miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miR-375在斜纹夜蛾防治中的应用，具体涉及miR-375-3p抑制斜纹夜 蛾抗植物毒素机制从而达到高效杀虫这一功能，从而围绕miR-375-3p开展转基因或抑制 剂研发，达到高效害虫防治的目的。
【背景技术】
[0002] microRNA(miRNA)为20世纪90年代发现的一类内源性的非编码RNA(LeeRC， FeinbaumRL，AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin_4encodessmall RNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell, 1993， 75(5): 843-54.)，约 22个核苷酸。它们的生物合成由RNA聚合酶II(RNApolymeraseII，polII)转录，形成 长度为几百甚至上千个碱基的初级转录本（pri-miRNA)，其中pri-miRNA的5'端具有帽子 结构和P〇ly(A)尾巴。pri-miRNA于细胞核内在RNaseIII的作用下，被剪切生成miRNA前 体（pre-miRNA)。前体miRNA通过Ran-GTP介导的exportin_5蛋白转运到细胞质中（Bartel DP.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell, 2004,Vol. 116 (2) : 281-297)。在RNaseIII/Dicer复合体的作用下，pre-miRNA被剪切成两个不 完全配对的miRNA和miRNA* (miRNA*就是与miRNA不完全互补配对的序列）。最后在解旋 酶的作用下miRNA/miRNA*复合体解旋形成成熟单链的miRNA。成熟的miRNA会与沉默复合 体（RISC)结合，而剩下的miRNA*在细胞质中被RNase所降解。
[0003]miRNA作用机制主要包括两点：抑制翻译和降解mRNA。miRNA与靶mRNA的3'UTR 不完全互补配对进而破坏靶基因mRNA转录本的稳定性，从而达到抑制核糖体翻译的目的。 而降解作用则是通过加速革EmRNA中的多聚腺苷酸尾巴（poly(A)tail)去腺苷酸化，使mRNA 的结构被破坏，导致mRNA失去保护而迅速被核酸外切酶降解。就目前研究而言，miRNA对靶 基因mRNA的翻译抑制和对靶基因mRNA的加速降解是两个相互独立的机制，不仅如此，这两 个不同的机制所产生的结果也有明显的区别：miRNA对mRNA的降解是一个不可逆的过程， 一旦被降解就彻底地消失了；但是，miRNA对mRNA翻译的抑制却是可以被解除的调控(Wu L,FanJ,BelascoJG.MicroRNAsdirectrapiddeadenylationofmRNA.ProcNatl AcadSciUSA, 2006,Vol. 103(11): 4034-4039. )〇
[0004] 大量的研究工作表明，miRNA具有调控生物体生长和发育，细胞分化和凋亡，激素 的分泌和信号的传导以及应答各种胁迫。但是在昆虫与植物关系中的重要miRNA仍没见有 报道。斜纹夜蛾是一种杂食性昆虫，可以进食290多种植物，对农业生产影响很大，研究调 控其进食植物的重要miRNA对发展害虫防治新靶标有着重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供昆虫miR-375-3p在制备杀虫剂中的应用。
[0006] 本发明所采取的技术方案是： 昆虫类miR-375-3p在制备杀虫剂中的应用。
[0007] 进一步的，上述昆虫为鳞翅目昆虫。
[0008] 进一步的，上述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二 化螟。
[0009] 进一步的，上述昆虫类miR-375-3p的序列如SEQIDN0 :1所示。
[0010] 本发明的有益效果是： 本发明发现斜纹夜蛾类miR-375-3p可有效防治斜纹夜蛾，该序列在别的鳞翅目昆虫 内也存在，高度保守，因此也可用于防治其他害虫。
[0011] 本发明发现斜纹夜蛾miR-375-3p可用于任何鳞翅目昆虫的害虫防治，同理，任何 鳞翅目昆虫的miR-375-3p皆可用于其他同类昆虫的害虫防治。
【附图说明】
[0012] 图1为注射miR-375_3p后斜纹夜蛾幼虫的生长情况； 图2为qRT-PCR分别检测进食芥菜和人工培养基后斜纹夜蛾中肠miR-375_3p的表达 水平，CK代表培养基对照，B.juncea为芥菜； 图3为qRT-PCR检测进食培养基斜纹夜蛾不同组织中miR-375_3p的表达情况并与斜 纹夜蛾细胞株进行比较；FB:脂肪体；spli221 :斜纹夜蛾细胞株；mg:中肠；head:头部； EP:表皮； 图4为qRT-PCR检测相关基因的表达与miR-375_3p之间的关系； 图5为western检测注射了miR-375-3p斜纹夜蛾幼虫体内蛋白GSTE1的表达量；图中NC表示对照组，给幼虫体内注射的序列为SEQIDN0:2 ;375mimic表示处理组，给幼虫体内 注射的序列为SEQIDN0 :1 ; 图6为家蚕幼虫体内注射斜纹夜蛾miR-375-3p72h的表征；左边三条虫体为注射NC序列后的表型，右边三条虫为注射斜纹夜蛾miR-375-3p后的表型，其中间一条为死亡虫； 图7为不同物种的miR-375-3p序列比较；其中，序号1-13包括了人、哺乳动物和昆 虫；15-19为鳞翅目昆虫； 图8为不同物种miR-375-3p聚类图。
【具体实施方式】
[0013] 本发明将5龄大的斜纹夜蛾喂食其喜好的芥菜，然后提取其消化吸收主要场所中 肠的RNA，通过高通量测序分析，并与已有数据库数据进行比对分析，确定了有差异表达的 163个miRNA。对其中几个表达量显著下调的miRNA进行了人工序列合成，并注射入5龄 大的斜纹夜蛾，结果发现miR-375-3p显著抑制斜纹夜蛾的生长，注射后一天，昆虫死亡率 增加了约70%。表明MiR-375-3p对斜纹夜蛾防治的有效性。目前miR-375-3p在人类胰岛 素代谢，癌症，细胞凋亡等途径中都有报道参与调控，在昆虫中只有一篇报道，在蚊子吸血 后miR-375-3p表达上升。miR-375-3p通过抑制人类磷脂酰肌醇依赖性激酶1，从而抑制 膜岛素的分泌的（OuaamariA,BaroukhN,MartensGA,LebrunP,PipeleersD,van ObberghenE.miR-375targets3'-phosphoinositide-dependentproteinkinase-1 andregulatesglucose-inducedbiologicalresponsesinpancreaticbeta-cells. Diabetes. 2008, 57 (10) : 2708-17.)，但我们发现斜纹夜蛾miR-375-3p并不作用胰岛素分 泌过程的相关基因，而是作用一些免疫基因。
[0014] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0015] 实施例1 一、miR-375-3p处理影响斜纹夜蛾的生长 选取大小一致、健康状况一致的五龄第一天斜纹夜蛾幼虫，称量每只虫子的重量， 随机分为miR-375-3p处理组和NC对照组，每组40只，重复3次。顺血液循环流动方 向，用微量注射器从斜纹夜蛾幼虫的侧腹部第一和第二腹足之间，分别注射人工合成 的miR-375-3p，序列为 5'-UUUGUUCGCCCCGGCUCGAGUCG-3'（SEQIDN0:1)和NC:5'_ UU⑶CCGAACGUGUCACGU-3'（SEQIDN0:2)，已知的不作用任何基因的无义小分子片段；注 射量为每只虫4yg，注射后喂饲芥菜。注射后第1、2、3天观察虫子的形态变化并拍照取证， 每天统计虫子的死亡率。
[0016] 表