一种高度氧化的二萜化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从款冬花的干燥花蕾中分离得到的一种二萜 化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 款冬花别名冬花、蜂斗菜或款冬蒲公英，系菊科款冬属植物款冬 (Tussilagofarfaru L.)的花蕾，分布于我国河北、新疆等省区。款冬的花先叶开放，花亭数 个，有鳞片状苞叶10多片，花雌性，花期2-3月份。款冬的入药部位为其干燥花蕾，呈不整 齐棍棒状分布，花头外面长有许多鱼鳞状苞片，通常在10月下旬至12月下旬花尚未出土时 采挖。药材气味清香，味道微微发苦。款冬花性温，味辛，微苦，润肺下气、止咳化痰，主治喘 咳痰多、劳嗽咯血、急慢性气管炎等症。在《本经》中记载：对"寒束肺经之饮邪喘、嗽最宜"。
[0003]国内外现已报道款冬花的化学成分类型主要包括黄酮、萜类、酚类、生物碱类和挥 发油类。
[0004]款冬花具有止咳、平喘、升压、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性。款冬止嗽颗粒能 明显延长浓氨水引咳后小鼠咳嗽的潜伏期，减少咳嗽次数，增加小鼠气管段酚红排泌量。款 冬花素、甲基丁酸款冬花酯和14-去乙酰氧基-3, 14-去氢-2-甲基丁酸款冬花酯对血小板 活化因子引起的血小板聚集有抑制作用。款冬花黄酮对O2 ?、种自由基有较好的 清除能力，且在〇? 38~47. 65mg/L 1范围内呈现一定量效关系，对3种自由基的清除能力大 小：H203>0 2 ?> *0H。款冬花乙醇提取物可以明显减少二甲苯致小鼠耳肿及角叉菜胶所致 小鼠足跖肿；款冬花乙醇提取物能明显减少蓖麻油、番泻叶所致小鼠腹泻，降低水浸应激溃 疡、盐酸所致溃疡及吲哚美辛-乙醇所致溃疡。款冬花提取物1，2-di-(3'，4'-dihydr 〇xyc innamoyl)-cychopenta-3_ol，山奈酸和槲皮素对小鼠肺癌细胞LA795的增值均显示出一 定的抑制作用，其中槲皮素对肺癌细胞LA795的抑制作用最显著。有文献表明，槲皮素亦可 抑制肺腺癌细胞A549细胞的增长，并使其凋亡。槲皮素对其他肿瘤也显示出较强的抑制作 用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从款冬花的干燥花蕾中分离得到的一种二萜化合物，含 其的药物组合物及其制备方法和应用。
[0006]本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物（I ):
[0008]
[0009] 所述的化合物（I )的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将款冬花的干燥花蕾粉 碎，用80~90 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤 (a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗脱8个 柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤（b)中75 %乙醇洗脱 浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到4个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体 积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。
[0010] 进一步地，步骤（a)中，用85%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I )和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物（I)在制备血管保护的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备血管保护的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物（I )结构式；
[0019] 图2为化合物（I)计算E⑶和实验E⑶图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0022] 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023] 实施例1:化合物（I )分离制备及结构确证
[0024] (a)将款冬花的干燥花蕾（8kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（30LX 3次），合并 提取液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX 3次）、乙酸乙酯（6LX 3次）和水饱和的正 丁醇（6LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（375g)和正丁醇萃取物； (b) 步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再 用75%乙醇洗脱8个柱体积，收集75%洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱浓缩物（129g); (c) 步骤（b)中75%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1 (8个柱体积）、 30:1 (8个柱体积）、15:1 (8个柱体积）和8:1 (10个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到4个组分；（d)步骤（c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(8 个柱体积）、8:1 (10个柱体积）和5:1 (8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个 组分；（e)步骤（d)中组分2 (15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化 合物（I ) (40mg)。
