生物试样进行摄像，从而获得该生物试样的发光 图像。由此，可以迅速且准确地进行收容在基板所具有的各收容部(例如 微孔板所具有的各孔)中的生物试样的摄像。
另外，本发明中，也可以在移动基板和/或物镜直至所需收容部进入物 镜的视野内时，测量该基板和/或该物镜的移动到达地的位置，使与所测定 的移动到达地的位置相关的移动到达地位置信息与用于识别该所需收容部 的收容部识别信息相关联，并进行存储。由此，在预移动基板和/或物镜直 至所需收容部进入物镜的视野内时，如果存储对应于该所需收容部的收容 部识别信息时，可以基于与该收容部识别信息相关联地存储的移动到达地 位置信息，适当地移动基板和/或物镜。
另外，本发明中，(1)移动基板和/或物镜直至所需收容部进入物镜的
视野内，(2)向生物试样照射光，(3)改变物镜的焦点位置，(4)测量所 改变的焦点位置，(5)在所改变的焦点位置上对经光照射的生物试样进行 摄像，(6)基于所摄像的摄像图像，计算使摄像图像带有特征的特征量，(7) 反复执行上述"焦点位置的改变"、"焦点位置的测量"、"试样的摄像"和"特 征量的计算"，(8)基于反复执行所蓄积的多个特征量，由反复执行所蓄积 的多个焦点位置中选择至少一个焦点位置，(9)基于所选出的焦点位置，确定对准收容在所需收容部内的生物试样内观察对象部位的物镜的焦点位 置，(10)使物镜的焦点位置对准所确定的焦点位置，(11)介由物镜对生 物试样进行摄像，从而获得该生物试样的发光图像。由此，可以迅速且准 确地进行收容在基板所具有的各收容部(例如微孔板所具有的各孔)中的 生物试样的摄像。
另外，本发明中，在上述(1)的处理中，也可以移动基板和/或物镜 直至所需收容部进入物镜的视野内，测量该基板和/或该物镜的移动到达地 的位置，将与所测量的移动到达地的位置相关的移动到达地位置信息与用 于识别该所需收容部的收容部识别信息相关联，并进行存储。由此，在预 移动基板和/或物镜直至所需收容部进入物镜的视野内时，如果存储对应于 该所需收容部的收容部识别信息时，则可以基于与该收容部识别信息相关 联地存储的移动到达地位置信息，适当地移动基板和/或物镜。
接着，参照图33~图39详细地说明作为第3实施方式的生物试样摄像
装置的焦点位置确定装置1的构成的具体一例。另外，有时将与上述第1
实施方式和第2实施方式的说明重复的说明省略。
首先，图33和图34分别表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置 的焦点位置确定装置1构成的具体一例的图。图33和图34所示的第3实 施方式的焦点位置确定装置1分别为改变图13和图17所示的第1实施方 式的焦点位置确定装置1中的试样容器11、水槽12和安装于试样台17规 定位置上的步进电动机的构成而得到的。另外，图35为表示作为第3实施 方式的生物试样摄像装置的焦点位置确定装置1的构成的具体一例的图。 图35所示的第3实施方式的焦点位置确定装置1为改变图20所示的第2 实施方式的焦点位置确定装置1中的试样容器11、水槽12和安装于试样台 17规定位置上的步进电动机的构成而得到的。
这里，图33、图34和图35中，试样容器ll具体地为具有多个孔的微 孔板。微孔板的底面(至少对应于孔的部分的底面)平坦且光学上透明(用 通常的物镜可以对应者)。另外，水槽12如图所示，不设置其底面，按照 包围试样容器11的方式构成。另外，步进电动机(未图示)的数量为3个， 各步进电动机以相互垂直的朝向(90°方向)安装在试样台17的规定位置上。而且，试样台17由于这些步进电动机的驱动力而可以从该台所配置的
位置向光轴(z轴)方向或与其垂直的方向(例如x方向或y方向)移动。
接着，图36为表示作为第3实施方式的生物试样摄像装置的焦点位置 确定装置1的构成的具体一例的图。图36所示的第3实施方式的焦点位置 确定装置1为改变图21所示的第2实施方式的焦点位置确定装置1中的试 样容器II和试样台17而得到的。
这里，图36中，试样容器11具体地为具有多个孔的微孔板。微孔板 的底面(至少对应于孔的部分的底面)平坦且光学上透明(用通常的物镜 可以对应者)。另外，试样台17具有使该台沿着光轴(Z轴)移动、或沿 与其垂直的方向(XY方向)移动的台XYZ轴移动机构。
图37为表示作为第3实施方式的检查系统的构成的具体一例的图。图 37所示的检查系统具有适于对各多个容器(特别是微孔板的多个孔)的检 体进行总括解析的通量高的构成。
图37所示的检査系统中，将储存多个孔配置成矩阵状的图38所示的 微孔板的微孔板槽111D以可从电动台112D上卸下的方式固定。
在微孔板槽111D的上方配置有用于进行明视野观察的照明体系。另一 方面，在微孔板槽111D的下方配置有利用目镜113D用肉眼对存储于微孔 板各孔中的细胞等的试样图像进行明视野观察的观察体系和用于用摄像装 置114D进行暗视野摄像的摄像体系。
收容在孔内的含有细胞的试样或生物组织为以可以识别各个细胞的程 度在光路上不重叠程度的低密度。此方面与亮度计等对全部孔的发光量进 行解析的系统那样利用重叠的高密度细胞数进行的测定是不同的。
微孔板槽111D和照明体系的透镜要素存储在用于将细胞或抗原、抗体 等生物学试样维持在可维持活性的温度的保温箱115D内。这里，上述观察 体系和摄像体系的各种透镜要素配置在保温箱115D的外部，进而用具有遮 光性的绝热部件(例如铝膜、陶瓷筒体)保护。
电动台112D通过用控制器132D的控制来适当驱动3个电动机而能够 在光轴方向(Z轴)或与其垂直的方向(XY方向)上移动。物镜121D上 具备将该物镜在光轴(Z轴)方向上移动的物镜Z轴驱动机构。
从微孔板槽111D内的试样发出的光通过设定为适当光学条件的物镜121D后，被最下部的成像用镜反射，进而经过成像用透镜被送至摄像装置
114D。另外，通过使图37所示的可动镜选择性地在光路上进退来执行介由 目镜113D'的选择性观察，可以尽量防止对来自试样的微弱光进行检测时的 光损失，并且可以在目镜113D中采用最适于观察的高反射性镜。另夕卜，可 动镜的驱动可以是自动转换式，还可以是利用滑杆的手动操作式。
保温箱115D进一步储存在用于阻断来自外部环境(光、气温、湿度、 氧等)的影响的暗箱116D中，由此，本检查系统整个成为双层结构。暗箱 116D中，在适当考虑了内部空气调节效率的位置上设置有暖风导入装置 117D (图37中暗箱的上部左侧壁侧)和暖风排出装置118D (图37中暗箱 的上部右侧壁侧)。另外，保温箱115D和暗箱116D上分别设有内侧门和 外侧门，从而可以交换设置在电动台112D上的微孔板。
在暗箱116D的外部上，考虑到为了避免热故障，配置有用于照明体系 的光源(图37中为卤灯)120D、用于摄像体系的摄像装置(图37中为C-CCD 相机)114D。用于摄像装置114D的成像透镜和波长选择用的旋转滤波器 转盘(filterwheel)配置在保温箱115D和暗箱116D之间。
如图37所示，为了严密地聚焦微孔板内的观察和摄像，还可以设置进 行利用红外光或可见光的指定点聚焦的激光检测机构。进行指定点聚焦时， 例如为了测定来自微孔板底面的反射，在电动台112D的下方配置光分割 镜。这种指定点聚焦除了要求精密的图像分辨率的情况之外，并不是必须 的构成。另外，关于光分割镜，使用红外线时，优选通过利用二向色镜使 来自试样的光损失达到最小限，当使用可见光时，优选通过使用能够调焦 的最小限反射率构成的半透明反射镜或者制成上述可动式镜来同样地防止 光损失。
由摄像装置114D送出的图像数据由演算处理部130D进行统计解析或 形状解析，并显示于显示部131D。由此，可以总括地执行对每个孔进行时 间序列的解析、或进行孔间比较的多种解析。显示部131D即便是时间序列 曲线也可将数值数据图形化地表示。另外，本检查系统的特征在于，在将 图像数据记存储在与控制器132D相连接的图像数据存储部33D的同时， 可以将图像数据存储部133D所存储的图像数据根据需要传唤至显示部 131D，作为影像而再生。因此，通过本检查系统，对于图像化显示数据中有兴趣的数据，通过利用适当的指定机构(鼠标指针、接触笔、键盘等) 指定该数据部分(测定点或数据区域)，还可以发挥以静止图像或动态图像 将该部分的时间序列数据再生的重复调用功能。通过本检查系统，显示部 131D上可以仅显示图像数据，还可以显示图像数据和数值数据的组合。另 外，通过本检查系统，此时还可以进一步通过用适当的指定机构指定所显 示图像中有兴趣的图像部位或区域，从而传唤出对应的数值或曲线，或用 颜色差别等强调特定的数值或曲线部位而可以易于确认。进而，通过本检 查系统，当在各多个容器中收容不同的检体(例如不同脏器、不同病症、 不同患者、不同测定项目)时，也可以按照在显示部131D上显示所需顺序 或相关关系的方式，对各个检体进行解析。这些各种的多样解析或显示形 式可以通过可交换的软件或内部程序，以能够执行的方式进行设计来实现。 在以上的构成中，各种电控制及信号处理的管理和控制成为控制器
132D单一地进行的构成。控制器132D还可以通过利用通信线路(可以是 无线或有线)等可通信地联合上述多个检查装置和检査系统而成的遥控系 统，以分散或主机的集中管理的方式实时地进行数据共有化或诊断等医疗 联合。另外，通过利用通信等使得各种有用的医学数据库可与控制器132D 相连，还可以在实时地获得最新数据的同时解析与生物体系统的关联。
图39为上述检查系统的变形例，表示利用物镜进行图像化时的例子。 被电动控制的XYZ台201E上固定有底面平坦的玻璃制或塑料制的微孔板 203E。这里，按照形成在微孔板203E上的全部孔207E向下方露出的方式， 仅使微孔板203E的周围在XYZ台201E上接地。在微孔板203E的上方配 置有用于覆盖各孔207E和该微孔板上部、且将该微孔板固定在XYZ台 201E上的盖板202E。在盖板202E上形成未图示的配管，盖板202E与气 体供给部210E相连接，该气体供给部210E用于通过软管209aE向各孔给 排规定条件的气体(例如二氧化碳气体、热风)。另外，储存整体的外壳206E 具备用于进行板交换、试剂分注、换气等的开合式的上部外壳206aE和用 于固定各机构的成为基底的下部外壳206bE。外壳206E内整体的温度通过 从暖风产生装置208E通过管209bE向该外壳内送入暧风，按照适于生物活 性的方式而升温。另外，微孔板203E和XYZ台201E的温度优选通过温 度传感器211E通过图37所示的控制器，按照达到所需温度的方式进行温度控制。
作为微弱光例子的发光(特别是细胞内生物发光)的观察中，由于优
选用低倍率(例如2倍 20倍、特别是4倍 10倍)的物镜204E获得可以 总括地识别各个细胞的视野，因此适于自如地进行微孔板203E的移送。在 任一倍率的物镜204E中，当需要考虑微孔板203E的接地误差或批间差时， 优选通过图示的Z轴驱动机构205E来进行将与微孔板203E底面的距离保 持在适当距离的调整。
如此，结束第3实施方式的各装置构成的说明。
本实施例中，禾拥第2实施方式的焦点位置确定装置1使物镜的焦点
对准导入有质粒载体的多个HeLa细胞，从多个HeLa细胞中选定成为对象 的HeLa细胞，经时地测定来自所选定的HeLa细胞内的线粒体的发光量和 ATP量。首先，按照以下的(顺序l) ~ (顺序7)进行本实施例的实验。
(顺序1)制作荧光蛋白质(GFP)、线粒体转移信号和荧光素酶连接 而成的融合基因。
(顺序2)将带有融合基因的质粒载体导入HeLa细胞内。
(顺序3)利用焦点位置确定装置1，将物镜的焦点位置预先对准HeLa 细胞内的线粒体，利用CCD相机在照明下和无照明下分别对HeLa细胞进 行摄像，基于所摄像的摄像图像(荧光图像)，判定GFP是否局部存在于 线粒体中，从而确认荧光素酶是否局部存在于线粒体中(参照图23)。图 23为表示导入有质粒载体的HeLa细胞的照明图像和发光图像的图。
(顺序4)向HeLa细胞中投入组胺，引起介由Ca^的线粒体的ATP 量的变化。
(顺序5)利用CCD相机在照明下和无照明下分别对HeLa细胞进行 摄像，从而经时地获得捕获了来自HeLa细胞内线粒体的发光的发光图像 (参照图24)。图24为表示导入有质粒载体的HeLa细胞的照明图像和发 光图像的图。
(顺序6)通过重叠所摄像的照明图像、荧光图像和发光图像，选择 成为对象的HeLa细胞。
(顺序7)在测定来自所选定的HeLa细胞内线粒体的发光强度的时间 变化的同时，监测ATP量的时间变化。
接着，说明实验结果。如图23所示，可以确认序号1的HeLa细胞中， 通过质粒载体导入融合基因，且荧光素酶局部存在于线粒体中。另外，可 以确认序号2和序号4的HeLa细胞中，通过质粒载体未导入融合基因。而 且，可以确认序号3的HeLa细胞中，虽然通过质粒载体导入融合基因，但 荧光素酶并未局部存在于线粒体中。即，能够确认通过质粒载体导入融合
55基因且荧光素酶局部存在于线粒体中的HeLa细胞仅为序号1的HeLa细胞， 因此成为对象的HeLa细胞选定为序号1的HeLa细胞。另外，如图24所 示，可以确认来自序号3的HeLa细胞的发光强度最大，接下来为来自序号 1的HeLa细胞的发光强度，接下来的来自序号2和序号4的HeLa细胞的 发光强度为同等大小。而且，如图25所示，可以监测来自序号1的HeLa 细胞的线粒体的发光强度的经时变化。图25为表示来自所选定的序号1的 HeLa细胞的发光强度的时间变化的图。
接着，以下说明对于上述本发明的微弱光图像的解析方法和解析装置 有利的焦点位置的确定方法和装置作为附注项。为了解决上述课题而达成 目的，本发明附注项1所述的焦点位置确定方法为确定对准试样内观察对 象部位的物镜焦点位置的焦点位置确定方法，其特征在于，测量物镜近点
侧的焦点位置禾n/或物镜远点侧的焦点位置，基于所测量的焦点位置，确定
对准上述观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项2所述的焦点位置确定方法为确定对准试样内观 察对象部位的物镜焦点位置的焦点位置确定方法，其特征在于，包括下述 步骤光照射步骤，其向试样照射光；焦点位置改变步骤，其改变物镜的 焦点位置；焦点位置测量步骤，其对上述焦点位置改变步骤中改变的焦点 位置进行测量；试样摄像步骤，其在上述焦点位置改变步骤中改变的焦点 位置处对上述光照射步骤中照射光后的试样进行摄像；特征量计算步骤， 其基于上述试样摄像步骤中摄像的摄像图像，计算使该摄像图像带有特征 的特征量；执行步骤，其反复执行上述焦点位置改变步骤、上述焦点位置 测量步骤、上述试样摄像步骤和上述特征量计算步骤；焦点位置选择步骤， 其基于上述执行所蓄积的多个上述特征量，由执行上述执行步骤所蓄积的 多个焦点位置中选择至少1个焦点位置；以及，焦点位置确定步骤，其基 于在上述焦点位置选择步骤中选出的焦点位置，确定对准上述观察对象部 位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项3所述的焦点位置确定方法为如附注项2所述的 焦点位置确定方法，其特征在于，所述焦点位置选择步骤中，基于上述执 行而蓄积的多个特征量，从执行上述执行步骤所蓄积的多个焦点位置中选 择2个焦点位置，上述焦点位置确定步骤中，基于上述焦点位置选择步骤中选择的2个焦点位置，将该2个焦点位置的中央位置确定为对准上述观 察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项4所述的焦点位置确定方法为如附注项3所述的 焦点位置确定方法，其特征在于，所述2个焦点位置为物镜近点侧的焦点
