HDAC1抑制剂在制备调控hepcidin表达药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及HDAC1抑制剂的应用，特别涉及HDAC1抑制剂在制备调控hepcidin表 达药物及制备治疗遗传性血色素沉着症药物中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 遗传性血色素沉着症（hereditary hemochromatosis, HH)又称为血色素沉着症 或血色病，是一种铁代谢常见疾病，在北欧后裔中发病率约为1:200。最常见的血色病由 于HFE基因常染色体隐形突变，第282位的半胱氨酸被酪氨酸取代（C282Y)。由于HFE基 因突变导致肝脏分泌的hepcidin减少，进而导致铁的排出受阻，机体内的铁过载，沉积到 肝脏等多个组织及脏器，造成组织的氧化损伤及器官的功能障碍，包括皮肤黑色素沉着、肝 硬化、肝癌及糖尿病、心脏衰竭等严重并发症。早期治疗，降低机体铁的沉积，可以有效预 防并发症，尤其是在肝硬化发生前治疗可防止肝癌发生。但是目前应用的一些铁的螯合剂 副作用大，而放血疗法和肝移植会加重一些不耐受病人病情的恶化。因此寻找新的升高 hepcidin的表达、降低组织铁、且副作用小的药物成为治疗关键。
[0003] 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC)抑制剂是目前应用的一类 新的靶向抗癌药，它们主要是通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，从而 调控基因表达。HDAC抑制剂主要包括异羟肟酸类，这类化合物的典型代表有曲古抑菌 素(trichostatin A, TSA)、SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid);环状四肽类 (cyclic tetrapeptide)，短链脂肪酸类，苯甲酰胺类化合物（benzamides)，典型的有 MS-275(Entinostat)和 MGCD0103。MS-275 属于 HDAC I 类抑制剂，对于 HDAC1 和 HDAC3 有 极强的抑制活性。目前正在临床试验用于治疗黑色素瘤、肺癌和乳腺癌、晚期实体瘤及霍奇 金淋巴瘤和骨髓增生异常综合征等血液病。
[0004] 有研究报道丙型肝炎病毒能够通过诱导氧化应激增加组蛋白去乙酰酶的活动，可 以抑制h印cidin表达，推测MS-275等HDAC抑制剂通过抑制组蛋白乙酰化酶活性可能会增 加h印cidin的表达，用于治疗遗传性血色素病，据此我们展开深入研究。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供HDAC1抑制剂新应用，即HDAC1抑制剂在制备调节hepcidin表 达药物中的应用，所述药物包括治疗遗传性血色素沉着症的药物，为新药筛选提供基础。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 首先，本发明提供一种HDAC1抑制剂在制备调控hepcidin表达药物中的应用，所 述册4(：1抑制剂为下列之一 ：恩替特诺（又称￡111:;[1108丨31:，1'|-[[4-[[(2-氨基苯基）氨基] 甲酰]苯基]甲基]氨基甲酸3-吡啶基甲基酯，MS-275)、曲古柳菌素A(又称Trichostatin A，TSA，[R- (E，E) ] -7- [4-(二甲氨基）苯基]-N-羟基-4, 6-二甲基-7-羰基苯）、伏立诺 他（又称 N-羟基-N'-苯基辛二酰胺、Vorinostat，suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA)、Mocetinostat (MGCD0103);更优选所述 HDAC1 抑制剂为 MS-275。
[0008] 进一步，所述调控hepcidin表达的药物为提高hepcidin表达的药物。
[0009] 其次，本发明还提供一种HDAC1抑制剂在制备治疗遗传性血色素沉着症、地中海贫 血、铁超载的酒精性肝炎、病毒性肝炎或高铁诱发的肿瘤药物中的应用（即调控hepcidin 表达的药物），具体所述HDAC1抑制剂为下列之一：恩替特诺（即Entinostat，MS-275)、 曲古柳菌素 A(即 Trichostatin A，TSA)、伏立诺他（即 Vorinostat，suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)、Mocetinostat (即 Mocetinostat MGCDOIO3)，更优选 MS_275〇
