一种草酸青霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株草酸青霉菌及其应用，主要应用于柑橘生物保鲜方面，该草酸青 霉菌可用于拮抗柑橘橘青霉菌。
【背景技术】
[0002] 柑橘青霉病主要由橘青霉病菌（Penicillium italicum)引起，发病初期果皮软 化，水渍状褪色，此后在病斑处长出气生菌丝，形成一层厚的白色霉状物，并迅速扩展成白 色近圆形霉斑。主要危害生长期成熟果实及储藏期果实，严重影响了柑橘产业发展。
[0003] 传统上常用的柑橘保鲜有冷藏、气调及化学保鲜法，然而冷藏和气调保鲜成本高、 耗能大及质量不稳定已逐渐被淘汰，且化学保鲜法存在潜在的食品安全和环境污染问题， 而且长期使用化学制剂保鲜，柑橘致病菌会对其产生耐药性。然而生物保鲜技术克服以上 保鲜法的不利因素和弊端，具有处理目标明确、成本低、绿色环保无污染等优点。因此生物 保鲜技术越来越受到人们的重视，如：蔡文韬从辣椒中分离出对辣椒致病菌有抑菌效果的 内生菌strain-L和strain-39,且研究其生物防控效果。结果表明：strain-39发酵液乙 酸乙酯提取物质量浓度为l〇〇mg/ml时，辣椒和番茄烂果率分别下降51. 879%和58. 47% ; 75 %乙醇沉淀物为lOOmg/mL时，辣椒腐烂率下降了 47. 50%，番茄腐烂率下降了 50. 47%。 李梅从柑橘园土壤中分离得到对柑橘青霉病和柑橘绿霉病有拮抗作用的G-3、G-4。并用 硅胶柱层析分离技术从其发酵液中分离出三种活性成分：活性成分1对柑橘青、绿霉病的 抑制率分别为48. 32 %、60. 83% ;活性成分2对柑橘青、绿霉病的抑制率分别为48. 01%、 57. 35% ;活性成分3对柑橘青、绿霉病的抑制率分别为35. 28%、55. 79%。
[0004] 青霉属是一种杂食性真菌，可生长在任何含有有机物的基质上。青霉的孢子耐热 性较强，菌体繁殖温度较低，饮料中常用的酸味剂是其喜爱的碳源，青霉属在生产及临床上 有很广泛的应用。如：临床上应用的抗生素一一青霉素，就是从青霉中提取出来，另一重要 抗生素一一灰黄霉素，是由灰黄青霉产生的，是抑制真菌性皮肤病的最好抗生素。
[0005] 本发明从疏花水柏枝叶中分离得到一株草酸青霉菌，它对柑橘橘青霉菌有很好的 抑制作用，为开发新的柑橘生物保鲜剂提供技术支撑。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种草酸青霉菌（Penicillum oxalicum)SG4菌株，该草 酸青霉菌菌体对柑橘橘青霉菌有很强的抑制作用，可用于制备柑橘生物保鲜剂，为开发新 的生物保鲜剂及柑橘生物保鲜提供了新方向。
[0007] 所述草酸青霉菌（Penicillum oxalicum)SG4是从疏花水柏枝 (MyricariaLaxiflora)的根中获得的内生真菌，于2015年4月30日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为=CCTCC M2015270。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
[0008] 本发明草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4在PDA培养基上具有以下微生物 学特性：菌丝白色丝状较短、大量灰绿色孢子。
[0009] 本发明目的是提供一种草酸青霉菌在制备生物防治柑橘腐烂的菌剂上的应用。所 述的柑橘腐烂为柑橘青霉菌所致病害。
[0010] 本发明还提供了一种草酸青霉菌在制备保鲜剂上的应用。所述的草酸青霉菌还可 以替换为草酸青霉菌菌株的发酵液或发酵液的提取物。
[0011] 本发明以草酸青霉菌（Penicillum oxalicum)SG4的DNA为模板，上游引物ITSl : 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，下游引物 ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，进行菌 落PCR扩增，获得560bp的18S rDNA部分序列（SEQ ID NO :1)。通过Blast与GenBank收 录的序列进行比对，发现SG4与草酸青霉菌的同源性为100%。用MEGA5建进化树（图4)， 鉴定菌株（SG4)与一株P. oxalicum(HQ680452)的亲缘关系最近。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明的草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4的菌落形态。
[0013] 图2为本发明的草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4的显微形态。
[0014] 图3为本发明的草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4菌体对柑橘橘青霉菌拮 抗作用效果。
[0015] 图4为本发明的草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4菌株的18S rDNA系统发 育树。
【具体实施方式】
[0016] 实施例一：草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4的分离和保存
[0017] 2012年在三峡流域湖北宜昌境内胭脂坝采集疏花水柏枝根，表面消毒后接种于加 工作浓度为25 μ g/ml青霉素的PDA固体培养基分离真菌。