位置和物镜远点侧的焦点位置。
另外，本发明附注项5所述的焦点位置确定方法为如附注项2所述的 焦点位置确定方法，其特征在于，所述焦点位置选择步骤中，基于上述执 行而蓄积的多个特征量，从执行上述执行步骤所蓄积的多个焦点位置中选 择1个焦点位置，上述焦点位置确定步骤中，基于上述焦点位置选择步骤 中选择的1个焦点位置和预先规定的距离，将距离该焦点位置仅为所述预 先规定的距离的位置确定为对准上述观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项6所述的焦点位置确定方法为如附注项5所述的 焦点位置确定方法，其特征在于，所述1个焦点位置为物镜近点侧的焦点 位置或物镜远点侧的焦点位置。
另外，本发明附注项7所述的焦点位置确定方法为如附注项2~6任一 项所述的焦点位置确定方法，其特征在于，还包括下述步骤确定位置试 样摄像歩骤，其在上述焦点位置确定步骤中确定的焦点位置处对试样进行 摄像；确定位置特征量计算步骤，其基于上述确定位置试样摄像步骤中摄 像的摄像图像来计算特征量；确定后焦点位置改变步骤，其改变上述焦点 位置确定歩骤中所确定的焦点位置；确定后试样摄像步骤，其在上述确定 后焦点位置改变步骤中改变的焦点位置处对试样迸行摄像；确定后特征量 计算步骤，其基于在上述确定后试样摄像步骤中摄像的摄像图像来计算特 征量；特征量比较步骤，其对上述确定位置特征量计算步骤中所计算的特 征量与上述确定后特征量计算步骤中所计算的特征量进行比较；以及，焦 点位置再确定步骤，其当上述特征量比较步骤中比较的结果为上述确定后 特征量计算步骤中所计算的特征量更大时，将上述确定后焦点位置改变步 骤中改变的焦点位置再次确定为对准上述观察对象部位的物镜的焦点位 置。
另外，本发明附注项8所述的焦点位置确定方法为如附注项2 7任一 项所述的焦点位置确定方法，其特征在于，所述试样为生物细胞或组织。另外，本发明涉及焦点位置确定装置，本发明附注项9所述的焦点位 置确定装置为确定对准试样内观察对象部位的物镜的焦点位置的焦点位置 确定装置，其特征在于，具备下述机构光照射机构，其用于向试样照射 光；焦点位置改变机构，其用于改变物镜的焦点位置；焦点位置测量机构， 其用于测量物镜的焦点位置；试样摄像机构，其用于对试样进行摄像；特 征量计算机构，其用于基于用上述试样摄像机构所摄像的摄像图像来计算 使摄像图像带有特征的特征量；控制机构，其用于对反复执行上述焦点位 置改变机构、上述焦点位置测量机构、上述试样摄像机构和上述特征量计 算机构的各个机构进行控制；焦点位置选择机构，其用于基于上述反复执 行所蓄积的多个特征量，从利用上述控制机构反复执行上述各机构所蓄积 的多个焦点位置中选择至少1个焦点位置；以及，焦点位置确定机构，其 用于基于由上述焦点位置选择机构所选出的焦点位置来确定对准上述观察 对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项10所述的焦点位置确定装置为如附注项9所述的 焦点位置确定装置，其特征在于，上述焦点位置选择机构用于基于上述蓄 积的多个特征量从上述蓄积的多个焦点位置中选择2个焦点位置，上述焦 点位置确定机构用于基于用上述焦点位置选择机构选出的2个焦点位置， 将该2个焦点位置的中央位置确定为对准上述观察对象部位的物镜的焦点 位置。
另外，本发明附注项11所述的焦点位置确定装置为如附注项10所述 的焦点位置确定装置，其特征在于，所述2个焦点位置为物镜近点侧的焦 点位置和物镜远点侧的焦点位置。
另外，本发明附注项12所述的焦点位置确定装置为如附注项9所述的 焦点位置确定装置，其特征在于，所述焦点位置选择机构用于基于上述蓄 积的多个特征量从上述蓄积的多个焦点位置中选择1个焦点位置，上述焦 点位置确定机构用于基于用上述焦点位置选择机构所选出的1个焦点位置 和预先规定的距离，将距离该焦点位置仅为该预先规定的距离的位置确定 为对准上述观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项13所述的焦点位置确定装置为如附注项12所述 的焦点位置确定装置，其特征在于，所述1个焦点位置为物镜近点侧的焦点位置或物镜远点侧的焦点位置。
另外，本发明附注项14所述的焦点位置确定装置为如附注项9~13任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，还具有下述机构特征量比 较机构，其用于对用上述特征量计算机构预先分别算出的2个特征量进行 比较；和焦点位置再确定机构，其用于基于用上述特征量比较机构比较的
结果来再次确定对准上述观察对象部位的物镜的焦点位置，其中，在用上 述焦点位置确定机构所确定的焦点位置处用上述试样摄像机构对试样进行 摄像，基于所摄像的摄像图像，利用上述特征量计算机构来计算特征量， 利用上述焦点位置改变机构来改变用上述焦点位置确定机构所确定的焦点 位置，在所改变的焦点位置处利用上述试样摄像机构对试样进行摄像，基 于所摄像的摄像图像，利用上述特征量计算机构来计算特征量，用上述特 征量比较机构将对应于上述确定的焦点位置的特征量和对应于上述改变后 的焦点位置的特征量进行比较，当比较的结果为对应于上述改变后的焦点 位置的特征量更大时，利用上述焦点位置再确定机构将上述改变后的焦点 位置再次确定为对准上述观察对象部位的物镜的焦点位置。
另外，本发明附注项15所述的焦点位置确定装置为如附注项9 14任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，所述试样为生物细胞或组织。
另外，本发明附注项16所述的焦点位置确定装置为如附注项9 15任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，在包含所述光照射机构的照 明光学体系的光瞳位置上配置有开口 。
另外，本发明附注项17所述的焦点位置确定装置为如附注项16所述 的焦点位置确定装置，其特征在于，使上述开口相对于光轴偏芯地配置。
另外，本发明附注项18所述的焦点位置确定装置为如附注项9~15任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，在包含所述光照射机构的照 明光学体系中配置有狭带通滤波器。
另外，本发明附注项19所述的焦点位置确定装置为如附注项9~18任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，所述光照射机构发出单色的 可见光。
另外，本发明附注项20所述的焦点位置确定装置为如附注项9~19任 一项所述的焦点位置确定装置，其特征在于，其进一步具备向试样照射激发光的激发光照射机构。
通过上述附注项，由于测量物镜近点侧的焦点位置(大致焦点位置) 和/或物镜远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，并基于所测量的焦点位置 来确定对准试样内观察对象部位的物镜的焦点位置，因此在将试样内的特 定部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察时，在设置试样 时，可以确定对准该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到能够使 物镜的焦点位置对准该观察对象部位的效果。另外，通过本发明，在进行 试样内的发光部位的发光观察时，即便不确认来自该发光部位的发光，也 可起到能够使物镜的焦点对准试样内发光部位的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于(l) 向试样照射光，(2)改变物镜的焦点位置，(3)测量所改变的焦点位置，(4) 在所改变的焦点位置处对经光照射的试样进行摄像，(5)基于所摄像的摄
像图像，计算使摄像图像带有特征的特征量，(6)反复执行(2) ~ (5)，
(7)基于执行所蓄积的多个特征量，由执行所蓄积的多个焦点位置中选出 至少一个焦点位置，(8)基于所选择的焦点位置，确定对准试样内观察对 象部位的物镜的焦点位置，因此，将试样内的特定部位作为观察对象部位 进行该观察对象部位的发光观察时，在设置试样时，可以确定对准该观察 对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到可以使物镜的焦点位置对准该观 察对象部位的效果。另外，通过本发明，在进行试样内的发光部位的发光 观察时，即便不确认来自该发光部位的发光，也起到能够使物镜的焦点对 准试样内发光部位的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于在 上述(7)中基于执行所蓄积的多个特征量从执行所蓄积的多个焦点位置中 选出2个焦点位置，上述(8)中基于所选出的2个焦点位置，将该2个焦 点位置的中央位置(大致中央位置)确定为对准试样内观察对象部位的物 镜的焦点位置，因此起到可以容易地确定对准试样内观察对象部位的物镜 的焦点位置的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于2 个焦点位置为物镜近点侧的焦点位置(大致焦点位置)和物镜远点侧的焦 点位置(大致焦点位置)，因此起到能够容易且简便的确定对准试样内观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于在 上述(7)中基于执行所蓄积的多个特征量从执行所蓄积的多个焦点位置中 选出1个焦点位置，上述(8)中基于所选出的1个焦点位置和预先规定的 距离，将距离该焦点位置仅为该预先规定的距离的位置确定为对准试样内 观察对象部位的物镜的焦点位置，因此起到可以更容易地确定对准试样内 观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于1 个焦点位置为物镜近点侧的焦点位置(大致焦点位置)或物镜远点侧的焦 点位置(大致焦点位置)，因此起到能够更容易且简便地确定对准试样内观 察对象部位的物镜的焦点位置的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定方法和焦点位置确定装置，由于(9) 在上述(8)中确定的焦点位置处对试样进行摄像，(10)基于所摄像的摄 像图像来计算特征量，(11)改变上述(8)中所确定的焦点位置，(12)在 所改变的焦点位置处对试样进行摄像，(13)基于所摄像的摄像图像来计算 特征量，(14)比较(10)中所计算的特征量和(13)中所计算的特征量， (15)当比较的结果是上述(13)中计算的特征量更大时，将(11)中改 变的焦点位置再次确定为对准试样内观察对象部位的物镜焦点位置，因此， 不仅在设置试样时，在开始试样的发光观察时也可持续地确定对准试样内 观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到能够使物镜的焦点位置时常 对准该观察对象部位的效果。这里，由于生物试样为生物细胞或组织，因 此起到能够将发出微弱光的物质作为试样使用的效果。
另外，通过本发明的焦点位置确定装置，通过在包含光照射机构(光 源)的照明光学体系的光瞳位置上配置开口，可以增大透射光和衍射光的 相位差，结果，起到能够提高摄像图像的对比度的效果。通过使开口相对 于光轴偏芯地配置，可以进一步增大透射光和衍射光的相位差，结果，起 到能够进一步提高摄像图像的对比度的效果。另外，通过在包含光照射机 构(光源)的照明光学体系中配置狭带通滤波器，可以使由光源发出的光 变为波段区域带宽极窄的单色光，结果，起到能够提高摄像图像的对比度 的效果。另外，由于光照射机构(光源)发出单色的可见光，因此将由光源发出的光照射于试样时，波长分散几乎消失，可以获得尖锐的衍射光， 结果，起到能够提高摄像图像的对比度的效果。另外，通过进一步具备向 试样照射激发光的激发光照射机构(激发用光源)，可以起到能够同时进行 试样的荧光观察和发光观察的效果。
另外，根据本发明，还可以理解为其包含以下附注项所记载的发明。
附注项1A: —种微弱光图像的解析方法，其特征在于，在对发出微弱 光的生物试样进行图像解析时，对生物试样的预解析对象部位使用与上述 微弱光不同种类的电磁能，确定与上述对象部位相关的至少一个基准位置， 确定与相对于上述基准位置的上述对象部位对应的微弱光用焦点位置，依 照所确定的焦点位置，执行利用上述微弱光的图像化，由微弱光图像中提 取必要的测定参数的数值，基于所提取的参数数值进行对象部位的评价。
附注项2A:附注项1A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 上述基准位置的确定包括利用上述电磁能的基准图像的获取。
附注项3A:附注项2A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 上述基准图像的获取为对含有上述对象部位的试样区域获取图像。
附注项4A:附注项1A或2A所述的微弱光图像的解析方法，其特征
在于，上述电磁能为对生物体的损伤少的可见光、近红外线、超声波、磁 力线中的任一种。
附注项5A: —种微弱光图像的解析方法，其特征在于，对发出直接可
视化困难的微弱光的生物试样照射易于可视化的照射光以进行可视化，对 于上述经可视化的生物试样所产生的基准图像，以接收来自上述基准图像 的光的物镜的近点侧焦点位置和域物镜的远点侧焦点位置作为基准位置， 将相当于从上述生物试样的预解析对象部位发出的微弱光的图像化所必要 距离的位置确定为利用上述物镜的微弱光用的焦点位置，将上述物镜瞄准 所确定的微弱光用焦点位置，蓄积微弱光直至获得必要的图像，从而形成 上述生物试样的微弱光图像，由所形成的上述微弱光图像来评价上述对象 部位的微弱光的有无或光强度。
