一种通过基因工程构建的短小芽胞杆菌CotA漆酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体，属于基因工 程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 漆酶（laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化 还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广 泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨 大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健 康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸 厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类 化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒 性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境 污染。
[0003] 漆酶按来源不同可分为三大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。细菌漆酶包括芽 胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA 蛋白等，与真菌及植物漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。
[0004] 本实验室前期已从自行筛选的短小芽胞杆菌菌株W3 (Bacillus pumilus W3)中克 隆并重组表达了 CotA漆酶，研究发现该CotA漆酶相对其它种类漆酶具备以下优点：碱性 PH下酶活性高、耐高温且热稳定性好、能耐受高浓度有机溶剂及卤素离子环境等，这些优良 特性正是目前漆酶在印染废水处理领域进行工业化应用所急需的。然而，野生短小芽胞杆 菌CotA漆酶天然表达量很低，且底物专一性差，酶催化活性较低，成为工业化应用的瓶颈。 因此本发明利用基因工程和酶工程手段，提高短小芽胞杆菌CotA漆酶对特定底物的专一 性，进一步提高其工业化应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种短小芽胞杆菌漆酶突变体，该突变体以本实验室前期构建的 pColdll-CotA质粒为模板，将野生型漆酶第386位亮氨酸（Leu，L)突变为色氨酸（Trp， W)，随后以野生型CotA漆酶为对照，验证该突变体对底物2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻 唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS)的专一性是否提高。
[0006] 所述B. pumilus CotA漆酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的B. pumilus CotA 漆酶氨基酸序列一致（由本实验室提交，GenBank登录号：KF040050)。
[0007] 所述突变体是将野生型CotA漆酶氨基酸序列中第386位的Leu突变成了 Trp，命 名为L386W
【附图说明】
[0008] 图I :野生短小芽胞杆菌CotA漆酶三维模拟结构图
[0009] 图2 :野生短小芽孢杆菌CotA漆酶及突变体纯酶SDS-PAGE电泳图。注1 :野生型 细菌全细胞蛋白；2 :野生型漆酶纯化条带；3 :L386W突变体漆酶纯化条带；M :蛋白分子量 标准
[0010] 图3 :构建突变体质粒过程的分子操作原理示意图
【具体实施方式】
[0011] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0012] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0013] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0014] 实施例1野生短小芽胞杆菌CotA漆酶的表达与纯化。
[0015] 从甘油管接种前期构建的重组表达菌株CotA/pColdII/BL21 (DE3)于LB液体培养 基（含100mg/L氨节青霉素）过夜培养，按2 %接种量将种子接入LB液体发酵培养基（含 100mg/L氨苄青霉素）。大肠杆菌在37°C培养2h后，加入0. 3mM终浓度的IPTG进行诱导， 并在15°C摇床继续发酵培养24h后，将发酵液于4°C、8000rpm离心10min去除上清，收集 菌体。将收集的菌体用磷酸盐缓冲液重悬，重悬后用超声波细胞破碎仪将菌体破碎释放胞 内蛋白，破碎完成后，将破碎的液体于4°C、8000rpm离心10min收集上清。收集的上清用于 CotA漆酶蛋白纯化。
[0016] 由于重组表达的CotA漆酶蛋白带有多聚组氨酸标签（His6. tag)，因此使用镍离子 亲和层析方法分离目标蛋白。镍离子亲和层析纯化步骤：（1)平衡：用10倍柱体积的20mM 缓冲液（含5mM的咪唑）平衡HisTrap HP镍离子柱（ImL) ; (2)上样：预先处理好的样品 以lmL/min的流速上样；（3)洗脱：用高浓度咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱条件下峰型对应 的管号，并做酶活检测。最终获得纯化好的野生型CotA漆酶。
[0017] 实施例2 CotA漆酶突变体构建并制备
[0018] ⑴定点突变
[0019] 以前期构建的含有B. pumilus CotA漆酶基因的重组质粒pColdll-CotA为模板， 将漆酶中第386位的亮氨酸（Leu)突变为色氨酸（Trp)，命名为L386W。
[0020] 引入L386W突变的定点突变引物为：
[0021] 正向引物 5' -TATGGGCGCCCTATTT迎TTACTAGATAAC-3'（下划线为突变位点）
[0022] 反向引物 5' -￡￡AAATAGGGCGCCCATATTTATCTTGTGT-3'（下划线为突变位点）
[0023] 利用上述引物，以重组质粒pColdll-CotA为模板，进行PCR反应。反 应均在50 μ L体系中进行，反应条件为：95 °C预变性3min，随后进行25个循环 (95°C 20s，57°C 20s，72°C 6min)，循环后 72°C延伸 7min，最后 4°C保温。取 10 μ L PCR 产物 经I %琼脂糖凝胶电泳检测。检测到有目的产物后加1 μ L DMT酶于剩余的PCR产物中，混 匀，37°C孵育1小时。将孵育处理后的产物全部经1%琼脂糖凝胶电泳分离、切胶，用凝胶回 收试剂盒回