[0018] 表面消毒：取疏花水柏枝根用自来水冲洗5次，无菌滤纸擦干后，75%酒精浸泡 lmin，无菌水冲洗3次，再用3 %次氯酸钠浸泡60S，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸洗干 根表面水分。
[0019] 培养：用无菌剪刀将表面消毒后的根剪成0. 5*0. 5cm大小，接种于加工作浓度为 25 μ g/ml青霉素 PDA固体培养基（马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、Ph6. 0-6. 5)， 置于28 °C下培养。
[0020] 菌株纯化：待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落接种于新的PDA固体培养 基中，置于28°C下培养。
[0021] 菌株保藏：待菌株纯化后，挑取纯菌株接种于PDA斜面培养基，28°C培养4d，用灭 菌的液体石蜡封藏于4°C保藏。
[0022] 将该菌株草酸青霉菌（Penicillum oxalicum)进行保藏，保藏名称为SG4 ;保藏单 位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015-4-30 ;保 藏编号为：CCTCC M 2015270。
[0023] 实施例二：草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4 鉴定
[0024] 18S rDNA序列分析：采用通用引物进行菌落PCR扩增18S rDNA序列。上游引物 ITSI : 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，下游引物 ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '。反 应体系如下： CN 105176831 A 说明书 3/4 页
[0026] 反应条件：94°C预变性 5min，94°C变性 lmin，56°C退火 30sec，72°C延伸 l.min，33 个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，挑取750bp左右的条 带进行凝胶回收，送上海生工测序。
[0027] 将测得的序列提交至GenBank，并获得登录号KR024319。将此序列在GenBank中进 行Blast比对，并选取同源性较高的菌株的序列用MEGA5软件构建18S rDNA系统发育树。
[0028] 施例三：草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4菌体的制备
[0029] 菌种活化：取保存4°C冰箱的草酸青霉菌种划线接种于PDA平板中，28°C下，培养 4d，获得菌体。
[0030] 实施例四：草酸青霉菌（Penicillum oxalicum) SG4菌体对柑橘橘青霉菌诘抗作 用。
[0031] 琼脂块的制备：采用平板划线法分别将疏花水柏枝内生真菌菌株接种于PDA培养 基上，28°C下培养4d，用打孔器（直径IOmm)在布满供试菌的琼脂平板上打孔，用以制备菌 饼。平板对峙法检测菌体对柑橘橘青霉菌抑菌活性：将橘青霉菌接种于PDA斜面培养基， 28°C培养4d，在试管中加9ml无菌水，用接种环刮下所有孢子，制得孢子悬浮液，取500 μ 1 柑橘橘青霉菌孢子悬液，涂布均匀，将疏花水柏枝内生真菌菌饼置于平板上，在平板的一区 中菌饼正向放置（菌面朝上），另一区反向放置（菌面朝下），在28°C下分别培养4d，观察 结果。
[0032] 抑菌结果：
【主权项】
1?草酸青霉菌（/feniciU?oyaJici/a? )SG4,于2015年4月30日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为=CCTCCM2015270,保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。2. 权利要求1所述的草酸青霉菌在制备生物防治柑橘腐烂的菌剂上的应用。3. 权利要求2所述的柑橘腐烂为柑橘青霉菌所致病害。4. 权利要求1所述的草酸青霉菌在制备保鲜剂上的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的草酸青霉菌还可以替换为草酸青 霉菌菌株的发酵液或发酵液的提取物。6. 权利要求1-5任一项所述的草酸青霉菌是从疏花水柏枝的根中获得的内生真菌。
【专利摘要】本发明公开了一种草酸青霉菌及其应用。该草酸青霉菌保藏名称为<i>Penicillum？oxalicum？</i>SG4；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015-4-30；保藏编号为：CCTCC？M？2015270。本发明经实验证明，草酸青霉菌菌体对柑橘橘青霉菌有很强的抑制作用，可用于制备柑橘生物保鲜剂，为开发新的生物保鲜剂及柑橘的生物保鲜提供了新方向，具有很好的经济和社会效益。CCTCC M 201527020150430
【IPC分类】C12N1/14, A23B7/155, A01P3/00, A01N63/04, C12R1/80
【公开号】CN105176831
【申请号】
【发明人】刘士平, 蒋维, 秦王阁阁, 秦田明, 薛艳红, 唐皓, 舒德华
【申请人】三峡大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月14日