附注项6A:附注项5A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 直接可视化在用于形成光学图像的曝光时间为10秒钟以上时定义为可视化困难。附注项7A:附注项5A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 基于所述照射光的图像信号为透射光或荧光。
附注项8A:附注项1A 7A任一项所述的微弱光图像的解析方法，其
特征在于，所述微弱光用焦点位置的确定在每个所述生物试样的观察部位
处进行。
附注项9A:附注项1A 8A任一项所述的微弱光图像的解析方法，其
特征在于，在物镜的同一光束路径上确定所述基准位置和所述焦点位置。
附注项10A:附注项1A 9A任一项所述的微弱光图像的解析方法，其 特征在于，通过在根据检查项目的多个时刻执行所述微弱光用图像的获取， 从而蓄积多个微弱光图像，对照所蓄积的多个所述微弱光图像的观察对象 部位，在每个时刻比较所对照的微弱光图像。
附注项11A:附注项2A 10A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，在脱离比较所述基准图像和所述微弱光图像的各个焦点位置 而设定的距离范围时，再次执行基准图像和/或微弱光图像的获取。
附注项12A:附注项IIA所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 所述微弱光图像的评价进一步包括从所述基准图像获取测定参数，与来自 所述基准图像的测定数据相关联，进行所述微弱光参数的评价。
附注项13A:附注项12A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 与所述基准图像的对象部位的轮廓信息相关联，评价所述微弱光图像。
附注项14A:附注项1A 13A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，评价为相当于所述对象部位轮廓的单位面积的微弱光强度。
附注项15A:附注项1A 13A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，评价为确定所述对象部位轮廓的微弱光的位置或分布。
附注项16A:附注项1A 15A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，所述生物试样分别收容在多个收容部中，在每个各个收容部 内执行所述基准位置。
附注项17A:附注项1A 16A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，在含有多个收容部的广角视野中执行所述微弱光图像的获取。
附注项18A:附注项17A所述的微弱光图像的解析方法，其特征在于， 通过以光学的方式和/或以电的方式放大所述微弱光图像，从所述对象部位获取测定参数。
附注项19A:附注项1A 17A任一项所述的微弱光图像的解析方法， 其特征在于，所述生物试样为活的细胞或组织。
附注项20A:附注项1A 19A任一项所述的微弱光图像的解析方法，
其特征在于，所述微弱光为伴随生物发光性蛋白质的表达的发光。
由以上说明可理解，本发明的微弱光图像的解析方法和解析装置及生 物试样摄像方法和生物试样摄像装置特别在生物细胞的发光观察、荧光观 察、荧光发光同时观察中，产业上的利用可能性较高。以下，基于附图详细说明本发明的生物试样的摄像方法和摄像装置
的实施方式。另外，本发明并非限于该实施方式。 第1实施方式
参照图26说明第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置的构 成。图26为表示第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置的构成 的一例的图。如图26所示，第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的 装置为用于在短曝光时间内、甚至实时地对作为摄像对象的样品1A进行摄 像的装置，由物镜2A、集光透镜3A、 CCD相机4A和CPU5构成。另夕卜， 该装置还可以如图所示进一步具备连续变焦距镜头6A。
样品1A为发光试样，例如为发光蛋白质(例如由导入的基因(荧光 素酶基因等)表达的发光蛋白质)、发光性的细胞、发光性细胞的集合体、 发光性的组织试样、发光性的脏器、发光性的个体(动物等)。另外，样品 1A具体地还可以为导入有荧光素酶基因的发光细胞。物镜2A的以开口数 (NA)和投影倍率(卩)表示的(NA+p) 2的值为0.01以上、优选为0.039 以上。集光透镜3A将介由物镜2到达的来自样品1A的发光集合。CCD 相机4A为Ot:左右的冷却CCD相机，介由物镜2A或集光透镜3A对样品 1A进行摄像。CPU5A将用CCX)相机4A摄像的图像输出。
然后，在物镜2A或物镜2A的包装容器(包装)上标记(NA/卩)2的 值。这里，参照图27说明标记有(NA/p) 2的值的物镜的一例。图27为表 示标记有(NA/p) 2的值的物镜2A的一例的图。以往的物镜上标记有透镜 种类(例如"PlanApo")、倍率/NA油浸(例如"100x/l.40oil")和无限远/盖 玻片厚度(例如"oo/0.17")。但是，本实施方式的物镜(物镜2A)上除
64了透镜种类(例如"PlanApo")、倍率/NA油浸(例如"100x/1.40oil")和无 限远/盖玻片厚度(例如"oo/0.17")之外，还标记有射出开口角(例如 "(NA/卩)2: 0.05")。
以上，如说明所述，在第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的 装置中，物镜2A的以开口数(NA)和投影倍率(P)表示的(NA+卩)2 的值为0.01以上、优选为0.039以上。由此，即便为发光量少的发光试样 (例如发光蛋白质(例如由导入的基因(例如荧光素酶基因)表达的发光 蛋白质)、发光性的细胞或发光性细胞的集合体、发光性的组织试样、发光 性的个体(例如动物或脏器等)，也可以在短曝光时间内、甚至实时地拍摄 鲜明的图像。具体地说，以导入有荧光素酶基因的发光细胞作为摄像对象， 可以在短曝光时间内、甚至实时地拍摄鲜明的图像。另夕卜，物镜2A与以往 的物镜相比，开口数大且倍率小，因此使用物镜2A时，可以分辨率良好地 摄像宽范围。由此，例如可以将运动的发光试样或移动的试样或分布在宽 范围内的发光试样作为摄像对象。另外，对于物镜2A，在该物镜2A禾口/ 或包装该物镜2A的包装容器(包装)上标记有以开口数(NA)和投影倍 率(卩)表示的(NA二(3) 2的值(例如O.Ol以上、优选0.039以上)。由此， 例如当进行发光图像观察的人确认所标记的(NA+P) 2的值时，可以容易 地选择出适于在短曝光时间内、甚至实时地摄像发光试样的物镜。
以往，在使用荧光素酶基因的报告基因分析中，由于将细胞溶解后测 定发光量，因此仅能捕获某个时间点的表达量，而且是作为全部细胞的平 均值的计测。另外，在培养的同时进行测量中，虽然能够捕获细胞群落的 经时表达量的变化，但无法捕获各个细胞的表达量的变化。而且，为了用 显微镜观察各个细胞的发光，由于来自活细胞的发光量极其微弱，因此必 须用液氮温度水平的冷却CCD相机长时间地曝光，或者用安装有图象增强 器的CCD相机进行光子计数。因此，发光检测的相机变得昂贵且体积大。 但是，利用显微镜观察显示作为报告基因产物的荧光素酶的活性的各个细 胞的发光时，如果利用第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置， 则可以不用安装图象增强器且使用0"C左右的冷却CCD相机来获取定量的 图像。即，如果利用第1实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置， 由于可以用0t:左右的冷却CCD相机来观察活的状态下的各个细胞的发光，因此不需要图象增强器或用于光子计数的装置。即，可以以低成本进 行发光试样的摄像。另外，如果利用第1实施方式的用于实施发光试样摄 像方法的装置，则可以在培养的同时经时地观察各个活细胞的发光，进而 还可以实时地观察。另外，如果利用第1实施方式的用于实施发光试样摄 像方法的装置，则可以对同一细胞监测不同条件下的药剂或刺激的响应。
这里，为了使第1实施方式的发光试样摄像方法、发光细胞摄像方法 和物镜的理解变得容易，简单地说明以往的物镜和使用其的发光图像观察。
一般来说，显微镜观察下的空间分辨率S用下述数学式1表示。
f0.61x人+NA (数学式l) (数学式1中，X为光的波长、NA为开口数。)
另外，观察范围的直径d用下述数学式2表示。
d=D+M (数学式2) 〔数学式2中，D为视野数、M为倍率。另外，视野数一般为22 26。)
以往，显微镜用物镜的焦点距离按国际标准为45mm。而且，最近开 始使用焦点距离为60mm的物镜。以该焦点距离为前提，设计NA大、即 空间分辨率高的透镜时，工作距离(WD) —般为0.5mm左右，另外，即 便为长WD的设计，也为8mm左右。使用这种物镜时，观察范围为0.5mm 径左右。
但是，进行分散于皿或玻璃瓶皿中的细胞群或组织、个体的观察时， 观察范围有时遍及1 数cm。当想要分辨率良好地观察这种范围时，必须 在低倍率的同时将NA维持在很大的值。换而言之，NA由于为透镜半径与 焦点距离之比，因此可以在NA较大的状态下观察宽范围的物镜必须是低 倍的。结果，这种物镜成为大口径。另外，在大口径的物镜的制作中，一 般对于光学材料的物性均一性或涂覆均匀性、及透镜形状也需要高精度。
另外，为显微镜观察时，光学体系的透射率、物镜的开口数、CCD相 机的芯片(chip)面上的投影倍率、CCD相机的性能等对像的亮度具有很 大影响。而且，像的亮度用开口数(NA)除以投影倍率(P)的值的平方、 即(NA+(3)2来评价。这里，物镜一般在入射开口角NA和射出开口角NA' 之间存在下述数学式3的关系，NA"为表示到达观察者眼睛或CCD相机等 的亮度的值。NA'=NA+p (数学式3) (数学式3中，NA为入射开口角(开口数)，NA'为射出开口角，|3 为投影倍率。)
一般的物镜中，NA，至多为0.04、 NA"至多为0.0016。另外，调查目 前市售的一般显微镜的物镜的像亮度((NA+p^的值)，结果为0.0005-0.002
的范围。
即便使用安装有目前市售的物镜的显微镜来观察例如细胞内使荧光素 酶基因表达而发光的细胞，也无法用目视观察来自该细胞的发光，进而即 便观察用冷却至0"C左右的CCD相机摄像的发光图像，也无法确认来自细 胞的发光。另外；观察发光试样时，不需要荧光观察所必需的激发光的投 影。例如，在反射荧光观察中，物镜满足激发光投影透镜和将荧光集光而 形成图像的透镜的两方面功能。因此，为了用图像观察光量少的发光，必 要的是具有大NA和小P特性的物镜。结果，该物镜有成为大口径的倾向。 另外，这种物镜中，要求不考虑激发光投影的功能而将功能单纯化并易于 设计和制造。
另外，在利用发光或荧光观察的研究领域中，为了捕获试样内的蛋白 质分子的动态功能表达，要求延时或动态摄像。最近一直进行利用荧光的 蛋白质1分子的动态观察。这些摄像中，单位时间的摄像帧数越多，则图 像的每帧的曝光时间越短。这种观察中，需要的是明亮的光学体系、特别 是明亮的物镜。但是，与荧光相比，由于发光蛋白质的光量少，因此每帧 的摄像多需要例如20分钟的曝光时间。这种曝光时间下进行延时观察时， 限于动态变化非常慢的试样。例如，在约1小时内分裂1次的细胞内，无 法观察到该周期内的变化。因此，为了在将信噪比维持很高的同时高效地 将很少的光量图像化，重要的是提高光学体系的亮度。
在以上的基础上制作的第1实施方式的物镜与一般市售的物镜相比， 具有大NA和小卩的特性。这里，使用0r 5t:的弱低温冷却型CCD时， 利用(NA/p) 2的值为0.01 0.09范围的物镜可以在5分钟以内生成各个细 胞的发光蛋白质所产生的发光图像，且还可以测量各个细胞的发光量。与 此相对，在同样情况下，利用(NA/p) 2的值为0.007以下的物镜时，无法 生成可以用肉眼或图像解析软件识别的发光图像。因此，可生成发光图像的第1实施方式的物镜(NA/(3) 2的值(或NA'2)与以往一直使用的物镜 的其范围相比，是显著大的值。即，第1实施方式的物镜在与以往一直使 用的条件不同的条件下可以称作明亮的物镜。由此，当使用第1实施方式 的物镜等明亮的物镜时，可以用图像观察来自光量少的发光试样的发光。 另外，为了观察更暗的像，通过在实体显微镜上安装开口数大的第1实施 方式的物镜，即便用不安装图像增强器且使用冷却至0。C左右的CCD相机， 也可以用图像观察细胞的发光。另外，虽然有用使用液氮冷却的CCD相机 来提高感度的方法，但这种情况下的CCD相机非常昂贵，且规模变大。但 是，当使用第1实施方式的物镜时，即便是利用珀耳帖冷却的CCD相机， 也可以用图像观察细胞的发光。另外，利用安装有图像增强器的CCD相机 进行摄像时，将样本摄像为马赛克状，非常难以鉴定发光的细胞(参照文 献"David K, Velsh等，Current Biology, Vol. 14 (2004) 2289-2295 ，，)。
另外，第1实施方式的物镜为5cm 10cm左右的大口径。由此，可以 将以往无法成为摄像对象的具有摇晃、变形、分裂、移动等活动的发光试 样或分布在宽范围内的发光试样等作为摄像图像。通过第1实施方式，例 如在含有细胞的培养试样(组织或细胞群)中，由于可以观察到相当于lcm 见方、优选相当于2cm 5cm见方以上的视野范围，因此可以使各种重要组 织或器官(例如脑、视交叉上核、胰脏、肿瘤组织、线虫等)的整体或大 部分适当以薄切片等而在广视野下进行观察和解析，从此方面来说是优选 的。另外，通过上述说明，并不排除适用于液氮等极低温冷却CCD的第1 实施方式。这是由于，根据第1实施方式，仅靠含有物镜的受光前的光学 构成，即可实现即便是极低温冷却CCD也无法获得的高速摄像。因此，对 于第1实施方式的方法和装置，通过组合极低温的冷却CCD,由于可谋求 高感度化、且S/N比增大，因此可以提高图像质量。
作为物镜2A和成像用的集光透镜3A使用的透镜例如分别为"oil、 20 倍、NA0.8"和"5倍、NA0.13"的市售显微镜用物镜，对应于倍率Mg的综 合倍率为4倍。CCD相机4A例如为5。C冷却的显微镜用数码相机"DP30BW (奥林巴斯株式会社制)"，CCD元件为2/3英寸型、像素数为1360x1024、 像素大小为6pm见方。
另外，上述发光观察在室温(25°C)下进行。当将样本放在培养箱内时，或者将摄像单元或摄像装置的一部分或全部收纳在培养箱内时，在37°C 的环境下可以进行发光观察。