[0010] 在体外实验表观遗传药物筛选中，发现HDAC1抑制剂能升高hepcidin的表达， MS-275作用尤其显著，并呈现较强的时间、剂量依赖性。Huh7细胞加入Bmp6受体的抑制剂 LDN193189，MS-275作用消失。进一步利用Wt、Hjvalb/alb、Smad4alb/alb小鼠肝原代细胞培养发 现，MS-275能明显增加Wt鼠肝原代细胞h印cidin的表达；对Hjvalb/alb肝原代细胞有轻微 的作用；但是不能改变Smad4alb/alb肝原代细胞hepcidin的表达，说明其可能通过BMP-SMAD 通路调控hepcidin的表达。由于MS-275能增加hepcidin的表达，我们进一步将其腹腔注 射Wt小鼠体内，发现注射后6小时Hampl及Idl表达升到最高点，注射12小时后其血清铁 显著降低，说明MS-275的急性注射能够减少机体巨噬细胞铁的释放。接着探究其是否能 够用于治疗遗传性血色素沉着症，将MS-275注射Hfe7(遗传性血色素模型鼠）体内，注射 六周后发现其Hampl、Idl表达比对照组均明显增加，实验组红细胞数量及血红蛋白减少， 肝组织铁减少，说明长期使用MS-275能够降低肠道铁吸收，使机体中可利用铁减少。进一 步证实了我们的假设，MS-275能通过BMP-SMAD通路调控h印cidin的表达，促进肝脏分泌 hepcidin，进一步降低组织铁，减少体内铁的蓄积及氧化损伤，治疗遗传性血色素沉着症， 同时还可以用于制备治疗地中海贫血、铁超载的酒精性肝炎、病毒性肝炎及高铁诱发的肿 瘤的药物。
[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种HDAC1抑制 剂的新应用，用于制备调控hepcidin表达药物，进而制备治疗遗传性血色素沉着症、地中 海贫血、铁超载的酒精性肝炎、病毒性肝炎及高铁诱发的肿瘤的药物，拓展了作为治疗癌症 的HDAC1抑制剂的新的应用领域。由于遗传性血色素沉着症目前治疗应用的铁螯合剂毒 性作用大，放血疗法及肝移植一些病人不能耐受，而MS-275作为主要治疗癌症的临床二期 药物毒副作用小，研究发现其能够明显促进肝脏h印cidin的分泌，降低血清铁和组织铁， 减少因铁过载引起的氧化损伤等并发症，因此可以用于制备治疗遗传性血色素沉着症的治 疗、地中海贫血及铁超载的酒精性肝炎、病毒性肝炎及高铁诱发的肿瘤的药物。 (四）【附图说明】
[0012] 图1为HDAC抑制剂在体外对人肝癌细胞系Huh7细胞HAMP基因表达作用；
[0013] A :HDAC1、HDAC3、HDAC6、HDAC8抑制剂对Huh7细胞HAMP基因表达影响的柱形图；
[0014] B:MS-275处理Huh7细胞不同时间点，对HAMP基因表达影响的折线图；
[0015] C:不同浓度的MS-275处理Huh7细胞12h，对HAMP基因表达影响柱形图。
[0016] 图2为MS-275升高h印cidin的作用机制研究：
[0017] A:Huh7细胞加入LDN193189 (Bmp6受体ALK2和ALK3的抑制剂）后，再加入 MS-275,对HAMP基因表达影响的柱形图；
[0018] B :Wt、Hjvalb/alb、Smad4alb/alb鼠肝原代细胞用 MS-275处理后 HAMPmRNA变化的柱形 图；
[0019] C :转染 Huh7 细胞 Hamp-promoter2. 7kb_pGL3 和内参 Renilla 报告基因质粒， MS-275处理后，荧光素酶报告基因检测HAMP基因转录影响的柱形图；
[0020] D :Huh7 细胞中转染 pCDNA3. 1-HDAC1，HDAClmRNA 过表达的柱形图；
[0021] E:Huh7细胞中HDAC1过表达，抑制h印cidin mRNA表达柱形图。
[0022] 图3为MS-275腹腔急性给药，对正常小鼠肝脏h印cidin表达及血清铁的影响；
[0023] A :MS-275 (20mg/kg)腹腔注射 0h、6h、12h、20h，C57BL/6 小鼠肝脏 Hampl、IdlmRNA 表达量情况的柱形图；
[0024] 8:1^-275(2011^/1^)腹腔注射011、611、1211、2011，0578176小鼠血清铁水平情况的折 线图。
[0025] 图4为MS-275 (20mg/kg)腹腔注射HFE /小鼠6周，小鼠血常规、肝脏组织铁的改 变及肝脏Hampl、ID1表达和westorn-blot检测肝组织蛋白水平的改变；
[0026] A :MS_275腹腔注射HFE /小鼠6周，肝组织铁的普鲁士蓝染色，Nilcon荧光显微 镜拍摄图（包括对照组和实验组）；
[0027] B :MS-275腹腔注射HFE /小鼠6周，小鼠肝脏Hampl和IdlmRNA表达量变化柱状 图；
[0028] C :MS_275