一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法。
【背景技术】
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[0002]目前，一种新药物从开发到成功问世，需要耗时15年、耗资8亿美元。药物的成功开发，一方面需要对患者的病情进行针对性的治疗，另一方面还要承担副作用的风险。首先，由科研小组研究病情并作生物化学分析等实验，确定药物成分。接着，用饱受伦理争议的活体动物进行药物实验。如果成功，将进行临床测试。人类与动物的生理差异很难保证动物测试的结果与临床结果相吻合。如果临床实验失败，一方面推翻原有的实验结论，要重新进行研发、测试，另一方面，临床测试往往对临床试验者带来一定的危险性。
[0003]微流控芯片利用对微尺度下流体的控制，把传统的生物、医学、化学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可以实现对微观流体、细胞、蛋白质、核酸及其他微纳粒子的操控和高效分析，具有消耗样品少、分析速度快、自动化程度高等优点，非常适合用于细胞分析、疾病的快速诊断等领域。随着微机电加工技术的迅猛发展，微纳尺度电极和通道的加工已经比较成熟。在微纳尺度下，分子扩散的距离大大缩短，能将传统需要一天多时间的生物化学反应缩短到几十分钟，用于药物测试及疾病诊断的微流控芯片也应运而生，极大程度地减少了药物开发的时间与成本。传统的药物开发具有投资大、过程长等特点。
[0004]流体的交流电动技术主要包括交流电渗技术与交流电热技术。其中，交流电渗技术主要适用于电导率较低(即溶液离子浓度低)的流体；交流电热技术是靠电场与温度梯度相互作用而驱动流体，适用于电导率较高的流体，如生物流体等。
[0005]近几年，随着微流控芯片技术的发展，基于生物科学和生物技术的细胞培养已经和微流控芯片技术相结合，从而提出了 “器官芯片”及“人体芯片”等概念并进行相应研究。然而，对于复杂的“人体芯片”流体自循环系统，其动力来源一直是困扰各国学者的主要难题。就现有文献而言，利用PDMS薄膜制成的微型蠕动栗是其运转的主要方式，但这种栗加工及控制困难，且使用寿命只有几天，甚至几小时。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是为了解决传统生物技术的细胞培养和微流控芯片技术相结合制备的细胞生物反应器存在加工和控制困难且不耐用的问题，提供了一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法。
[0007]本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器包括氧化铟锡导电玻璃和聚二甲基硅氧烷层，所述聚二甲基硅氧烷层的下表面键合在氧化铟锡导电玻璃的上表面上；
[0008]所述氧化铟锡导电玻璃上表面的一半面分布有外侧通电电极、内侧通电电极、三组宽电极和三组窄电极；所述外侧通电电极位于氧化铟锡导电玻璃的一个角上，通过一根导线连接交流电给有刻蚀电极的方环形流体通道外侧区域加电；所述内侧通电电极位于三组宽电极和三组窄电极的中间，每组宽电极都与一组窄电极夹杂在一起形成每个宽电极与一个窄电极成对间隔排列，三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的，外侧通电电极与每个宽电极相连接，内侧通电电极与每个窄电极相连接；三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的可使液体成一个方向循环流动；
[0009]所述聚二甲基硅氧烷层下表面开有一个方环形流体通道，三组宽电极和三组窄电极分别位于方环形流体通道的相邻三个边的下方；在与氧化铟锡导电玻璃的接触面上没有刻蚀电极的方环形流体通道的一条边上设置有细胞培养室，用来培养细胞；在与氧化铟锡导电玻璃的接触面上有刻蚀电极的方环形流体通道的一条边上设置有细胞培养液注入室，用来加入细胞培养液；所述的细胞培养室是一个圆柱形通孔且上面有一个盖子，防止培养液过量蒸发；所述的细胞培养液注入室是一个圆柱形通孔。
[0010]本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法按以下步骤进行制备:
[0011]—、氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀
[0012]首先，将负性光刻胶干膜利用照片塑封机压紧于镀有10nm?300nm厚氧化铟锡电极层的氧化铟锡导电玻璃上，再把经AutoCAD软件辅助设计并打印好的掩膜贴在负性光刻胶干膜上，然后将贴好的负性光刻胶干膜的氧化铟锡导电玻璃放入紫外曝光机内进行选择性曝光25s?40s ;曝光后将氧化铟锡导电玻璃放入质量分数为4%?5%的Na2OVKS液中显影2min?4min，洗去未曝光的部分；显影后，将氧化铟锡导电玻璃浸泡在质量分数为15?25%的浓盐酸中30min?45min，腐蚀裸露在外面的氧化铟锡电极层；腐蚀完后，用丙酮溶液浸泡氧化铟锡导电玻璃，去除作为保护层的负性光刻胶干膜，可得到镀有相应电极形状的氧化铟锡导电玻璃(ITO);
[0013]二、浇铸聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道
[0014]将1_?2_厚聚甲基丙烯酸甲酯薄板经激光雕刻机刻制成相应通道形状，并用胶水粘在玻璃片上，再将固化剂与聚二甲基硅氧烷(PDMS)的预聚物充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯薄板模具上，真空干燥箱脱气15min?30min，至没有气泡产生后，放置在80°C?90°C的恒温箱中固化Ih?2h;然后取出聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，利用打孔器对聚二甲基硅氧烷(PDMS)层打两个孔，其中一个孔为细胞培养室，另一个孔为细胞培养液注入室；另制备一块边长为12mm?15mm的正方形，厚度为2mm?3mm的聚二甲基娃氧烧(PDMS)薄片盖在细胞培养室上，目的是防止培养液过量的蒸发；
[0015]三、聚二甲基硅氧烷(PDMS)层与氧化铟锡导电玻璃的键合
[0016]将步骤二制备好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层的方环形流体通道与空气接触的一侧放置在氧化铟锡导电玻璃上，经等离子机处理后，键合成一体，形成完整的生物反应器。
[0017]本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法按以下步骤进行:
[0018]—、将整个细胞生物反应器放入质量分数为60%?80%的酒精浸泡Ih?1.5h，然后用磷酸盐溶液清洗2次?5次，再将整个细胞生物反应器和培养皿置于细胞培养无菌操作台中经紫外消毒Ih?1.5h;
[0019]二、将细胞生物反应器置于培养皿内，向细胞生物反应器中的细胞培养室内加入细胞并向细胞培养液注入室添加细胞培养液；
[0020]三、通过两根导线将细胞生物反应器中的内侧通电电极和外侧通电电极连接至正弦交流信号发生器上，调节信号发生器输出电压振幅IV?5V，频率500KHZ?10MHz，即可完成驱动；将细胞生物反应器放入二氧化碳孵化箱中，36°C?38°C培养，0)2的浓度为
4%?
[0021]本发明的原理:当对溶液中施加交流电场时，电场作用于高电导率的流体而产生焦耳热，在焦耳热的作用下，溶液产生不均匀的温升，形成了温度梯度，从而产生了电导率梯度与介电梯度，并产生自由电荷。自由电荷在非均匀电场的作用下生成流体驱动的