另外，通过该实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置，例如通
过5'C冷却的冷却CCD，可以不进行光子计数，在l分钟的短曝光时间内 即可摄像荧光素酶基因所发出的微弱光。
另外，通过重叠明视野像和自身发光产生的像，可以用鲜明图像观测 发光的荧光素酶基因的位置，并且可以容易地鉴定含有该荧光素酶基因的 细胞。
另外，通过该实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置，还可以 特定发光的荧光素酶基因的位置，以时间序列进行追踪，并测定发光现像 的经时变化。
另外，根据该实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置，通过使 物镜2A和成像用集光透镜3A构成的成像光学体系成为无限远校正体系， 可以在物镜2A和成像用透镜3A之间配置各种光学元件，可以用各种方法 观察样品1A。
另外，该实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置可以作为用于 光学地读取DNA微阵列或细胞阵列或蛋白阵列等生物芯片的生物芯片读 取仪来利用。作为具有多个收容部的基板的生物芯片为用玻璃或聚苯乙烯 等树脂制作的基板，且在其上以0.1 1.0mm间隔粘贴2 1000个阵列化的微 小部位(其直径例如为0.05 5.0mm)，在其各微小部位内配置多种DNA (或 RNA)片断或合成寡核苷酸或细胞或蛋白质等，用于研究基因的表达或特 定基因的存在等分子生物学上有用的信息。通常，由该生物芯片发出的荧 光或发光非常微弱。如果使用该实施方式的用于实施发光试样摄像方法的 装置，则即便大幅度减少在以往的固定有遗传学或免疫学物质的微小生物 芯片上的固定化量，也能够进行实时检测，在此方面是优异的。
一般的生物芯片读取仪在生物芯片所发出的光为荧光时，为激光照射 的共焦光学体系与高速移动扫描台的组合，利用该生物芯片读取仪的测光 为点激发光照射点的发光量之和，因此当扫描幅度发生变化时，每次测定 光量也变化，从而无法测定绝对光量。因此，如果利用该实施方式的用于 实施发光试样摄像方法的装置，则也可以例如使保持生物芯片的台相对于具有0.5mm直径视野的物镜以0.6mm步长移动，在每次停止时进行测光， 从而可以测定绝对光量。特别是，通过该实施方式，由于可以根据所需倍 率来设计具有能够充分检测发出比荧光更微弱的光的发光(化学发光、特 别是生物发光)的光学条件的摄像装置，因此可以执行生物芯片的定量且 高感度的发光解析。 第2实施方式
第2实施方式的用于实施发光试样摄像方法的装置(微弱光样本摄像 装置)为倒置型。在图28的倒置型微弱光样本摄像装置中，通过配置在阻 断来自外部的光的腔室等遮光装置内，可以在不受到外部光的影响的情况 下精度良好地、稳定地检测微弱光，可以鲜明地对样本4B的自身发光所产 生的像进行摄像。这里，图28所示的遮光装置通过基底41B、围壁42B和 盖43B形成暗室，微弱光样本摄像装置在该暗室内具备在基底41B上。在 该遮光装置中，通过提起旋钮45B，使铰链部44B为中心，打开盖43B， 可以更换样本1B。
另外，当将第2实施方式的微弱光样本摄像装置配置在遮光装置内时， 通过具有键盘、鼠标等输入装置47B的计算机等控制装置46B，可以从遮 光装置外部对该微弱光样本摄像装置进行遥控操作和自动控制，特别是， 可以对相对于样本1B的焦点对准动作和位置对准动作、相机5B等的摄像 动作、利用照明光纤15B的照明光的调光等进行自动控制。
这里，相对于样本1B的位置对准动作是指在大致垂直于光轴的方向上 移动由物镜6aB和成像用透镜10B所构成的成像光学体系、保持相机5B 和样本1B的试样台13B中的至少一个，从而将样本1B配置在物镜6aB的 视野内的动作。另外，也可以利用该位置对准动作，按照艾里斑(airy disc) 的中心与CCD的像素中心相一致的方式，对成像用透镜10B所形成的艾里 斑中每个所注意的艾里斑进行处理。此时，例如也可以相对二维地操作艾 里斑和像素，检测对应于该像素的输出达到最大的位置。
另外，控制装置46B如图28所示，具备显示装置48B，可以在该显示 装置48B中将对应于样本1B的明视野像的图像与对应于样本1B的自身发 光所产生的像的图像重叠地进行显示。而且，控制装置46B可以具备保存 这些图像的存储器等存储部。另一方面，第2实施方式的微弱光样本摄像装置还可以替代试样台
13B，例如如图29所示那样，具备由培养皿51B、隔壁52B和透明板53B 构成的作为收容机构的密闭容器，并可在培养皿51B上保持样本1B。这里， 该密闭容器具备将由未图示的空气调节装置产生的恒温低湿的C02供至该 密闭容器内的给气管54B和将该密闭容器内的C02排出的排气管55B，从 而可以调整该密闭容器内的温度、湿度、气压和C02浓度中的至少一个。 另外，还可以代替给排C02，而在该密闭容器内部设置加热片等，从而以 电的方式调整该密闭容器内的温度。
另外，第2实施方式的微弱光样本摄像装置还可以设置照明样本1B的 照明机构。此时，可以使用由白色光源等导入照明光的照明光纤、组合白 色LED和单透镜来实现临界照明的照明装置、作为使用聚光透镜的柯拉照 明装置的显微镜用UCD等。另外，第2实施方式的微弱光样本摄像装置还 可以具备用于进行微分干涉观察或相位差观察的照明装置作为照明机构。 但是，此时有必要具备专用的环形制动器(ringstop)、棱镜、物镜等。
另外，优选根据试样的种类或目的来适当选择是将第2实施方式的微 弱光样本摄像装置制成正立型光学体系，还是制成倒置型光学体系。制成 制成正立型的优点在于，在使用用于使与试样容器的接地良好的膜的组织 切片的观察中，易于从膜不会成为阻碍的上方进行观察。在组织切片的观 察中，极为重要的技术是在将具有适当切片成薄至近1层的细胞层的生物 组织的切片进行长时间培养的同时，可以长时间且连续地对其发光图像进 行摄像。作为这种组织切片的例子，可以举出小脑、视交叉上核等中枢系 统组织、胰脏、脏器肿瘤等各种器官系统组织。另外，当生物试样为线虫 等具有透光性的小动物或昆虫类时，也可以不将该生物试样切片来进行观 察。第2实施方式的微弱光样本摄像装置由于还可以提供具有广视野的光 学体系，因此利用该装置，通过无毒的发光图像，可以长时间观察维持运 动能力的小动物或昆虫类等生物试样的优点很大。另一方面，制成倒置型 的优点在于，在想要在更严格的遮光条件下测定微弱光时，由于可以将摄 像体系全部配置在试样台的下方，因此可以在与在试样上方进行的操作光 学上隔离的同时(在尽量使外来光等的影响不介入的状态下)进行试样台 上的各种操作(例如培养皿等的交换、药剂等的注入、为了其它保守检查
71而打开盖子)，从而可以维持恒定的摄像条件。
另外，第2实施方式的微弱光样本摄像装置中，使用CCD作为摄像机
构，但并非限定于此，还可以是为CMOS等具有与0T:左右的冷却CCD相 同摄像感度的摄像元件。
有关产生上的可利用性的补充
如上所述，本实施方式的发光试样摄像方法、发光细胞摄像方法和物 镜优选用于例如在以荧光素酶等发光基因为报告基因、控制基因表达的启 动子或增强子的解析中，或者研究转录基因等效应物或各种药剂的效果等 的报告基因分析中。
接着，根据本实施方式的主旨，说明其可适用的范围。
图像解析用的细胞和试样的例子
本实施方式的系统和方法可以根据基板的种类而容易地适用于将以各 种多样形式提供的各种任意细胞进行图像化。例如细胞可以为细菌、原生 动物、菌类的原核细胞或真核细胞，且还可以为来自鸟类、爬虫类、两栖 类、植物、或哺乳类(例如灵长类(例如人))、啮齿类(例如小鼠、大鼠)、 兔子、有蹄类(例如牛、羊、猪等)等)的细胞。细胞可以为原代细胞、 正常和癌化了的细胞株、基因改变细胞以及培养细胞。这些细胞中包括自 发诱导的各种细胞株、从各种细胞株中针对所需生长特性或响应特性选择 出的各种细胞株、从作为肿瘤的种类近似但由不同的患者或不同部位诱导 的多个细胞株。细胞的培养通常在含有经保湿的92 95%的空气和5 8%的 C02且其气温例如控制为37"C的培养箱内、在灭菌环境下进行。细胞的培 养可以在含有成分未特定的胎牛血清等生物学流体的营养混合物中进行， 也可以在成分全部己知的无血清培养基中进行。
特别关心的对象为神经细胞和神经前体细胞的图像化。进行图像化的 细胞还可以是经遗传性改变的细胞(例如重组细胞)。特别关心的对象虽然 为活细胞的图像化，但本实施方式根据方式也寻求细胞膜浸透化或固定细 胞的图像化。细胞通常在含有以维持和/或培育细胞为目的的培养液的试样 中被图像化。
本实施方式的多个方式(特别是包括返回至同一细胞视野的工序和/或 返回至细胞视野中相同的个别细胞的工序的方式)中，使细胞充分地固定在基板表面上(例如附着在基板(例如通过用相对于细胞为附着性的物质 涂覆而进行过处理的基板)表面上)，即便进行基板的操作，细胞相对于基 板也不会发生相对的移动。例如，使细胞直接附着在基板(例如孔中的组 织培养用塑料)，使细胞的位置相对于基板相对固定，从而可以在细胞相对 于基板的位置不会移动的情况下进行基板的操作。这样，既可准确地返回 至同一细胞视野，也可准确地返回至细胞视野中的相同的个别细胞。
本实施方式一般寻求单一细胞水平的图像化，特别是寻求活细胞的图 像化。细胞可以作为孤立的单一细胞分散在基板表面上，也可以例如如单 层的情况那样与其它细胞相接触，另外，也可以例如如组织切片的情况那 样形成薄层。进行图像化的细胞既可以为均质的细胞集团，也可以是异质 的细胞集团(例如混合细胞培养物)。如此，本实施方式可以进行单一细胞 的图像化和细胞集团(该细胞集团根据情况也可以含有多个不同的细胞) 的图像化。
细胞的图像化也可以利用能够检测的标记物(例如荧光水平或发光(化 学发光、生物发光)水平)进行，另外，还可以不利用它们来进行。利用 这种能够检测的标记物以及与细胞一起利用该能够检测的标记物的方法在 本技术领域中是周知的。作为能够检测的标记物，例如可以举出荧光团(或 荧光)、化学发光体、其它适当的能够检测的标记(例如在FRET (荧光共
振能量转移)检测体系或BRET (生物发光共振能量转移)检测体系中使 用的标记)等。
本实施方式的系统和方法可以进行细胞集团和各个细胞的图像化。本 实施方式的系统和方法特别可以进行用于观察细胞的存活度(例如细胞的 存活率或细胞的健康)、细胞的生理学性质(突触的生理学性质)、信号传 达、细胞器的位置和功能、蛋白质的位置和功能(包括相互作用和周转)、 酶活性、受体的表达和位置、细胞表面的变化、细胞结构或分化、细胞分 裂等的经时图像化。例如，在一个方式中，在判断蛋白质的表达(例如亨 廷顿舞蹈病中的亨廷顿蛋白的比例)和蛋白质的水平变化或凝集是否引起 细胞死亡时使用本实施方式的系统和方法，或者在判断它们是否是细胞死 亡的症状(例如是用于防止细胞本身导致的细胞死亡的尝试，并非是细胞 死亡本身的原因)时使用本实施方式的系统和方法。特别关心的对象是关于培养中的神经细胞的神经变性的研究。
本实施方式的系统和方法可以实时地间隔所需的时间、例如较短时间 对单一细胞或细胞的集团进行图像化。
本实施方式的系统和方法可以迅速地进行细胞的图像化(例如位于相 邻孔的细胞的图像化)，而且可以间隔比较短的时间，通过返回至含有相同 的个别细胞的同一细胞视野中而进行再次图像化，因此可以进行通过以往 方法由于获取各图像需要的时间长等而无法进行的观察。本实施方式中， 还可以间隔比较短的时间追踪细胞现象(例如细胞的功能、细胞的存活、 集团中的各个细胞的命运)。这与仅在特定的时间点获得所摄像的图像，对 于进行的现象(例如变性)所获得的信息的量有限，且一味需要时间的以 往的免疫细胞化学研究成为对照。具体地说，例如在针对神经变性的以往 的免疫细胞化学研究中，分析300,000个细胞通常需要6周，但使用本实施 方式的系统和方法时，可以在远少于一半的时间内完成该相同的分析。使 用本实施方式的系统和方法时，利用显微镜和计算机的处理，可以在1小
时内完成如果用手动通常需要6天的免疫细胞化学分析或使用显微镜的分
析的操作。
另外，本实施方式的系统和方法由于即便将基板从系统中取出、之后 再次放置回系统中，也可以准确地鉴定相同的细胞集团和细胞集团中的各 个细胞，因此也可以长期地(例如数小时、数天、数周或更长期间)分析 单一细胞和所选细胞集团。
本实施方式的系统和方法中，还可以大致同时或完全同时地对多个生 物学变量(例如细胞功能的参数或变量)进行定性或定量的测定。例如， 使用本实施方式的系统和方法，通过并用相位差将细胞图像化，可以进一 步获得细胞形态或分子各现象变化的信息。另外，本实施方式的系统和方 法中，其他方式可以使用多个能够检测的标记物将细胞图像化。
本实施方式的系统和方法的适用事例
本实施方式的系统和方法对于使用了多种多样细胞的各种设定是有用
的。本实施方式的系统和方法中，也可以在任意的所需期间(例如2小时、 5小时、12小时、24小时、2天、4天、6天、7天、数周、直至关注对象 的细胞寿命的期间)内追踪组织培养中的细胞或细胞集团。以细胞为代表的生物试样的图像化可以间隔对应于上述期间的一定时间来进行，还可以 以其它方式进行。以下为这种图像化的例子，但本实施方式并非限定于此， 在以下的图像化的例子中，强调本实施方式的特定优点或特征。 用于防止或降低光毒性的细胞的图像化
光毒性在进行活试样的图像化中经常成为重要的制约因素，光毒性与 入射光的强度、照射时间、波长直接相关。在研究缓慢进行的过程时，由 于不得不反复照射同一细胞试样，因此光毒性尤其成为问题。因此，使用 本实施方式的系统和方法来降低用于检测能够利用的信号所必需的入射光 的量。本实施方式中，通过数个方法显著地降低光毒性。通过本实施方式 的系统和方法，可以通过极短时间地照射低强度的白色光来对准显微镜的 焦点，之后通过照射更高强度的光而获得高析像度的荧光图像。另外，在 不进行聚焦的自动化时，焦点通常通过连续照射高强度的荧光来对准。但 是，考虑到对准显微镜焦点所需要的时间及之后获取图像所需要的时间， 与进行自动化的情况相比，细胞可以被具有光毒性的高强度光以长一位数 左右的时间照射。
另外，本实施方式的系统和方法在一旦对准焦点后，不用重新对准焦 点即可获取多个相邻的荧光图像，因此在降低光毒性方面有利。本实施方 式的系统和方法中，细胞视野的大部分仅将图像生成所必需的光作为显著 的光而接收，因此可以说该系统和该方法在获取荧光图像的方面被最优化。 最后，本实施方式的系统和方法中，由于通过自动化，高强度的光的照射 时间本质上减少，因此也难以发生光退色，所发出的荧光是明亮的，因此 产生高析像度的图像所必需的激发时间也进一步减少。
利用刺激的基因表达的光学成像
本实施方式例如可以如下实施。
