一种冷沉淀的预纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种冷沉淀的预纯化方法。
【背景技术】
[0002] 冷沉淀（cryoprecipitate)是由健康人体血衆分离出来的一种成分血，为均勾的 乳白至微黄的呈粘性沉淀，是大规模制备人凝血因子VIII (FVIII)浓缩制剂的原料。目前， 国内外普遍采用的FVIII纯化工艺是以冷沉淀为原料，经过初步纯化除去大部分的杂蛋 白，利用阴离子凝胶对预纯化料液中蛋白吸附能力的差异去除杂蛋白，得到高纯FVIII成 品。
[0003] 对冷沉淀这种多成分原料来说，预纯化工艺直接影响上样料液（预纯化料液）的 质量，后者导致离子交换层析对FVIII的纯化效果和凝胶使用寿命变现出显著性差异。
[0004] 冷沉淀预纯化方法包括氢氧化铝凝胶吸附、甘氨酸沉淀、聚乙二醇沉淀和酸性沉 淀，已经将它们的组合，但是纯化效果均不佳。
[0005] 如，罗亮等，"离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂"，华西药学杂志 2000, 15 (3) : 174~176公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解， 再经氢氧化铝吸附、酸沉淀和聚乙二醇沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活仅提高了 1. 85倍（0. 61/0. 33,详见表5)，且需要采用肝素钠进行前处理，涉及多次升温和降温过程， 操作复杂，成本高。
[0006] 邓志华等，"人凝血因子VIII提取工艺优化研究"，江西医药2014年2月第49卷 第2期公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解，再经氢氧化铝吸 附、酸沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活最高也仅提高了 1.9倍，且需要采用肝素钠 进行前处理，涉及多次升温和降温过程，再者其需制备氢氧化铝胶，操作复杂，成本高。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了 一种新冷沉淀预纯化方法。
[0008] 本发明冷沉淀的预纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：
[0009] (1)取冷沉淀，溶解；
[0010] (2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5~30% w/w， 揽摔15~30min;
[0011] (3)再加入聚乙二醇至终浓度为3. 0~4. 0% w/v，混勾，调pH为6. 0~6. 5,继续 搅拌15~60分钟；
[0012] (4)离心，离心的时间是10~30min，得上清，滤膜过滤，即可。
[0013] 步骤（1)中，冷沉淀溶解于20mmol/L、pH 6. 8的Tris溶液中。
[0014] 优选地，溶液的步骤是：在搅拌条件下，将冷沉淀加入Tris溶液中，其中，搅拌的 频率是80~120rpm。
[0015] 步骤⑴中，溶解时的温度不低于20°C。
[0016] 步骤（2)中，所述氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5~15% w/w。
[0017] 步骤⑵中，所述搅拌时间为15~20分钟。
[0018] 步骤（3)中，聚乙二醇是通过加入聚乙二醇母液的方式加入，其中，聚乙二醇母液 中含有30% w/v的聚乙二醇和0. 21 % w/v的枸橼酸钠，且其pH为6. 3。
[0019] 步骤（3)中，所述搅拌时间为20~40分钟。
[0020] 步骤⑵和步骤（3)中，所述搅拌的频率是80~120rpm。
[0021] 步骤（4)中，所述离心的时间是15~20分钟。
[0022] 步骤⑷中，离心机的转速为3500~4200rpm。
[0023] 步骤⑵~⑷期间，控制温度为20~37°C。
[0024] 所述温度为25~35 °C。
[0025] 本发明还提供了前述的方法制备的预纯化液。
[0026] 本发明还提供了前述预纯化液在制备人凝血因子VIII制剂中的用途。
[0027] 本发明预纯化方法的纯化效果好，FVIII的比活提高了 3. 69~5. 64倍，而且操作 简单，无需反复调整温度，只需一步离心即可实现杂蛋白和FVIII料液的有效分离，减少劳 动强度和设备投入；沉淀剂均为药用级原料药，减少了自行配制过程中质量的不稳定和不 安全性，易于操作，质量可控。
[0028] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0029] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1本发明冷沉淀的预纯化方法
[0031] ⑴取冷沉淀25kg
[0032] 冷沉淀指来源于-20°C以下保存不超过1年的健康人血浆；
[0033] 冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于_60°C以下保 存，-30 °C以下运输。
[0034] ⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L 20mmol/L pH6. 8Tris溶解液中，过程 温度不得低于20°C;
[0035] ⑶按5g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入125g氢氧化铝凝 胶干粉。加入后继续搅拌15分钟，控制温度20°C;
[0036] ⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3. 0%，搅拌均 匀后用IM醋酸溶液调pH至6. 0;继续搅拌15分钟，控制温度20°C;
[0037] (5)搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速3500rpm，离心温度 20°C，离心时间10分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤后，即得预纯化液。
[0038] 冷沉淀预纯化结果见表1。
[0039] 实施例2本发明冷沉淀的预纯化方法
[0040] ⑴取冷沉淀25kg
[0041] 冷沉淀指来源于_20°C以下保存不超过1年的健康人血浆；
[0042] 冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于_60°C以下保 存，-30 °C以下运输。
[0043] ⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L 20mmol/L pH6. 8Tris溶解液中，过程 温度不得低于20°C ;
[0044] ⑶按15g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入375g氢氧化铝凝 胶干粉。加入后继续搅拌20分钟，控制温度30°C ;
[0045] ⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3. 5%，搅拌均 匀后用IM醋酸溶液调pH至6. 3 ;继续搅拌20分钟，控制温度30°C ;
[0046] (5)搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4000rpm，离心温度 30°C，离心时间15分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤后，即得预纯化液。
[0047] 冷沉淀预纯化结果见表1。
[0048] 实施例3本发明冷沉淀的预纯化方法
[0049] ⑴取冷沉淀25kg
[0050] 冷沉淀指来源于_20°C以下保存不超过1年的健康人血浆；
[0051] 冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于_60°C以下保 存，-30 °C以下运输。
[0052] ⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L 20mmol/L pH6. 8Tris溶解液中，过程 温度不得低于20°C ;
[0053] ⑶按15g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入375g氢氧化铝凝 胶干粉。加入后继续搅拌20分钟，控制温度35°C ;
[0054] ⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3. 5%，搅拌均 匀后用IM醋酸溶液调pH至6. 5 ;继续搅拌40分钟，控制温度35°C ;
[0055] (5)搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4000rpm，离心温度 35°C，离心时间20分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0. 45um膜过滤，即得预纯化液。
[0056] 冷沉淀预纯化结果见表1。
[0057] 实施例4本发明冷沉淀的预纯化方法
[0058] ⑴取冷沉淀25kg
[0059] 冷沉淀指来源于_20°C以下保存不超过1年的健康人血浆；
[0060] 冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于_60°C以下保 存，-30 °C以下运输。
[0061] ⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L 20mmol/L