一种卷萼兜兰组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养研究领域，具体涉及一种卷萼兜兰组培快繁方法。
【背景技术】
[0002]卷萼5?兰(Paph1pedilumappletonianum (Gower)Rolfe)属兰科5?兰属，是多年生草本植物，主要分布于我国海南省、广西省南部，越南、老挝、柬埔寨和泰国也有分布，生于海拔300-1200米的林下阴湿、酸性砂岩面的腐叶土上，在12?30°C温度范围内均能生长。卷萼兜兰叶片矩圆状椭圆形，上面有深浅绿色相间的网格斑，花形奇特，花色美丽，花期长，养护管理简单，颇受消费者喜爱，具有极高的观赏价值和较高的经济价值，是发展盆栽花卉产业的新兴品种，也是优良的育种亲本，市场需求潜力巨大。
[0003]目前，兜兰属所有野生种类都被列为国家一级保护植物，卷萼兜兰的野生资源由于连年过量采挖和环境破坏，种群数量逐年减少，亟待采取保护措施，以保护其种质资源和野生种群。卷萼兜兰一般采用分株繁殖和种子繁殖的方法，但存在繁殖系数低、成活率不高等问题，利用组培方法可有效保护野生资源，但至今卷萼兜兰的组培快繁技术并未获得成功，从而制约了其规模化商业生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，利用植物组培快繁的方法获得大量优质卷萼兜兰种苗，采用的技术方案如下:
1.一种卷萼兜兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)外植体灭菌:人工授粉130d后，采集未开裂、饱满的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌20s，0.1%升萊灭菌lOmin，无菌水冲洗6次，再用0.1%升萊第二次灭菌3min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干表面水分；
(2)种子萌发培养:将灭菌后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，光照培养40?45d，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为VW+6-BA0.1?
0.3mg/L+NAA0.1 ?0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培养:将原球茎转接到增殖培养基，光照培养55?60d得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为:l/2MS+6-BAl.0 ?2.5mg/L+NAA0.5 ?0.8mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培养:将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，光照培养45?55d得到具有2?3片叶的小苗，所述的分化培养基为:l/2MS+6-BA0.2?0.5mg/L+NAA0.6?0.9mg/L+KT0.4 ?0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培养:将小苗转入生根培养基，光照培养55?60d得到高4?5cm的试管苗，所述的生根培养基为:1/2MS+IBA0.2 ?0.5mg/L+NAA0.8 ?1.0mg/L+ 蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(6)炼苗移栽:挑选生长健壮、根系长至2?3cm的试管苗，带瓶移至常温、无直射光环境下，炼苗10?15d，取出试管苗，用清水洗净培养基，移栽到苗床基质中，环境要求通风良好，遮光70%?75%，空气相对湿度75%?80%，温度15?28°C，15?20d试管苗即可成活；
2.前述的一种卷叶兜兰组培快繁方法，其特征在于，步骤(6)所述的苗床基质铺设方法为:苗床下层铺5?7cm厚的粗砂，上层铺8?1cm厚的腐叶土。
[0005]本发明的有益效果体现在:实现了卷萼兜兰的组织培养和快速稳定繁殖，得到的再生植株性状稳定、苗齐、苗壮，丰面颊；分化率达80%以上，生根率达88%以上，移栽成活率达95%以上，能够进行大规模商品化育苗生产，对于这一珍贵野生种质资源的保护及其开发利用具有重要意义。
【具体实施方式】
[0006]实施例1
一种卷萼兜兰组培快繁方法，包括以下步骤:
(1)外植体灭菌:当卷萼兜兰的花冠刚展开时，去除唇瓣，将雄蕊上的花粉粒取下，涂到雌蕊柱头上完成人工授粉，授粉130d后，采集未开裂、饱满蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌20s，0.1%升萊灭菌lOmin，无菌水冲洗6次，再用0.1%升萊第二次灭菌3min，无菌水冲洗6次，吸干表面水分，备用；
(2)种子萌发培养:将灭菌后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，光照培养40?45d，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为VW+6-BA0.1mg/L+NAA0.lmg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培养:将原球茎转接到增殖培养基，光照培养55?60d得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为:l/2MS+6-BAl.0mg/L+NAA0.5mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培养:将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，光照培养45?55d得到具有2?3片叶的小苗，分化率为85%，所述的分化培养基为:l/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.6mg/L+KT0.4mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培养:将小苗转入生根培养基，光照培养55?60d得到高4?5cm的试管苗，生根率为92%，所述的生根培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.8mg/L+蛋白胨2.0g/L+AC1.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(6)炼苗移栽:挑选生长健壮、根系长至2?3cm的试管苗带瓶移至常温、无直射光条件下，炼苗10?15d，取出试管苗，用清水洗净培养基，移栽至苗床的腐叶土中，所用苗床下层铺有5?7cm厚的粗砂，有利于排水和透气，上层铺有8?1cm厚的腐叶土，卷萼兜兰为浅根性植物，根系垂直分布的深度范围是O?8cm，栽培环境要求通风良好，遮光70%?75%，空气相对湿度75%?80%，温度15?28 °C，15?20d试管苗即可成活，移栽成活率达98% ;
(7)培养室光照培养条件为:温度25±2°C，光照10?12h/d，光照强度1100?1400LX。
[0007]实施例2
一种卷萼兜兰组培快繁方法，包括以下步骤:
(I)外植体灭菌:人工授粉130d后，采集未开裂、饱满的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌20s，0.1%升萊灭菌lOmin，无菌水冲洗6次，再用0.1%升萊第二次灭菌3min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干表面水分；
(2)种子萌发培养:将灭菌后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，光照培养40?45d，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为VW+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
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