首先，例如使用上述基因导入方法，将能够表达地与通过使物质接触 于细胞时的该接触的剌激而诱导表达的基因的启动子区域连接的报告基因
(优选来自萤火虫或海肾(Renillareniformis)等的荧光素酶)导入至规定 数量(例如1 1xl(f个、优选lxl0llxl(^个)的细胞中。接着，使用能够 培养细胞的所需器具(例如培养皿、具有多个孔的多孔板等)，在所需的营 养培养基(例如D-MEM培养基等)中培养上述导入有报告基因的规定数量的细胞。接着，将由该规定数量的细胞构成的试样预先保温在对于细胞
最佳的温度(例如25 37"C、优选35 37"C)，设置在为了防止试样的干燥 而注入水以进行保湿的发光显微镜的培养装置部，通过处于该发光显微镜 的试样观察部的物镜利用数码相机来记录发光像。接着，以所需浓度(例 如lpM lM、优选100nM lmM)将用于接触细胞以进行刺激的物质(例 如化合物)加入到试样中，以所需的时间间隔(例如5分钟 5小时、优选 10分钟 1小时)记录该试样的发光像。之后，使用市售的图像解析软件(例 如MetaMorph (商标名)；Universal Imaging公司制等)来获取所记录的发 光像内所需区域的亮度值。
而且，当本实施方式具有在与发光像相同的视野中也摄像并记录明视 野像的构成时，由于图像解析软件进一步具有重叠发光像和明视野像的功 能，因此对于意外地迅速运动的细胞等(例如整个组织、特定细胞群、各 个细胞、细胞的一部分区域等)所产生的不鲜明的发光图像，也可以利用 明视野图像等鲜明图像来准确地进行该细胞等的识别，因此具有还可以稳 定地维持解析可靠性的优点。这样，用于进行使用了本实施方式的摄像方 法和装置的图像解析的图像解析软件至少具有利用形状或大小等参数给出 的轮廓信息来识别发光图像中各个细胞等(整个组织、特定细胞群、各个 细胞、细胞的一部分区域等)的识别功能、和测量由所识别的细胞等产生 的发光量的测量功能，优选具有根据来自控制摄像装置的计算机或操作者 操作的输入机构(键盘、鼠标、数字键、触摸面板等)的要求而将测量结 果输出的功能。测量结果更优选对应所识别的细胞等的图像信息来输出。 输出的形式可以为对应发光量的模拟图像或数值，当解析多个细胞时，还 可以用正态分布、柱状图、折线图、棒状图等曲线来表示。另外，当输出 关于相同细胞等的时间序列的解析结果时，其输出形式可以为按照经过时 间顺序排列发光量的点分布，还可以为按照时间顺序用线连接的波形图案。 波形图案特别适于显示时钟基因等周期性的发光数据。图像解析用的软件 可以根据需要按照对输出后的曲线或波形图案单独进行解析或对与其它细 胞等的相关进行解析的方式而构成。而且，对于输出至显示器上的解析结 果，当通过上述输入机构指定有兴趣的部分时，优选具备在显示器上表示 所对应细胞的等图像的重复调用功能。该重复调用功能进一步优选具有将对指定的细胞等进行摄像的整个期间或特定期间内的动态信息进行显示的 显示模式。
活细胞的长时间内的图像化
活细胞基本在细胞培养用塑料上进行培养。研究活细胞时，特别在缓 慢进行的过程中研究活细胞时，有必要在覆盖研究过程的充分的吋间内维 持活细胞(例如神经细胞)的健康。理想的是，在相同于细胞原本生长的 培养皿中间隔一定时间进行细胞的图像化时，细胞的健康被保持，且杂乱 的程度也最小。虽然可以在灭菌条件下用倒置显微镜将组织培养皿中的细 胞进行图像化，但为倒置显微镜时，通过细胞生长的基板(例如玻璃或塑 料)进行图像化。组织培养用塑料与玻璃相比，根据波长不同(例如紫外 线)，透射性差，发生光的散射，图像分辨率降低。但是，以神经细胞为代 表的多个细胞即便在用聚赖氨酸和昆布氨酸涂覆基板以促进细胞的附着和 分化时，与玻璃相比，用组织培养用塑料培养时更可在长期间内生存，并 显示健康的外观。因此，本实施方式的目的在于提供具备无论透过的是塑 料还是玻璃均可获得高品质图像的光学体系的系统。
通过玻璃或塑料自动地获取图像时，对于能够使用的物镜也有重要的 影响。即，液浸透镜通常相比较于非液浸(空气)物镜可以集光更多的光， 但液浸透镜需要浸渍溶剂，在自动图像化时供给该溶剂是不现实的。使用 非液浸透镜通过具有各种组成和厚度的基板来对准焦点的操作也具有很多 问题。这些基板的折射率随制品而不同，所发出的荧光被集光至物镜之前 所通过的空气的折射率也不同。当通过不同折射率的物质进行图像化时， 发生像差和球面像差，由于该像差，透镜的开口数增大。像差在20倍下显
著化，在40倍下变为实质的像差，在60倍下几乎无法克服。最后，根据
试样，也有如培养脑切片那样稍微离开组织培养皿的底面而存在的试样，
有必要使用自动判断焦点面的算法从沿着z轴的各种平面获取图像。此时，
优选对本实施方式的发光摄像数据适用光学重叠合法功能。通过采用光学 重叠合法功能，并非限于切片，对于生物组织或小型生物(昆虫、动物、
植物等)也可提供3维图像。在3维图像中，不仅容易区分沿着检测光路 重复的多个细胞等试样，而且可以高精度地定量存在于相当于检测光路上 不同距离的各位置上的各个试样。另外，当使用焦点距离极长的物镜时，可以使焦点对准远离的对象物，可以防止自动对焦期期间物镜与组织培养 板发生冲突。
高处理筛选分析法
本实施方式的系统和方法对于进行高处理筛选分析法特别有用。作为 这种分析法的例子，有引起细胞所需响应(例如细胞死亡的调节、受体的 内部移动、信号传达路径的活性调节(上升或下降)、转录活性的调节等) 的物质的鉴定、具有目前未知或无法研究的功能的核酸的分析(例如将所 关心对象的编码序列导入目标细胞中，在细胞中使其表达而进行的分析) 等，但并非限定于这些。
当评价多个参数时，使用在检测时能够区别的标记物，可以检测不同 的变量。例如，当筛选分析法包括被多核苷酸编码的基因产物的影响的评 价时，可以使用1种标记物来鉴定用对象构建物转染了的细胞(例如通过 在含有关心对象的多核苷酸的构建物中被编码的能够检测的标记物的利 用、或者通过在与关心对象的构建物同时转染的构建物上存在的能够检测 的标记物的利用，从而鉴定关心对象的构建物中的被转染的细胞)，使用第 2标记物来检测基因产物的表达(例如对由被该多核苷酸编码的基因产物所 生成的融合蛋白质所提供的能够检测的标记物中的基因产物进行检测)，使 用第3能够检测的标记物来评价对基因产物的目标细胞的影响(例如通过 处于假设由候补多核苷酸的基因产物调节的启动子的控制下的报告基因的 表达、或者通过由候补多核苷酸的基因产物所调节的因子来评价细胞的存 活度等)。另外，还可以由相位差图像获得有关细胞的形态变化(例如细胞 的分化或细胞结构(例如树状突起)的形成)的信息，此时，可以将相位 差图像与例如按每个细胞以规定的选择的时间间隔获取的荧光图像进行重 叠来比较。
在利用筛选分析法鉴定调节目标细胞上的受体活性的物质的其它例子 中，可以使用第一标记物检测物质相对于受体的结合，使用第二标记物检 测报告基因的转录所产生的活化。本实施方式中使用时，"能够检测的标记 物"包括在规定波长下激发时产生能够检测的信号的分子。
本实施方式中，在同一分析法中使用多个荧光标记，分别定性或定量 地检测细胞，还可以同时检测和/或测定多个细胞响应。已经开发了用于利
78用荧光的独特特性的数量众多的定量技术，作为这种技术，例如可以举出
直接荧光测定法、荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振法或各向异性法 (FP)、时间分辨荧光法(TRF)、荧光寿命测定法(FLM)、荧光相关分光 法(FCS)、荧光退色恢复法(FPR)。特别关心对象是可以适用于活细胞、 且根据情况放置所需时间后也能够使用(例如放置数小时或数天的间隔也 能够进行所摄像的图像之间的比较)的标记技术。本实施方式可以将使用 这些荧光的分析法改变为使用不需要光激发的发光的分析法。如果不需要 光激发，则不仅可以简化光学机器，而且根据上述光学条件可以以适当的 倍率获取充分明亮且定量性优异的测定数据。 作为试样的多肽
根据方式不同，试样为"多肽"或"蛋白质"。这些用语可以互换地使用， 指的是任意长度的聚合物形态的氨基酸。作为例子，可以举出经基因编码 的氨基酸和未经基因编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰的(例如翻译 后修饰的、和例如糖基化的)氨基酸、或变性氨基酸、聚合物多肽、以及 具备修饰肽骨架的多肽。作为能够筛选的"多肽"，有为渗出蛋白质且具有 不同氨基酸序列的多肽、异种和同种前导序列相融合的多肽、具有或没有 N末端蛋氨酸残基的多肽、经免疫标记的蛋白质等。多肽的修饰例如也可 以为了促进对基材(例如珠粒等固相载体、多孔基板、毛细管阵列)的附 着而进行。使用该基材时，可以通过高表面积或微小体积进行微量物质的 检测。多肽在未进入细胞内时，多肽例如可以通过微注射而导入目标细胞。
筛选分析法中所使用的细胞
作为适于本实施方式的筛选分析法的细胞，可以举出上述细胞。根据 方式不同，特别关心的对象是例如通过对目标基因产物的结合、目标基因 产物的表达的调节或目标基因产物的生物学活性的调节，使表达目标基因 产物的重组细胞的分析和分析法适用于与目标基因产物发生相互作用的候 补物质的检测。本说明书中使用时，"目标基因产物"是指以成为候补物质 筛选中心的蛋白质为代表的各种基因产物，但并非局限于这些。例如可以 以目标基因产物为受体，使分析法适用于调节受体活性的物质的鉴定。
一般的分析方法
无论以何为目的进行筛选分析法，在分析法的工序中均是使物质与细胞相接触，在该工序中，为遗传物质时，将物质导入细胞内，对于细胞的l 个以上变量进行检测。测定对应于物质的细胞参数的读取值的变化，如果 可能的话进行标准化，将该参数与对照用的读取值进行比较，从而评价。 该评价可以使用对照用的读取结果、各种因子的存在下和不存在下获得的 基础读取值、通过使用其它物质(可以包含或不含公知路径的公知阻碍物 质)获得的读取值等。作为分析对象物质，可以举出具有具备直接或间接 地调节对象细胞的对象细胞参数的任意生物学活性的分子。
物质优选在细胞内为溶液的形态或以易溶性的形态加入培养中的细胞 的培养液中。物质还可以以间歇的或连续的流动的形态加入至通流 (flow-through)系统中，除了添加时之外，还可以一次性全部或每次少量 地将化合物加入静态溶液中。在通流系统的一例中，使用2种流体， 一种 流体为生理学中性的溶液、另一种流体为在相同溶液加入有试验化合物的 流体。使第一流体在细胞上通过，之后通过第二流体。在仅使用1种溶液 的方法中，将试验化合物一次全部加入至细胞周围特定量的培养液中。培 养液成分的总浓度不能随试验化合物的添加或者在通流法的2种溶液之间 有显著变动。
根据方式不同，物质的组成不含对全体组成有显著影响的追加成分(例 如防腐剂等)。此时，物质的组成基本由试验对象物质和生理学上允许的载 体(例如水、细胞培养液等)构成。其它方式中，筛选分析法中可以含有 其它物质，作为这种物质，例如可以举出用于使物质与结合伴侣的静态结 合成为可能的物质、用于减小非特异性相互作用或背景下的相互作用的物 质等。对于这种物质，当然有必要选择与活细胞的筛选适合的物质。
如上所述，并列实施使用不同物质浓度的多个分析法，可以获得对应 于各种浓度的示差响应。如该技术领域中公知的那样，在确定物质的有效 浓度时，通常使用1: 10或通过使用其它对数尺度的稀释而获得的范围的
浓度。该浓度根据需要也可以通过进行第二次的连续稀释而进一步精细化。 通常，这些浓度的1个起到阴性对照的作用，该阴性对照为零浓度、或小 于物质的检测水平的浓度、或无法获得能够检测表达型的变化的物质浓度 以下的浓度。
以下示出利用本实施方式的系统和方法的各种方面或特征的分析法的例子，但本实施方式并非局限于这些。 药剂筛选分析法
本实施方式的图像化系统和方法可以适用于遍布多方面的分析样式， 对于候选物质对目标细胞产生的所需生物学效果(例如对象细胞参数的调 节)进行筛选，该生物学效果可以在使用物质作为药剂时具有意义。例如， 可以针对细胞分化、细胞死亡(例如凋亡的调节)、信号传达(例如G结合 蛋白受体中的信号传达、GTP结合、第二信使体系的检测等)、离子通道的 活性(例如通过使用l丐-图像化来评价流入)、转录(例如使用报告基因分 析法，对例如对目标基因产物的表达具有影响的物质进行鉴定)等调节来 研究各种物质。特别关心的对象是能够与活细胞一起使用的分析法。
在一个方式中，筛选分析法可以为检测细胞中候补物质对结合伴侣的 结合的结合分析法，例如用于鉴定相对于受体作为激动剂或拮抗剂配体发 挥作用的物质的筛选。在特定的方式中，分析法例如还可以为针对公知的 受体配体(例如公知的激动剂或拮抗剂)的活性阻碍来评价候补物质的拮 抗结合分析法。在后者的方式中，可以按照能够检测公知的配体的方式进 行标记，例如随着公知配体的活性降低或结合，该公知配体的能够检测的 禾示记也减少。
在与目标细胞一起培养候补物质时，培养可以在任意适当的温度下进
行，通常可以在4 4(TC下培养。培养时间按照活性达到最佳的方式进行选 择，但也可以在迅速进行高通量筛选的基础上选择最佳时间。培养时间通 常0.1~1小时即足够了，但根据方式不同，有时也优选设置该培养时间或 更长的适当时间后研究细胞。
另外，发明人还发现在同一培养皿内培养的多个细胞中，基因表达的 变动模式不同。而且，根据发明人进一步研究的光学条件，发现当摄像装 置的物镜的"开口数(NA)/投影倍率(卩)的平方"所表示的光学条件为0.071 以上时，可以在1 5分钟以内图像化，可以提供还能够进行图像解析的细 胞图像。将利用蓄积型的摄像装置对这些发光图像进行显微镜观察的发光 解析系统称作发光显微镜。发光显微镜优选具备具有用于遮光的开合盖(或 者开合窗)的遮光机构，通过该遮光机构的开合，可以放置或交换必要的 生物试样。根据目的，还可以手动或自动地对收容生物试样的容器进行化学或物理学刺激的操作。在最佳的一个方式中，发光显微镜搭载有公知或 独特的培养装置。培养装置具各将温度、湿度、pH、外部气体成分、培养 基成分、培养液成分维持在最佳的功能，以使系统内的长期间解析成为可能。
成为发光材料基础的生物学材料例如可以举出真核动物、来自蓝细菌 的细胞或组织。在医学用途中，特别可以举出含有利用活检从哺乳类(特 别是人)的预检査部位切除后所得的细胞的试样。在再生医疗中，特别可 以举出至少一部分为人工改良或合成的生物试样，可以用于检查是否良好 地维持了生物学活性。另一方面，本实施方式的分析对象并非限于动物来 源的细胞或生物组织，还可以是植物或昆虫来源的细胞或生物组织。在细 菌、病毒中，利用以往亮度计无法执行的容器内各部分的解析可以成为对 象。根据亮度计，通过在孔或培养皿等容器内重叠无数的试样(例如每孔
ioo万个以上)，可以迅速地获得强大的发光量。本实施方式中，由于生成
