Pict-1蛋白截短突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体的，本发明涉及PICT-I蛋白截短突变体及其应 用，更具体的，本发明涉及一种PICT-I蛋白截短突变体、PICT-I蛋白截短突变体的用途、截 短突变体编码核酸，截短突变体编码核酸的用途，截短突变体编码核酸的表达载体、一种包 含表达载体的宿主细胞、一种治疗神经胶质瘤的方法及装置。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是成人中尤其青壮年最常见的原发性脑肿 瘤，占颅内原发肿瘤比例的40-50%。
[0003] 在人神经胶质瘤中，19号染色体长臂上一段150kb的片段（19ql3. 32)经常存在 等位缺失现象。这说明在这段染色体上可能存在有肿瘤抑制基因，这些基因的缺失可导致 人类神经胶质瘤的发生。2000年，利用缺失定位、cDNA选择、外显子扩增和基因测序等方 法，证明在这段序列中存在一个新的基因，命名为GLTSCR2 (Homo sapiens glioma tumor suppressor candidate region gene 2)。2004年，为了寻找与抑癌因子PTEN(phosphatase and tensin homo log deleted on chromosome ten)相互作用的蛋白，Okahara 等人使用 PTEN的C末端作为诱饵蛋白，用酵母双杂交技术筛选脑部的cDNA文库，筛选出了一个与 PTEN 的 C 末端相结合的蛋白，将其命名为 PICT-1 (protein interacting with carboxyl terminus I)，进一步分析发现这个蛋白的编码基因就是GLTSCR2。PICT-I在包括神经胶质 瘤、滤泡性癌和卵巢癌等在内的人类多种肿瘤中被发现表达异常，其表达水平与肿瘤的恶 性程度呈负相关关系，即PICT-I表达水平越低，肿瘤恶性程度越高，因此PICT-I被认为是 一个肿瘤抑制蛋白。但其抑癌功能和分子机制还远没有清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
[0005] 发明人研究发现一种未见报道过的PICT-I蛋白抑癌的分子机制：PICT_1蛋白过 表达能够抑制细胞核糖体rDNA的转录，促进细胞自的发生，促进肿瘤细胞死亡。进一步 的，发明人发现一种PICT-I蛋白截短突变体，其基于一样的分子机制与PICT-I蛋白具有相 同的引起细胞自，进而抑制癌细胞的生长和增殖，特别是神经胶质瘤细胞的生长和增殖， 促进肿瘤细胞死亡的功能。
[0006] 依据本发明的第一方面，本发明提供一种PICT-I蛋白截短突变体，其具有如SEQ IDNO:1中的第181位到第478位所示的序列。SEQIDNO:1为PICT-I蛋白序列。根据本 发明的实施例，表示该截短突变体为PICT-I(aa181-479)。
[0007] 发明人研究发现，PICT-I蛋白过表达或者上述截短突变体过表达，能调控上游结 合因子（UBF)的磷酸化和活性，进而抑制rDNA的转录；而且，该蛋白或者截短突变体过表 达，会显著抑制Akt/mT0R/p70S6K信号通路的活化。
[0008] 依据本发明的第二方面，本发明提供上述截短突变体在调节UBF活性、和/或抑制 rDNA转录、和/或引起细胞自噬、和/或制备抗肿瘤药物中的用途。
[0009] 根据本发明的实施例，发明人对神经胶质瘤进行体外研究，发现PICT-I蛋白或者 其截短突变体过表达可以通过rRNA转录抑制和Akt/mT0R/p70S6K信号通路失活引起神经 胶质瘤细胞发生促死亡型自噬反应，进而抑制神经胶质瘤的生长。根据本发明的实施例，所 述引起细胞自噬为引起神经胶质瘤细胞自噬，所述制备抗肿瘤药物为制备抗神经胶质瘤药 物。所称的"过表达"指表达过度，即基因被过度的转录、翻译，最终基因表达产物、蛋白或 者多肽超出正常水平。
[0010] 依据本发明的第三方面，本发明提供一种编码上述截短突变体的核酸，其具有如 SEQID NO :2中的第541位到第1437位所示的序列。SEQ ID NO :2为编码PICT-I蛋白的核 酸序列，为GLTSCR2基因。