[0025] 结构确证：HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z 355. 1900,结合核磁特征可得分子式 为（：2。氏804,不饱和度为7。核磁共振氢谱数据S H(ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-2(1.99，m)， H-2(l. 55, m)，H-3(l. 59, m)，H-3(l. 23, m)，H-5(2. 09, dd，J = 3. 1，14. 6)，H-6(2. 48, dd， J = 3. 1，14. 6)，H-6(2. 38, m)，35, m)，64, m)，H-12(l. 59, m)，H-12(l. 48， m)，H-14 (4. 22, s)，H-15 (4. 19, t，J = 7. 8)，H-16 (4. 09, t，J = 7. 8)，H-16 (3. 55, t，J = 7.8)，H-17(0.91，s)，H-18(0.93, s)，H-19(0.95, s)，H-20(l. 11，s);核磁共振碳谱数据 S c(ppm，DMS0-d6,150MHz) :216. 4(C，1-C)，25. 2(CH2,2-C)，33. 0(CH2,3-C)，32. 3(C，4-C)， 42. 9 (CH，5-C)，34. 5 (CH2, 6-C)，198. 6 (C，7-C)，128. 8 (C，8-C)，168. I (C，9-C)，44. 2 (C， 10-C)，20. 8(CH2,11-C)，21. 7(CH2,12-C)，40. 4(C，13-C)，76. I (CH，14-C)，79. 3(CH，15-C)， 70. 2 (CH2,16-C)，17. 8 (CH3,17-C)，31. 9 (CH3,18-C)，20. 6 (CH3,19-C)，17. 8 (CH3, 20-C);碳 原子标记参见图1。红外光谱显示该化合物含有羟基（3217cm1)和羰基（1685cm 1)基团。 1H NMR 谱显示含有四个甲基信号 SH〇.91(s，H3-17)，0.93(s，H3-18)，0.95(s，H3-19)以及 I. 11(S，H3-20)?3C NMR谱表明含有四个甲基信号，六个亚甲基，三个次甲基（两个含氧次甲 基S C76. 1，79. 3)，七个季碳[包括两个羰基碳（S C216. 4,198. 6)，两个烯烃碳（S C128. 8， 168. 1)]。上述数据表明该化合物为高度氧化的二萜类化合物。HMBC谱中H3-20 ( S HL 11) 与C-I ( S C216. 4)的相关性表明C-I为酮羰基。此外，H-5 (2. 09, dd，J = 3. 1，14. 6Hz)和 H-14 (4. 22, s)与C-7 ( S C198. 6)的相关性表明C-7亦为酮羰基。通过HMBC谱中H-6与C-8， H-14与C-8，H3-20与C-9的相关性C-8和C-9之间为双键。C-14位低场碳信号（S C76. 1)， 再结合不饱和度推测在C-14和C-16之间存在醚键。HMBC谱中H-14与C-16 ;H-14与C-15 ; 以及H-16与C-13的相关性验证了上述推测。NOESY谱中H-14与H3-17 ;H-15与H-12 a; H-15与H3-17的相关性表明H-14, H-15和H3-17为构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和 NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进 一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验
[0027] -、材料和仪器
[0028] 血管内皮细胞（ECV-304)由山东大学医学院免疫教研室馈赠。化合物（I )自制， 制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶购于美 国Gibeo公司。胎牛血清购于天津TBD公司。MTT、琼脂糖、AnnexinV-FITC购于美国Sigma 公司。LDH、MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。DMSO购于中国医药 (集团）上海化学试剂有限公司。苏木素购于福州迈新生物技术有限公司。Rhodaminel23 购于美国Solarbic公司。阳性药川考嗪购自上海源叶生物科技有限公司。
[0029] 倒置光学显微镜（日本OlymPus公司），二氧化碳培养箱（美国Forma Scientific 公司），电子分析天平（ER-182A型）（日本A&D公司），超净工作台（ZHJH-1209型）（上海 智城分析仪器制造有限公司），流式细胞仪（FACS Vantage型）（美国Beeton Diehnson公 司），恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂），1420Vietor3多标记分析仪（美国PerkinElmer Lifescience公司），721型可见紫外光栅分光光度计（上海精密科学有限公司），电热 恒温水浴箱（上海医疗仪器三厂生产），酶联免疫检测仪（MK3Multiskan)(上海Thermo Labsystem 分析）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养
[0032] ECV-304细胞以RPMI-1640培养基于37°C，5% CO2培养箱中传代培养。镜下观察， 待细胞汇合率达到70%以上时用胰蛋白酶消化传代，以生长稳定的第