了肉眼完全看不到的各个发光试样的图像，因此即便以各个细胞能够识别 的程度的密度收容在容器内，也可以解析各个细胞或生物组织。这种分别 解析包括仅将发光的细胞用统计学的方法进行合计或平均化的解析方法。 由此，可以进行有关每个细胞的正确的相互作用的评价。另外，在多个混 存的发光试样中，可以识别同样发光量或具有发光图案的细胞群或组织区 域。
有关第1实施方式的用语的补充说明和变形例
作为收容样品1A的试样容器，可以举出培养皿、载玻片、微孔板、 流通池。这里，容器底面当然是透光性的材料(玻璃、塑料等)，还优选具 有宽幅(或扁平)底面的容器，以使得易于获得2维数据。在将多个收容 部一体化而成的孔或比色杯中，优选用遮光性的材料或染料整面地成形各 收容部分的隔壁部分。另外，对于培养皿等具有上部开口的容器，优选盖 上防止蒸发用的盖子，进而在提高S/N比的方面，优选在盖子的内面上施 以防反射用的覆膜或染色。还可以代替这种硬质的盖子，在容器内试样的 上面配置矿物油等液态的盖子。还可以根据需要如一般的显微镜装置那样， 为了变成其它的摄像用视野，使用于载置试样容器的试样台在X轴方向和 Y轴方向上移动。物镜2A还可以以倒置形式配置在样品1A的下方。物镜2A还可以用 适当的加热机构(珀耳帖元件、暖风加热器等)进行加热，以使得在培养 条件等恒温环境下使活的发光试样稳定地发挥功能。物镜2A进而还可以在 作为光轴方向的Z轴方向上驱动(图26中为上下方向)。在物镜2A中具 备物镜的Z轴驱动机构，沿着Z轴(光轴方向)自动地驱动物镜2A。作为 物镜的Z轴驱动机构，可以举出齿条齿轮机构或摩擦辊机构作为例子。
另外，物镜2A可以根据所需的倍率适当地制成油浸式。另外，根据 预评价(或解析)试样的大小来任意地设定选择何种倍率。具体地说，可 以是能够观察细胞或组织的程度的低倍率(例如5倍~20倍)或是能够观 察细胞内或细胞外的微小物质的程度的高倍率(例如40倍 100倍)。
CPU5A优选提供下述解析方法通过具备用动画显示发光试样的图像 信息的构成，用实时的映像观察关于1个以上所需细胞的活性变化。由此， 即便用具有亲临现场感的映像也可以以时间序列观察细胞单位或组织单位 的发光样子。
本实施方式中，用于以时间序列观察的方法和装置还可以以用于控制 或联合必要装置构成的软件或使该软件带有特征的计算机程序的形态来提 供。另外，通过将本实施方式的方法或装置电连接于与装置同一或分别配 置的数据库，可以在不受到图像容量或解析信息量的限制的情况下提供高 速且可靠性和质量高的解析结果。
本实施方式中，通过使用作为化学激发试剂的底物溶液所产生的发光 (冷光)，在检测工序中不需要用于照射激发光的构成。而且，在使用显微 镜的观察中，对于发出肉眼不可见微弱光的发光试样，通过使用高开口数 的物镜，可以不采用使用需要利用液氮的极低温(例如-30 -6(TC)的冷却 那样的大型且高成本的超冷却CCD,可高速地进行图像化。具体地说，作 为主要构成，具备具有高开口数(高NA)且使对象物包含在观察视野内 的投影倍率的物镜；在弱低温(例如-5'C或更高温度下)、至多室温(或装 置内温度)附近可以连续地发挥功能的摄像元件(CCD、 CMOS等)；将对 象物保持在适于图像生成的位置的保持机构；收容这些物镜、摄像元件、 保持机构并用于保障图像生成时的遮光的遮光机构。当CCD为小型且可在 弱低温下控制时，作为整个系统为小型，即便在相同外壳内收容全部的构
83成要素，也可以设计成在桌上可俯视的高度。因此，将本实施方式实现化 的装置成为非常小型且低成本的商品。通过小型化，由于装置内空间也成 为小体积，因此易于将装置内的生物学环境(温度、湿度、空气成分)的 条件调节至适于培养或微量反应的水平，还具有更低成本和更高可靠性的 优点。另外，通过降低整个装置的高度，可以由装置上部介由适当的开合 窗或开合盖简单地进行发光试样的放入取出、或对已收容的试样分注药剂 等剌激处理。
另外，本实施方式提供不进行光扫描即可用大量像素(优选多像素数) 进行图像生成的方法和装置。在所生成的图像的图像解析中，解析细胞的 图像解析软件也作为本实施方式的一部分单独地或者作为与发光显微镜的 整个系统来提供可在产业上利用的制品。
以下的关于高通量摄像装置的说明也包括作为本实施方式单独地或者 作为与以上述说明中所记载的实施方式的组合。但是，对于下述内容所共 有的其它方法或装置，在以下说明的范围内并非局限于本实施方式的主旨， 包括可分割的实施方式的记载。
关于高通量摄像装置的技术领域
本实施方式涉及通过延时对设定在1个以上生物学试样的多个摄像区 域进行摄像的摄像装置，特别涉及用于能够高通量摄像的高通量摄像装置。 另外，本实施方式涉及含有进行这种摄像装置功能的程序的软件。本实施 方式适于大量、效率良好地检查生命体来源的细胞等生物学试样的生物学 活性的研究或临床用途。关于高通量摄像装置的
背景技术：
生物由于具有高度的复杂性，因此理解结构或功能并非易事。因此， 近年来一直利用使用能够再现生命现象的最小单位即细胞(也就是培养细 胞)的简易的实验体系。通过使用培养细胞，对于激素的响应等的解析， 不受生物体内其它因素产生的影响的实验成为可能。即，通过基因的导入 或阻碍，可以进行基因的功能解析。
为了培养细胞，必要的是使用模仿生物体内的环境。因此，温度为体
温的37'C，另外，使用模仿细胞间液的培养基。培养基除了氨基酸等营养 源之外，还含有用于调节pH的碳酸缓冲液。碳酸缓冲液在含有5%的高分压二氧化碳的空气的存在下成为平衡状态，用于组织等开放体系的培养。 另外，为了防止水分从培养基蒸发，要求95~100%的高湿度环境。
细胞的培养中使用具备上述环境条件的二氧化碳培养箱。而且，细胞
的状态观察中使用相位差显微镜或微分干涉显微镜，GFP等的表达观察中 使用荧光显微镜。另外，在显微镜图像的摄像和显示中使用CCD相机和控
制器(电脑)，提出了将它们组合而成的培养显微镜(专利文献l:日本特
开2003-29164号公报)。
关于高通量摄像装置所要解决的课题
长时间或长期地用显微镜观察培养的细胞时，以延时观察方式进行， 时间序列地获得图像。延时是指一定间隔的时间内进行试样的摄像、图像 的保存，为了易于确认长时间变化的细胞的状态而使用。例如，开始以所 需摄像时间(相机的曝光时间)对1个细胞摄像1次，之后每小时摄像1 次，持续摄像24小时，则可以获得25张图像。摄像这些图像后连续地再 生时，可以容易地确认每小时的细胞变化。摄像间隔当短至例如30分钟、 15分钟时，也可以观察动作迅速的细胞。
另外，在想要在多个位置观察细胞时，使用显微镜所附带的电动台将 显微镜或试样移至目标位置进行观察。向观察位置的移动与延时同时进行。 将这种依次观察多个观察位置的延时称作多点延时。另外，利用上述本实 施方式的发光试样摄像方法和发光试样摄像装置时，通过采用独自研究的 明亮的开口数的物镜，可以在明显短于以往的时间(例如30分之一以下的 所需时间)内生成发光图像，因此可以实现5 20分钟单位、优选条件是小 于5分钟、最短约1分钟单位的微弱光图像所产生的时间序列评价。这对 于以往肉眼可见亮度的荧光图像，提供了能够代替或联合肉眼不可见的发 光图像、也可以用于高速反应或生物分子的动态解析的划时代技术。获得 发光图像时由于不需要激发光，因此昼夜节律那样的感光性试验是当然的， 而且消除对生物材料的过度刺激或损害，实现准确且长期稳定的解析。在 再生医疗中，通过利用发光图像的解析，具有能够进行使用未受任何生物 学损害的生物材料的治疗、诊断、制药等医学利用的可能性。
但是，当预对多个细胞进行利用延时的摄像时，最初摄像的细胞和最 后摄像的细胞间有时产生显著的时间差。显著的时间差对于比较细胞之间时经常是致命的。另外，对于任意指定的多个细胞按照不产生时间差的方 式进行摄像的有效方法是未知的。以往，仅仅知道按照对多个细胞依次进 行摄像的方式手动地改变摄像间隔， 一旦错误操作立即停止，并再次试行 的对应。特别是，如近来的基于细胞的分析那样，在自动解析多个细胞的 系统中，当使用利用延时的图像时，有通量剧减的可能性。
以下说明鉴于以上事实为了高效地进行延时的摄像操作而改良本实施 方式的方法和装置的应用例。另外，以下说明的高通量摄像装置和用于其 的软件是基于本实施方式的主旨具有进一步专利性的优异发明。这里，以 下所示实施方式的目的在于可以提供同时期地从大量摄像对象获得延时数 据的高通量摄像装置和用于其的软件。
关于用于解决课题的高通量摄像装置的机构
为了达成上述目的，本实施方式的高通量摄像装置的特征在于，其具 备用于对存在于多个摄像区域的生物学试样进行摄像以获取试样图像的 图像获取机构；和用于控制所述图像获取机构以在每个上述摄像区域进行 延时间隔摄像的控制机构，其中，所述控制机构具有间隔摄像条件设定机 构，该间隔摄像条件设定机构用于基于所述试样图像获取所必需的摄像时 间和所述摄像区域的个数来设定间隔摄像的条件。作为间隔摄像的条件的 一例，还包括根据生物学试样的活性速度或反应速度来改变作为延时条件 的摄像时间。根据本实施方式的高通量摄像装置，可以从1分钟 20分钟 的曝光时间或更长时间中选择适当的曝光时间。对于反应(或活性)速度 快的试样，可以在获得能够图像解析水平的发光图像的范围内设定最小的 曝光时间。相反，对于反应(或活性)速度慢的试样，可以以图像容量不 会过剩的程度设定长的曝光时间。优选在相同或不同的摄像视野中，通过
设定多个阶段的曝光时间(例如选自l分钟、5分钟、IO分钟、20分钟、 30分钟中的2个以上任意组合的阶段)或连续的时间范围(例如1~30分 钟的曝光时间中，以1 3分钟单位的分隔刻度或无阶段地选择的任意曝光 时间)，可以执行每个试样或试样中每个区域(或部位)的图像解析。进而， 在反应(或活性)的速度不同的发光图像中，通过控制图像再生机构的再 生速度，可以模拟地提供相似速度所产生的动态映像，使诊断等评价变得 简单且高效，在每个试样具有非特异性偏差时也可以进行准确的解析，因此还具有快速获得最终评价结果的优点。另外，可以在每个试样获得能够 进行图像解析水平的发光图像的范围内设定最小的曝光时间，也有助于解 析时间的縮短，并提高通量。曝光时间的选择可以自动进行，也可以手动 进行。
另外，本实施方式的高通量摄像装置的特征在于，其具备用于通过 提取不同图像相关信息的图像信息提取机构对存在于多个摄像区域的生物 学试样进行摄像以获取试样图像的图像获取机构；和用于控制上述图像获
取机构以在每个上述摄像区域进行延时间隔摄像的控制机构，其中，所述 控制机构具有间隔摄像条件设定机构，该间隔摄像条件设定机构用于基于 所述试样图像获取所必需的摄像时间和所述摄像信息提取机构的种类来设 定间隔摄像的条件。在这种构成中，由于可以根据由控制机构设定的摄像 条件来高效地执行摄像的操作，因此也可以在短时间内对大量摄像区域进 行摄像。
本实施方式中的"生物学试样"可以将所有生命体作为对象，通过将 所关心的生物学活性以能够维持的状态保持在作为适当保持机构的容器或 生命体中，可以对摄像机构提供预摄像的摄像区域。这里，容器包括以能 够用所需摄像机构摄像的状态保持试样的所有收容体，具体地可以举出孔、 培养皿、玻片腔室、比色杯。另夕卜，生命体可以举出植物、哺乳类、鱼类、 昆虫类、细菌、病毒。在生命体维持生命的状态下，当根据需要将生命体 的一部分处置为能够摄像的状态，并利用适当的摄像机构可以接近生命体 的摄像区域时，生物学试样被保持于生命体中。作为生物学试样，包括生 命体来源的所有部分，但优选为生物学细胞，更优选为可胚胎学地分裂或 增殖的有核细胞。对于构建细胞分离成不同功能的多个器官的生命体，还 可以是显示所关心生物学活性的任意器官。作为生物学活性，可以为生理 学、遗传学、免疫学、生化学、血液学活性中的l种以上的活性。"多个摄 像区域"为保持在同一保持机构的1个以上的生物学试样，或者是分别保 持在不同保持机构的1种以上的被摄像部位。
关于高通量摄像装置的效果
上述本实施方式的高通量摄像装置由于可以根据由控制机构设定的摄 像条件高效地执行摄像操作，因此可以在短时间内对多个摄像区域进行摄像。另外，即便是试样数非常多的情况下也可以同时期地获得大量延时数 据，因此对生物学活性有关的研究或临床有很大帮助。
作为本实施方式的第一实施例，参照图30进行说明。图30为表示本 实施方式装置的整体构成的概念图。培养显微镜主体ioic与培养细胞的培
养室和观察细胞的显微镜部分成为一体。培养显微镜主体ioic中的内部装
有控制器102C，进行后述各单元的控制。控制器102C为了使培养显微镜 的空间小型化而配置在培养显微镜主体101C内部，但也可以在受到控制器 102C的发热所导致的影响的情况下配置在培养显微镜主体IOIC外部。而 且，培养显微镜主体101C具备警告蜂鸣器103C和警告显示装置104C。警 告蜂鸣器103C可以在实验中发生任何问题时等发出警告音。另外，警告显 示装置104C与警告蜂鸣器103C同样，可以进行发生任何问题时的警告显 示或操作指示等的显示。特别是，警告显示装置104C具备作为操作面板发 挥作用的触摸面板104aC，操作者可以按照警告显示装置104C上显示的指 示，触摸触摸面板104aC来选择操作。
控制器102C连接于聚焦手柄操纵杆105C，通过聚焦手柄可以移动后 述显微镜部分的Z轴方向(即对试样聚焦的方向)，可以使用操纵杆移动R
台、e台。e台为可以在以轴为中心的旋转方向上移动的电动台，R台为可 以在与上述e台的中心轴垂直的i个轴方向上移动的电动台。它们为了使
装置尺寸小型化而使用，但也可以为一般的XY台。特别是，图31所示的 R台电动机30C和e台电动机31C基于由后述本实施方式装置的间隔摄像 条件设定机构所设定的条件，通过控制器102C被驱动控制。
培养显微镜主体101C在培养室内具有温度控制用的加热器112C，并 装备有控制加热器H2C的温度控制器106C。
控制器102C和温度控制器106C利用例如RS-232等接口连接于计算 机109C (图30中为个人电脑)，可以由计算机109C进行控制。另外，作 为接口，还包含必要的各机构(存储部、演算电路、显示部、输入部等)。
作为蓄积有供给至培养显微镜主体101C的培养室内的混合气体(分别 将温度、湿度和二氧化碳气体浓度控制在例如37°C、 95~100%和5%的混合 气体。另夕卜，各数值为一般的数值，可以调整)的罐107C如图所示处于外 部，通过电磁阀108C的开合，可以将混合气体供给至培养室内。本实施方式中，虽然在罐107C中放入混合气体，但也可以使罐107C仅为二氧化碳 气体，将用于维持湿度的未图示水槽设置在培养室内。另外，还可以在未
将罐107C维持在37"C的状态将二氧化碳气体供给至培养室内。电磁阀 108C可以通过计算机109C进行控制。
