一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境修复技术领域，设及植物与微生物菌剂联合修复铅污染±壤的方 法。
【背景技术】
[0002] 铅是一种有毒重金属元素，严重影响人类健康及动植物的生存。工业生产中的铅 污染，一方面通过金属开采、冶炼及金属制品生产等企业构成污染源，W铅尘、铅烟污染周 围环境、危害周围人群。大气中含铅尘粒可W直接降落到地面，或是含铅废渣堆集在地面， 或因含铅污水、污泥作肥料使用，都可使±壤遭受铅的污染。铅在表±累计后，会影响±壤 生化活性，降低农作物的产量，并可通过食物链影响人类健康。铅进入植物后叶绿素含量会 降低，呼吸作用也会受到抑制。人体吸收的铅超过一定水平就会引起对健康的危害。铅中 毒的临床症状表现为贫血，便秘，腹痛，呕吐W及食欲减退等，铅对人体多张组织器官产生 危害，可W造成中枢神经损伤，严重的可导致脑病；引起血管疫李，血压升高，增加脑溢血的 发病率。而存在于上壤中的重金属铅难W被分解，因而对人类的危害具有隐蔽性，长期性和 不可逆等特点。
[0003] 目前，用来修复±壤重金属的方法主要有物理、化学、生物等方法。目前采用的物 理化学方法修复重金属污染±壤，费用昂贵，破坏环境，容易造成二次污染，且往往并不能 达到真正清除重金属的目的。而生物修复技术凭借二次污染较小，处理形式多样、操作相对 简单、对环境的扰动较小，而受到人们的关注。而其中的植物和微生物的联合修复技术，因 二者的联合会达到相互促进±壤修复的效果，对于受重金属铅污染±壤的修复更具有重要 意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术活问题是针对现有技术的不足和缺陷，提供一种植物-微 生物联合修复铅污染±壤的方法。通过在铅污染±壤中种植富集植物印度芥菜，并在其根 际接种微生物复合菌剂，通过利用微生物菌剂W增强印度芥菜对于上壤中铅的吸附能力， 实现±壤重金属铅污染的高效、快速安全修复。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种植物-微生物联合修复铅污染±壤的方法，向含铅±壤中均匀撒入印度芥菜 种子，然后诱水使上壤保持湿润状态，10~15天后待植物发芽生长，向印度芥菜根系±壤 中添加微生物复合菌剂，利用印度芥菜对铅的吸收W及微生物复合菌剂的强化作用联合去 除±壤中的铅；其中，所述的微生物复合菌剂为葦状芽抱杆菌度acillus mycoides)、希瓦 氏菌（化ewanella)与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)按重量比3~10 :1 :1混 合制成。
[0007] 其中，印度芥菜种子的播种量为3~6g/m2,优选5g/m 2。
[000引其中，优选的是，向含铅±壤中均匀撒入印度芥菜种子，上部覆± 1cm。
[0009] 其中，印度芥菜在铅污染±壤中的适宜溫度为15~35°C，定期诱水，保持±壤含 水量为田间最大持水量的60~80%。
[0010] 其中，所述的葦状芽抱杆菌度acillus mycoides)保藏于中国典型培养物保藏中 屯、，保藏编号为CCTCC N0:M2015510,保藏日为2015年9月6日，保藏地址为中国武汉武汉 大学，邮编430072。
[0011] 其中，所述的希瓦氏菌（Siewanella)为ATCC 700550。
[0012] 其中，所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)为 ATCC 39018。
[0013] 其中，葦状芽抱杆菌度acillus mycoides)、希瓦氏菌（化ewanella)与铜绿假单 胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的重量比优选为 5:1:1。
[0014] 其中，所述的微生物复合菌剂按如下方法制备得到：
[001引 （1)取牛肉膏5g、蛋白腺lOg、化C1 5g和蒸馈水1L混匀，调抑值至7.0,灭菌，得 到培养基；
[0016] (2)将保藏在斜面培养基的菌种分别接种到步骤（1)得到的培养基后，在溫度为 37°C、转速为25化/min的条件下培养48h;
[0017] 做将步骤似得到的菌种按照比例混合，再加入到步骤（1)制备得到的培养基中 一起扩增，在溫度为37°C、转速为25化/min的条件下扩大培养48h，即得发酵液；
[0018] (4)将事先灭菌冷却后的教皮，按其和发酵液的质量比30:1混匀，自然风干，装袋 封口，制成菌剂。
[0019] 其中，微生物复合菌剂的在±壤中的用量为1~5Kg/m2,优选3Kg/m 2。