[0011] 发明人研究发现，GLTSCR2基因过表达或者上述截短突变体编码核酸过表达，使得 PICT-I蛋白或者所称的PICT-I蛋白截短突变体表达过量，能调控上游结合因子（UBF)的磷 酸化和活性，进而抑制rDNA的转录；而且，该基因或者编码所述截短突变体的核酸过表达， 即使得PICT-I蛋白或者PICT-I蛋白截短突变体表达过度，会显著抑制Akt/mT0R/p70S6K 信号通路的活化。
[0012] 依据本发明的第四方面，本发明提供上述本发明一方面的编码PICT-I蛋白截短 突变体的核酸在调节UBF活性、和/或抑制rDNA转录、和/或引起细胞自噬、和/或制备抗 肿瘤药物中的用途。
[0013] 根据本发明的实施例，发明人对神经胶质瘤进行体外研究，发现GLTSCR2基因过 表达或者上述截短突变体编码核酸过表达，使得PICT-I蛋白或者其截短突变体过表达可 以通过rRNA转录抑制和Akt/mT0R/p70S6K信号通路失活引起神经胶质瘤细胞发生促死亡 型自噬反应，进而抑制神经胶质瘤的生长。根据本发明的实施例，所述引起细胞自噬为引起 神经胶质瘤细胞自噬，所述制备抗肿瘤药物为制备抗神经胶质瘤药物。所称的"过表达"指 表达过度，即基因被过度的转录、翻译，最终基因表达产物、蛋白或者多肽超出正常水平。
[0014] 依据本发明的第五方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述本发明一方面的 编码所述PICT-I蛋白截短突变体的核酸序列，即该表达载体包含GLTSCR2基因序列即SEQ ID NO :2中的第541位到第1437位所示的序列。该表达载体能够用以表达所述截短突变 体。
[0015] 依据本发明的第六方面，本发明提供一种构建上述本发明一方面的表达载体的方 法，该方法包括：提取细胞的RNA ;反转录所述RNA为cDNA ;以所述cDNA为模板，利用引物对 扩增，获得扩增产物，所述引物对由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4或者由SEQ ID NO :5和 SEQ ID NO :4组成；双酶切所述扩增产物，获得酶切产物；双酶切空载体，获得载体骨架，所 述双酶切空载体利用的酶为与所述双酶切扩增产物的两种酶相同；连接所述酶切产物和所 述载体骨架，以获得所述表达载体。获得的表达载体也称为重组质粒。
[0016] 根据本发明的实施例，提取的RNA来自神经胶质瘤细胞，例如来自U251细胞或者 MCF7细胞。RNA的提取可利用购买市售试剂盒及按照产品的操作说明进行，本发明对此不 作限制。
[0017] 所称空载体为没有插入目的外源基因序列的载体。空载体可以自己构建或者通过 购买市售产品获得，本发明对空载体的类型不作限制。根据本发明的实施例，所用的空载体 选自PFLAG-CMV2和pDsRedcl中的至少一种，相应表示包含编码截短突变体的核酸的重组 质粒为PFLAG-CMV2-PICT-1 (181-479)和pDsRedCl-PICT-1 (181-479)。
[0018] 双酶切扩增产物或者双酶切空载体利用的酶组合为EcoRI和BamHI。根据本发明 的实施例，SEQ ID NO :3 为 CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG,SEQ ID NO :4 为 CGGGATCC CTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC,SEQ ID NO : 5 为CGGGATCCT AAGCCCGGGCCCCAGGACACCGTA， 各引物序列的下划线显示的碱基能够使得获得的扩增产物带有所利用的酶组合的识别位 点和/或酶切位点。引物对SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4可以用于高效地扩增编码PICT-I 蛋白的GLTSCR2基因。引物对SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :4可以高效地用于扩增编码PICT-I 蛋白截断突变体的核酸序列。
[0019] 依据本发明的第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述本发明一方面的