计算机109C连接于LAN、互联网等网络IIOC，进而网络110C连接 于远程计算机111C，可以介由网络110C从远程计算机111C (图30中为 个人电脑)控制计算机109C，因而可以从远程计算机111C监视在培养显 微镜主体101C中进行的延时间隔摄像，或可以大量蓄积摄像数据作为能够 检索的数据库，使计算机109C发挥功能。远程计算机111C的使用者也可 以是利害关系者，但为了顺利地继续复杂多方面的延时摄像的利用，优选 通过与进行系统运用的外部专业人员的业务协定来供应。另外，作为远程 计算机111C，如果是装置的现场(检察室、实验室等)以外的场所，也可 以是在退出室外时、回家时、出差时、休假时的任意时刻主要进行监视的 目的的便携型的图像接收机。根据便携型的远程计算机111C，调出所需的 图像，或在警告时利用蜂鸣器、灯、异常标记等把握异常的即时对应成为 可能。总之，在通过通信机构与装置主体IOIC连接的远程计算机111C中， 优选进行利用适当的认证机构(例如密码、负责人ID、电子锁、生物特征 识别(指纹、虹膜、静脉等))的进入限制。另外，如果是进行了适当认证 的进入者，则更优选通过远程计算机111C，可以按照改变间隔摄像条件的 方式进行远程控制。这样，远程计算机111C即便不在装置现场进行，也可 以进行监视或一部分的操作，因此提供大幅度减轻使用者负担(例如工时 数、经费、移动时间)的优异利用系统。
图31为本实施方式的培养显微镜主体101C的内部构成图。培养室20C 通过盖子22C从外部密闭，将其内部培养环境的温度和湿度和二氧化碳 (C02)浓度保持在恒定或积极地控制。混合气体介由气体配管24C从罐 107C供给。不需要的气体从未图示的配管中被废弃。盖子22C以铰链23C 为轴利用把手21C能够开合。当盖子22C打开时，则盖子开合传感器28C 工作，对于控制器102C,可以了解盖子22C的开合。
加热器112C设定在培养室20C内部，利用未图示的温度传感器检测 达到规定温度(例如37°C)以下时，可以自动地工作以维持温度。图31仅记载了 1个加热器112C，但也可以安装在盖子22C和基底55C整体上， 以便减小培养室20C内的温度不均。
圆形托盘26C具有多个试样设置孔穴52C,在其中可以设置多个试样 容器25C。多个试样容器25C保持在作为装置主体搬送机构的保持台发挥 功能的圆形托盘26C上。本发明中，当在圆形托盘等搬送机构的板状保持 台的不同位置上保持多个试样容器时，也可称作"收容多个试样容器的基 板"。试样容器25C可以相对于圆形托盘26C沿上方向取出。当将试样容 器25C设置在圆形托盘26C上时，试样容器25C的底面接触于圆形托盘26C 的试样设置孔穴52C的环状突起51C，使得试样容器25C不会落至下方。 进而，可以按照试样容器25C能够在圆形托盘26C上定位的方式而设置。 试样容器25C的底面由透明的玻璃或树脂形成，可以从物镜33C观察。这 里，根据试样容器25C的材质或表面形状，优选使用使对应于摄像视野的 试样容器25C的底面中央附近或大致整个面成为凹口状态、在该部分上粘 贴透光性高且平滑地成形的玻璃等透光窗的改良型容器。
另外，为了防止水分从试样蒸发，还可以盖上覆盖试样容器25C程度 的适当的试样容器盖子57C。由于交换培养基时将试样容器25C从培养室 20C中取出，在试样容器25C很凉的状态下放回培养室20C时，盖在试样 容器25C上的试样容器盖子57C有结露的可能。试样容器盖子57C结露时， 按照能够交换该结露的试样容器盖子的方式，在培养室20C内设置保管预 备试样容器盖子57C的空间。放在保管空间的试样容器盖子57C在培养基 交换中也位于培养室内20C内，因此不会变凉。而且，试样容器25C例如 由玻璃等透明且可观察的底面部件和上面部件以及例如如金属那样的热容 量大的2个部件(部件A和部件B)形成，部件A通过粘接与底面部件固 定，上面部件与部件B粘接。部件A和部件B可以装卸。通过为这种构成， 可以防止上面部件和底面部件的结露。
圆形托盘26C可以从旋转底座34C上装卸，当卸下圆形托盘26C时， 圆形托盘装卸传感器27C工作，通知控制器102C圆形托盘26C卸下。圆 形托盘装卸传感器27C在图31中记为按钮式，但只要是能够检测圆形托盘 26C装卸的传感器即可，可以是任何传感器。另外，也作为试样台发挥功 能的该圆形托盘26C优选具备用于适当混合添加于试样容器25C内或所交换试剂等的规定溶液的混合机构(未图示)，利用该混合机构，在摇动或振 动(超声波振动或振荡)下使特定的试样容器25C内的液体无遗漏地遍布 容器内。
旋转底座34C安装在0旋转轴35C上，通过0台电动机31C的旋转， 可以使圆形托盘26C在规定旋转方向上每托盘间歇地旋转停止。该圆形托 盘26C的由旋转和停止构成的旋转周期基于由后述本实施方式的装置的间 隔摄像条件设定机构所设定的条件，通过控制器102C被驱动控制。作为旋 转周期的变形例，通过进行与配置在圆形托盘26C的同一圆周上的全部试 样容器25C的个数相比仅多或少1个托盘的旋转距离停止的旋转停止周期， 表观上可以成为每个试样容器间歇行进的停止，同时还可以在每次间歇移 动时使几乎全部试样容器25C每次转1周，在各周次移动中，还可以监视 各个试样容器25C的培养状态是否良好。
利用R台电动机30C，丝杆38C旋转，安装在螺母53C上的直线移动 底座36C左右地移动。在直线移动底座36C上具有直线导轨54C，可以仅 在直线方向上移动。0旋转轴35C以相对于直线移动底座36C能够旋转的 方式安装，当直线移动底座36C左右地移动时，可以使旋转底座34C也左
右地移动。由此，可以实现在Re极坐标系内能够移动试样的台。
底座55C分为培养室20C和电动机室58C，按照培养室20C内的高湿 气体不进入电动机室58C的方式将各部密闭。首先，在旋转底座34C和基 底55C之间的挟持平面状的片材50C，可以滑动。
皮腔56C按照将物镜33C露出至培养室内20内的部位包围的方式安 装，通过粘接等将其端面固定在物镜33C前端部分和基底55C上进行密闭。 由此，使得高湿气体不会从物镜55C和物镜33C的空隙进入电动机室58C 内。
物镜33C通过Z台电动机32C旋转丝杆39C而能够上下移动。通过物 镜33C上下移动，可以对试样聚焦。即便物镜33C上下移动，由于皮腔56C 由橡胶等柔软树脂形成，因此可以拉伸收縮，从而维持密闭。
显微镜室59C可以维持温度，达到温度变化不会导致光学体系部件膨 胀的程度。温度维持使用未图示的加热器等。
显微镜室59C中设置有控制器102C，连接有向各单元的配线。LED照明41C为荧光观察用的照明，介由荧光立方体42C经由通过窗40C、物 镜33C后照明试样。来自试样的光介由物镜33C、通过窗40C、荧光立方 体42C，通过倍率改变透镜43C，利用镜44C将光路弯曲90度，入射至 CCD相机45C。镜44C用于确保CCD相机45C的设置空间而安装，如果 有CCD相机45C的设置空间，则没有必要弯曲光路。
代替LED照明41C，还可以使用未图示的汞灯等光纤作为光源。为汞 灯时，不能如LED照明41C那样高速地进行开灯关灯，因此有必要安装光 闸以将光的入射进行开/关。这些也可以由控制器102C控制。另外，还有 不介由倍率改变透镜43C而入射至CCD相机45C的情况。BP，倍率改变 透镜43C可以适当插卸在从物镜33C向CCD相机45C延伸的光路上。
荧光立方体42C能够以轴48C为中心旋转，可以切换成波长不同的荧 光立方体。旋转可以通过立方体旋转台电动机47C的驱动而电动地进行。 这些也可以由控制器102C控制。
倍率改变透镜43C可以以轴49C为中心旋转，可以切换成倍率不同的 透镜。旋转可以通过透镜旋转台电动机46C的驱动而电动地进行。这些也 可以由控制器102C控制。该倍率改变透镜43C也可以是内置有变焦功能 的1个连续变焦距镜头。另外，根据需要，还可以是仅交换成所需倍率等 式样的透镜的构成。
图32为图30、图31所记载的单元，以模块图表示通过电的方法等而 能够控制的单元。对于图30和图31所说明的各单元的说明省略，但各单 元连接在控制器102C上，由计算机(个人电脑)109C的使用者界面，观 察者可以控制。CCD相机45C使用利用了冷却CCD的高感度型，直接连 接于计算机109C。加热器112C介由温度控制器106C连接于计算机109C， 但温度控制器106C的功能处于控制器102C时，也可以介由控制器102C 来控制加热器112C。
作为图32的特征构成，在从外部控制装置主体101C内部功能的外部 控制体系60中，对设置的各试样容器25的有关摄像条件进行设定的间隔 摄像条件设定机构70C介由计算机109C连接于控制器102C。另外，控制 器102C为了对作为摄像机构的CCD相机45C的摄像动作也进行驱动控制 而连接也是特征之一。由此，可以将计算机109C所附带的输入机构或显示
92机构等含有各种接口的外部控制体系60C、间隔摄像条件设定机构70C、
作为内部控制体系的控制器102C、作为摄像机构的CCD相机45C、用于 保持各试样容器25C的圆形托盘26C的各种电动机30C和31C进行联合。
这里，说明利用间隔摄像条件设定机构70C进行的设定内容。该间隔 摄像条件设定机构70C提供对应于以下所示所有情况下的假设的装置。
装置1:高通量摄像装置，其特征在于，其具备用于对存在于多个 摄像区域的生物学试样进行摄像以获取试样图像的图像获取机构；和用于 控制所述图像获取机构以在每个所述摄像区域进行延时间隔摄像的控制机 构，其中，所述控制机构具有间隔摄像条件设定机构，该间隔摄像条件设 定机构用于基于所述试样图像获取所必需的摄像时间和所述摄像区域的数 量来设定每个所述摄像区域的间隔摄像的条件。
装置2:根据装置1所述的高通量摄像装置，其特征在于，所述间隔
摄像的条件具有对多个摄像区域进行多次切换并摄像的设定。
装置3:根据装置2所述的高通量摄像装置，其特征在于，在每个摄 像区域上，将由所述图像获取机构送出的图像信号进行累积而生成图像。
装置4:根据装置1所述的高通量摄像装置，其特征在于，所述间隔 摄像的条件除了摄像所必需的时间以外，还包括用于进行其它处理的剩余 时间。
装置5:根据装置4所述的高通量摄像装置，其特征在于，其具备 用于将所述摄像区域维持为能够利用所述图像获取机构进行摄像的光环境 而进行与外部的遮光的遮光机构；和用于暂时解除所述遮光机构产生的光
环境并进行利用所述图像获取机构进行的摄像以外的处理的处理机构。
装置6:根据装置1 5任一项所述的高通量摄像装置，其特征在于，
其具备使所述图像获取机构相对于所述多个摄像区域相对地移动的移动机 构。
装置7:根据装置6所述的高通量摄像装置，其特征在于，其在将多
个生物学试样沿着圆形托盘的圆周依次配置的同时，能够根据所述控制机 构的摄像条件使该圆形托盘旋转和停止。
装置8:根据装置7所述的高通量摄像装置，其特征在于，其构成为 使所述圆形托盘的旋转周期通过多个摄像区域后停止。装置9:根据装置8所述的高通量摄像装置，其特征在于，所述圆形 托盘的旋转周期具有1个旋转±1个摄像区域的长距离旋转模式。
装置10:根据装置9所述的高通量摄像装置，其特征在于，其具备在 所述长距离旋转模式的长距离旋转中获取有关上述圆形托盘上全部摄像区 域的其它参考信息的参考信息获取机构。
装置lh根据装置1 4任一项所述的高通量摄像装置，其特征在于， 所述图像获取机构具备能够改变摄像时的摄像倍率的摄像倍率改变机构， 并根据利用所述摄像倍率改变机构改变的摄像倍率来设定间隔摄像条件。
装置12:根据装置1 4任一项所述的高通量摄像装置，其特征在于，
所述图像获取机构具备接收由摄像区域获得的光信号的受光元件，并根据 受光元件的受光能力来设定间隔摄像条件。
装置13:高通量摄像装置，其特征在于，其具备用于利用提取不同 图像相关信息的图像信息提取机构对存在于多个摄像区域的生物学试样进 行摄像以获取试样图像的图像获取机构；和用于控制所述图像获取机构以 在每个所述摄像区域进行延时间隔摄像的控制机构，其中，所述控制机构 具有间隔摄像条件设定机构，该间隔摄像条件设定机构用于基于所述试样 图像获取所必需的摄像时间和所述图像信息提取机构的种类来设定每个所 述摄像区域的间隔摄像的条件。
装置14:根据装置13所述的高通量摄像装置，其特征在于，所述图 像信息提取机构对同一摄像区域同时或连续地提取不同的图像相关信息。
装置15:根据装置14所述的高通量摄像装置，其特征在于，其具有 将由所述图像信息提取机构提取的不同图像相关信息对应于摄像区域上的 试样并进行合成的图像合成机构。
装置16:根据装置13 16任一项所述的高通量摄像装置，其特征在于，
所述图像信息提取机构为透射光、荧光、生物发光、化学发光、拉曼分光、
红外线中的2组以上的组合。
装置17:根据装置1 16任一项所述的高通量摄像装置，其特征在于，
其具备用于继续培养所述生物学试样中的细胞的培养机构，所述控制机构 根据有关存在于多个摄像区域的细胞的各培养期间中的摄像时期来设定间 隔摄像条件。有关安置在各试样设置孔穴52C的试样容器25C的试样信息存储在内 置于计算机109C的存储器中，调出延时的间隔摄像条件的设定时间，确定 摄像条件，执行利用控制器102C的摄像。有关所确定的摄像条件的信息介 由控制器102C通知计算机109C，与试样信息相对应，存储在计算机109C 的存储器中，同时可以适当显示在使用者界面上。
计算机109C的使用者界面上带有圆形托盘26的试样容器25C的分别 的ID，通过该ID进行编程，以使得摄像装置和圆形托盘的动作相对应。 使用者界面的输入机构(光学鼠标、键盘、触摸面板、电子笔等)按照基 于使用者对每个所述ID选择的信息来设定摄像条件的方式，来促发计算机 109C。
在通过以下各步骤表示的一系列工序中，首先为观察准备状态，显示 GUI (SI)的同时，执行台原点输出(S2)。这里，在能够输入使用者想要 观察的试样容器而成为等待输入(S3)后，优选按下GUI的处于"Stage/R6" 和"Stage/Z"的各方向箭头按钮，作为实况图像窗口表示试样容器25C内的 细胞图像，同时寻找希望延时摄像的细胞，通过输入机构在显示画面上选 择位置。S卩，在该例子中，最初在显示上述明视野图像和/或发光图像的基 础上可以指定所需的细胞、细胞群、组织区域、甚至细胞中的特定部位。 优选在任意的摄像时期内，即便在延时摄像的过程中，也可以显示当前的 摄像结果或解析结果。为此，更优选执行进行迅速输出结果的控制，以使 得可以逐次解析延时摄像的持续中所获得的发光图像。