[0020] 其中，所述的铅污染±壤中，铅含量为100~500mg/Kg。
[0021] 有益效果：本发明的有益效果在于：
[0022] 1)本发明提供的微生物复合菌剂，其基本组分为复合菌群，比单一菌株对±壤环 境的适应能力强，并且和教皮制成干菌剂，更利于投加到±壤中区，W提高印度莽菜对铅的 吸收能力，增强铅污染±壤的去除效果。
[0023] 2)采用本发明提供的微生物复合菌剂和印度芥菜修复方法，修复效果好、费用低、 易于管理、不产生二次污染，具有广泛的应用前景。
[0024] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[00巧]图1为系统发育树。
【具体实施方式】
[0026] 根据下述实施例，可W更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0027] W下实施例所用的印度芥菜为市售草种。
[002引 W下实施例所用的葦状芽抱杆菌度acillus mycoides)ADB，武汉大学保藏于中国 典型培养物保藏中屯sCCTCC N0:M2015510,保藏日为2015年9月6日。
[0029] W下实施例所用的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)为ATCC 39018。
[0030] W下实施例所用的希瓦氏菌Ghewanella)为ATCC 700550。
[0031] 实施例1 :葦状芽胞杆菌ADB的筛选、鉴定及生物学特征分析。
[0032] 1)±壤样品来源：南京某电锻污泥厂活性污泥
[0033]。菌种筛选：取Ig活性污泥加到10ml的液体LB培养基（蛋白腺lOg/L，氯化钢 10邑/1，酵母粉5g/L。）中富集培养，培养条件37°C 18化/min,培养24h;取1ml富集培养液 分别接种于含lOOmg/L铅的新鲜液体培养基，37°C、180;r/min培养；待液体选择培养基混 浊后，从中取1ml培养液接种于含lOOmg/L金属离子的液体培养基中，逐级类推提高金属离 子浓度。然后用接种环取最高耐受浓度培养液划线接种于含lOOmg/L铅离子的固体平板 上，37°C培养2地。根据平板菌落形态分别挑取单菌落再接种至铅离子选择培养基进行验 证，循环=次，W获得金属耐受能力较好的纯菌株。
[0034] 如菌种鉴定：
[003引 16SRNA序列分析法：PCR扩增采用细菌16SRNA通用引物：
[0036] 27F (5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，）
[0037] 1492R(5, -GGTTACCTTGTTACGACTT-3,）
[003引 PCR反应体系（2. 5 y L) :5X扩增缓冲液巧y L)、基因组DNA化1 y L)、 dNTP(2 y L)、引物 F(0. 5 y L)、引物 R(0. 5 y L)、hq DM 聚合酶 0). 25 y L)、去离子水 (16. 65yL)。反应条件：98°C预变性 10min，98°C变形 10s，58°C退火 10s，72°C延伸 90s，共 30个循环，72°C充分延伸lOmiriDPCR产物直接用于碱基序列测定（SEQ ID No. :1所示），然 后利用NCBI网站的BLAST进行碱基序列的比对，构建系统发育树（图1)，确定菌株的系统 分类。系统发育树结果表明，筛选得到的ADB和Bacillus的亲缘关系最近，其同源性达到 99%，其生理生化实验中，菌落表面呈乳白色，不透明，边缘不光滑、中生芽抱，属革兰氏阳 性，鉴定为葦状芽抱杆菌，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中屯、，CCTCC N0:M2015510， 保藏日为2015年9月6日。
[003引实施例2:微生物复合菌剂的制备。
[0040] 本发明中菌剂的制备方法具体包含W下步骤：
[00川 （1)取牛肉膏5g、蛋白腺lOg、化C1 5g和蒸馈水1L混匀，调抑值至7.0,灭菌，得 到培养基；
[0042] (2)将保藏在斜面培养基的菌种转接到分别接种到培养基后，在溫度为37°C、转 速为25化/min的条件下培养48h;
[0043] (3)将步骤（2)得到的菌种按照比例混合，再次加入到步骤（1)制备得到的培养基 中一起扩增，在溫度为37°C、转速为25化/min的条件下扩大培养48h，即得发酵液；
[0044] (4)将事先灭菌冷却后的教皮，按其和发酵液的质量比30:1混匀，自然风干，装袋 封口，制成菌剂。
[0045] 其中，所使用的菌种为1)葦状芽抱杆菌度acillus mycoid