接着，成为所选观察位置相关的观察条件的等待状态(S4)，使用者输 入所需的观察条件(S5)。输入中，与上述同样地输入例如符合要求的观察 条件(例如根据所用试剂的种类或实验条件的微弱发光的波长、检测感度、 明视野观察的亮度等)。另外，如图31所示，在并用荧光测定的例子中， 例如选择使用LED-G (绿色)和LED-B (蓝色)中的任一者，或确定LED 照明41C的亮度。另外，使用GUI的"Cube"按钮，选择对应所选波长的荧 光立方体，或使用"Lens"按钮确定对应序号按钮的倍率改变透镜。而且， 使用GUI的"Camera Control"按钮，确定CCD相机的曝光时间或是否执行 AE等相机的摄像条件。使用"Image File Name"按钮，确定保存摄像后图 像的文件名，使用"Time-lapse"按钮，全部设定必要的参数作为延时的间隔时间或实验期间的设定等观察条件。这里，延时的间隔时间是指进行多 点延时(也包括仅1个点的情况)时的用于摄像第1次多点的电动台移动 时间、摄像时间和控制时间、开始摄像上述多点的第2次之前的待机时间 的总和。
接着，存储所输入的摄像条件(S6)时，例如当台的移动时间或相机 曝光时间的总时间长于延时的间隔时间时，由于不能准确地进行延时间隔 摄像，因此计算机进行延时的间隔时间的再设定或摄像时间的再设定，可 以无遗漏地对所需数量的摄像区域进行摄像。例如，通过点击GUI的自动 调整按钮，可以自动地求出比台移动时间、相机曝光时间的总时间多少长 一些的时间，将其作为延时的间隔时间进行设定。另外，通过使待机时间 接近零，可以切换成具有连续性的延时摄像。这样，当特定观察位置的设
定结束时(S7)，观察准备结束，成为可以开始摄像的状态。另外，在中止
输入条件的存储而想要重新输入时或者想要进行其它观察位置的设定时，
返回至S3，重复输入。
如上所述，根据该例所示的多点延时，可以对所需各个观察对象在高 通量且适当的摄像条件下无遗漏地自动观察。
以上，在上述例子中说明了还兼用荧光显微镜的例子，但本实施方式 也可以专用地对发光图像进行摄像，此时，由于不需要照射激发光，因此 可以除去照射光学体系。还可以将荧光标记了的细胞等的观察与发光标记 了的细胞等的图像同时或分别地进行观察。发光标记的例子可以举出发出 即使在显微镜下也肉眼不可见的微弱光的生物发光(或化学发光)。
作为生物发光(或化学发光)的例子，作为连接于特定的所关注的基 因区域的启动子下游的报告基因，可以举出导入含有荧光素酶基因的DNA 的细胞或组织。通过使用使荧光素酶作为报告分子表达的细胞或组织，通 过检测所需表达部位的荧光素酶活性，可以实时地检测转录的经时变化。
优选的方式为按照导入的发光基因在末梢组织中具有昼夜节律的方式 而表达的脊椎动物来源的细胞或组织。末梢组织包括肝脏、肺和骨骼肌肉， 但并非局限于这些。据报告，这些末梢组织具有7 12小时的相位差，刻画 出昼夜节律。显示昼夜节律的延迟模式被认为是反映了由多器官构成的复 杂哺乳动物的生物节律的正常协调性。
96由此，通过本实施方式解析的信息由于阐明了与昼夜节律有关的时差 模糊或睡眠障碍的机理，并开发了对昼夜节律障碍的治疗有效的化合物的 筛选和以试验为目的使用的哺乳动物模型，因此是有用的。
另外，当使用含有表达报告基因的本实施方式的DNA的转化体或转基 因哺乳动物时，可以进行各种试验或筛选。在各种任意条件下，通过检测 这些组织或细胞中报告基因的表达，可以评价调节报告基因表达的刺激或 化合物的效果、或者对它们进行筛选。刺激包括温度、光、运动和其它刺 激。所用化合物并无限制。本实施方式特别可以适于将改变通过导入至本
实施方式的转化体或转基因哺乳动物中的时钟基因(例如Period 1)的启动
子所诱导的表达的化合物使用其转化体或转基因哺乳动物进行试验或筛选 的方法中。
本实施方式中测定的器官并无特别限定，包括包含下丘脑的视交叉上
核(SCD)的中枢神经系统(CNS)和末梢神经系统(PNS)以及非限制地 含有肝脏、肺和骨骼肌肉的其它末梢组织。更具体地说，用于评价SCN和 末梢组织的时钟基因"Period 1"的表达的相位关系和同步机理是有用的。 这里，利用本实施方式的发光显微镜以连续或间断地获取每个不同所需经 过时间的微弱光图像时，基于总括地解析1个以上同一细胞的相关各时间 的光强度而得到的解析数据，例如可以总括地评价时间基因的活性模式或 药剂等导致的细胞内物质的响应模式。另外，在所识别的细胞中，通过不 对未显示规定光强度或光分布的细胞进行总括地评价，除了非预解析的细 胞之外，可以实施准确的评价。另外，通过求出图像解析的全部细胞的光 强度的合计值或平均值，除了各个细胞的评价之外，还可以实施解析的细 胞整体的评价。另外，通过将图像解析的2个以上的细胞基于其光强度和/ 光强度模式而分类为同一或不同的细胞群，可以按每个解析模式评价时间 基因的活性。根据情况不同，可以对模式不同的每个细胞研究时间基因的 活性度或活性变化的详细情况。根据本实施方式，关于时钟基因的表达模 式的周期性波形形状(振幅长、周期宽度等)或波形强度(表达量、活性 速度等)等变动参数，可以以多种组合进行解析。时钟基因的表达模式的 周期性波形解析的结果由于会带来对诊断、治疗、生育(或生物胚胎学) 等研究用途或者产业上(医学、农产等)用途重要的信息，因此本实施方式所发挥的作用很大。
另外，本实施方式的装置的特征在于，其具备以能够获取图像的状 态保持含有大量细胞的生物学试样的保持机构；将与从上述生物学试样发 出的微弱发光相关的光学数据进行蓄积以获得能够图像解析的图像信息的 微弱光图像获取机构；和用于形态地解析所述图像信息以识别各个细胞、 并总括地评价与所识别细胞相关的微弱光的光强度的图像解析机构。这里， 通过将上述保持机构制成以能够地址化的方式保持将多个孔一体化而成的 板的构成，上述图像解析机构由于可在同一视野内或以规定顺序进行多个 孔间的所述评价，因此本实施方式的装置可以对不同试样或者不同药剂等 所产生的活性评价的结果进行比较或使它们相关。此时，还可以将上述保 持机构制成以能够地址化的方式保持多个独立容器的构成，由此，上述图 像解析机构并非限定于所述微弱光图像获取机构的视野，可对多个容器进 行上述评价。另外，本实施方式的装置具有按照对应于获取图像信息的时 刻进行上述评价的方式进行控制的控制机构，由此可以进行每个经过时间 的同一细胞的相关解析、显示特定活性的不同时间之间的细胞(同一或不 同细胞)的比较解析等多种时间解析。另外，本实施方式的装置通过进一 步具有使利用上述图像解析机构的解析结果与图像信息相关联并进行显示 的显示机构，可以显示从解析结果中对应于想作为图像观察到的解析结果 的图像。另外，上述显示机构通过具有动态显示所需图像信息的构成，从 而本实施方式的装置可以以实时的映像观察1个以上所需细胞的相关活性 变化。作为动画显示，更优选利用图像处理重叠同一细胞的每个时间的微 弱光图像以提高亲临现场感。另外，作为动画显示，可以以慢镜头回放将 同一细胞相关的时间序列的多个图像并列(或者也可以是仅偏离一部分) 显示，也可以将各时间的图像全貌化。
另外，本发明中，可以将用于获得透射光(明视野)图像的照明光替 换成用于诱导荧光图像的激发光。此时，作为照明图像的摄像，可以说明 对作为照明光的激发光的照明后所诱导的荧光图像进行摄像的工序。
另外，根据本实施方式，还包括以下所示本实施方式的微弱光摄像方 法和/或摄像装置的进一步的样态或应用例，以及用于摄像装置的软件的实 施方式。样态l:具备上述摄像装置的生物检查机(例如内窥镜、CT扫描测定机)。
样态2:具备上述摄像装置的分析装置(例如亮度计、细胞仪)。 样态3:具备上述摄像装置的生物芯片制造装置。 样态4:利用上述微弱光摄像方法的图像数据的解析服务。 样态5:利用上述微弱光摄像方法的图像信息的管理系统。 样态6:微弱光多成像方法，其是在上述微弱光摄像方法中，配置与 对应于2种(或3种以上)波长的滤光器相连接的2台摄像用相机，禾,
光分离元件将来自试样的光线进行2等分(或3以上的n等分)，利用各相 机同时蓄积2种(或3种以上)的微弱光数据，从而获取完全同期的各波 长的微弱光图像。
样态7:微弱光多成像方法，其是在上述微弱光摄像方法中，利用对 应于2种(或3种以上)波长的光分离元件将来自试样的光线进行2等分 (或3以上的n等分)，分离后的各波长的光线分别成像在设定于同一 (或 不同)摄像元件(例如CCD)上的各波长的成像区域上，将整个成像区域 的2种(或3种以上)的微弱光数据同时地蓄积，从而获取完全同期的各 波长的微弱光图像。
样态8:用于执行上述样态6或样态7所述的微弱光多成像方法的摄 像装置。
软件1:用于高通量摄像装置的软件，其特征在于，在上述装置1 17 任一项所述的装置中，具有用于使上述控制机构和上述图像获取机构发挥 功能的程序，以使得执行利用所设定的间隔摄像条件的间隔摄像。
软件2:用于执行上述样态1 8任一项所述的装置、服务或系统的软件。
另外，根据本发明，也可以理解为包含以下附注项所述的发明。 附注项1B:生物试样的摄像方法，其特征在于，将由高开口数(NA)
和放大倍率决定的光学条件与预适用的方法或装置相联合，将与利用微弱
光的摄像的联合最优化。
附注项2B:上述附注项1B所述的生物试样的摄像方法，其特征在于，
所述摄像包括进行间隔条件的设定的工序，在不同时间内获取多个有关生物试样的多个图像。
附注项3B:摄像装置，其特征在于，其使用附注项1B或2B所记载 的生物试样的摄像方法。
附注项4B:附注项3B所述的摄像装置，其特征在于，按照与用于解
析发生微弱光的细胞的软件相联合的方式来控制。
附注项5B:附注项1B或2B所述的生物试样的摄像方法，其特征在
于，其包括含有适当改良或变形例的样态。
附注项6B:附注项3B或4B所述的摄像装置，其特征在于，其包括 含有适当改良或变形例的样态。
权利要求
1. 生物试样摄像方法，其为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板的所述收容部中的发出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像方法，其特征在于，移动所述基板和/或所述物镜直至所需的所述收容部进入所述物镜的视野内，测量所述物镜的近点侧焦点位置和/或所述物镜的远点侧所述焦点位置，基于所测量的所述焦点位置，确定与收容在所述所需的所述收容部中的所述生物试样内的观察对象部位对准的所述物镜的所述焦点位置，使所述物镜的所述焦点位置对准所确定的所述焦点位置，并介由所述物镜对所述生物试样进行摄像。
2. 根据权利要求l所述的生物试样摄像方法，其特征在于，在移动所述基板和/或所述物镜直至所述所需的所述收容部进入所述物镜的视野内 时，测量所述基板和/或所述物镜的移动到达地的位置，使有关所测量的所 述移动到达地的所述位置的移动到达地位置信息与用于识别所述所需的所 述收容部的收容部识别信息相关联，并进行存储。
3. 生物试样摄像方法，其为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板 的所述收容部中的发出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像方法，其特征在于，包括下述步骤移动步骤，其移动所述基板和/或所述物镜直至所需的所述收容部进入所述物镜的视野内；光照射步骤，其向所述生物试样照射光；焦点位置改变步骤；其改变所述物镜的焦点位置；焦点位置测量步骤，其对所述焦点位置改变步骤中改变了的焦点位置 进行测量；光照射试样摄像步骤，其在所述焦点位置改变步骤中改变了的焦点位 置处，对所述光照射步骤中照射光后的所述生物试样进行摄像；特征量计算步骤，其基于所述光照射试样摄像步骤中摄像得到的摄像 图像，计算使该摄像图像带有特征的特征量；执行步骤，其反复执行所述焦点位置改变步骤、所述焦点位置测量步 骤、所述光照射试样摄像步骤和所述特征量计算步骤；焦点位置选择步骤，其基于所述执行后蓄积的多个所述特征量，由执行所述执行步骤后蓄积的多个所述焦点位置中选择至少1个所述焦点位置； 焦点位置确定步骤，其基于在所述焦点位置选择步骤中选出的所述焦点位置，确定与收容在所述所需的所述收容部中的所述生物试样内的观察对象部位对准的所述物镜的所述焦点位置；焦点位置对准步骤，其使所述物镜的所述焦点位置对准所述焦点位置确定步骤中确定的所述焦点位置；以及，发光图像获取步骤，其介由所述物镜对所述生物试样进行摄像，从而获取该生物试样的发光图像。
4. 根据权利要求3所述的生物试样摄像方法，其特征在于，所述移动 步骤中，移动所述基板和/或所述物镜直至所述所需的所述收容部进入所述 物镜的视野内，测量所述基板和/或所述物镜的移动到达地的位置，使有关 所测量的所述移动到达地的所述位置的移动到达地位置信息与用于识别所 述所需的所述收容部的收容部识别信息相关联，并进行存储。
5. 生物试样摄像装置，其为介由物镜对收容在具有多个收容部的基板 的所述收容部中的发出微弱光的生物试样进行摄像的生物试样摄像装置， 其特征在于，具备下述机构移动机构，其用于移动所述基板和/或所述物镜直至所需的所述收容部 进入所述物镜的视野内；光照射机构，其用于向所述试样照射光；焦点位置改变机构，其用于改变所述物镜的焦点位置；焦点位置测量机构，其用于测量所述物镜的所述焦点位置；试样摄像机构，其用于对所述生物试样进行摄像；特征量计算机构，其用于基于用所述试样摄像机构摄像得到的摄像图 像来计算使该摄像图像带有特征的特征量；控制机构，其用于按照使所述焦点位置改变机构、所述焦点位置测量机构、所述试样摄像机构和所述特征量计算机构反复执行的方式来控制各个机构；焦点位置选择机构，其用于基于通过所述反复执行而蓄积的多个所述 特征量，从通过用所述控制机构使所述各机构反复执行而蓄积的多个所述焦点位置中选择至少l个所述焦点位置；以及，焦点位置确定机构，其用于基于用所述焦点位置选择机构选出的所述 焦点位置来确定与收容在所述所需的所述收容部中的所述生物试样内的观 察对象部位对准的所述物镜的所述焦点位置。
6.根据权利要求5所述的生物试样摄像装置，其特征在于，其进一步 具备移动到达地位置测量机构，其用于测量用所述移动机构移动所述基板和/或所述物镜时该基板和/或该物镜的移动到达地的位置；和存储机构，其用于使有关用所述移动到达地位置测量机构测量的所述 移动到达地的所述位置的移动到达地位置信息与用于识别所述所需的所述 收容部的收容部识别信息相关联并进行存储。
全文摘要
本发明的目的在于提供迅速且准确地对发出微弱光的生物试样进行图像解析的微弱光图像的解析方法等。本发明的特征在于，在对发出微弱光的生物试样进行图像解析时，对生物试样的预解析对象部位使用与所述微弱光不同种类的电磁能以确定与所述对象部位相关的至少一个基准位置，确定相对于所述基准位置的对应于所述对象部位的微弱光用焦点位置，瞄准所确定的焦点位置，执行利用所述微弱光的图像化，从微弱光图像中提取必要的测定参数的数值，基于所提取的参数数值，进行对象部位的评价。
文档编号H04N5/225GK101438147SQ20078001635
公开日2009年5月20日 申请日期2007年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者南波昭宏, 铃木浩文 申请人:奥林巴斯株式会社