保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标 准溶液的体积。
[0072] 脂肪酶的酶活力按下列公式计算：
[0074] 式中：
[0075] Xl 样品的酶活力，u/mL;
[0076] Vl 滴定样品时消耗氛氧化纳标准溶液体积，mL ;
[0077] V2一一滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL ;
[0078] c--氢氧化钠标准溶液的浓度，moL/L ;
[0079] 50--〇· 05moL/L氢氧化钠溶液1.0 OmL相当于脂肪酸50 μ moL ;
[0080] η一一酶液稀释倍数；
[0081] 0. 05-氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；
[0082] 1/15--反应时间 15min，以 Imin 计；
[0083] 所得实验结果表示至整数。
[0084] 按照上述方法测得里氏木霉AFLip摇瓶发酵液中脂肪酶酶活为700U/mL。从而说 明，本发明构建的重组菌株里氏木霉AFLip能高效表达脂肪酶AFLip。
[0085] 4. 2酶学性质分析
[0086] (1)最适pH分析：
[0087] 分别用 pH 值为 2· 0、2· 5、3· 0、4· 0、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8. 0 的缓冲液稀释 里氏木霉AFLip发酵上清液，在40°C条件下测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶 活，做作用PH-相对酶活曲线。结果如图1所示，本发明提供的脂肪酶AFLip的最适作用pH 为7. 0,且在pH3. 0-4. 0, pH6. 0-7. 0范围内能保持50%以上的酶活。
[0088] (2)最适温度分析：
[0089] 分别在 20°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C，ρΗ7· 5 条件下测定里氏木霉 AFLip发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做作用温度-相对酶活 曲线。结果如图2所示，本发明提供的脂肪酶AFLip的最适作用温度为40-50°C，且能在 30-50°C范围内保持85 %以上的酶活。
[0090] (3) pH耐受性分析：
[0091] 分别用pH值为2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0的缓冲液稀释里氏木霉AFLip发 酵上清液；40°C保温30min后，分别测定其酶活力，以未处理的上清液酶活力为100%，计算 酶活残留率，具体结果见表1。
[0092] 表1在不同pH条件下处理30min后脂肪酶AFLip的酶活残留情况
[0094] 从表1的结果可以看出：本发明提供的脂肪酶AFLip在pH2. 0-7. 0的范围内的酶 活残留率均高于80%，从而说明脂肪酶AFLip具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条 件下具有很强的耐受性。
[0095] 实施例5体外酶解的实验
[0096] (1)胃液和胃蛋白酶耐受性
[0097] 先将里氏木霉AFLip发酵上清液以pH2. 0的人工胃酸稀释至适当倍数；然后分别 以pH2. 0的人工胃酸和胃蛋白酶在40°C条件下处理2h后，在40°C，pH7. 5条件下测定其残 留酶活，以未处理的上清液酶活为100%，计算酶活残留率。具体结果见表2。
[0098] (2)ρΗ6·8、胰蛋白酶耐受性
[0099] 先将里氏木霉AFLip发酵上清液以ρΗ6. 8的缓冲液稀释至适当倍数；然后分别以 ΡΗ6. 8的缓冲液和胰蛋白酶在40°C条件下处理6h后，在40°C，ρΗ7. 5条件下测定其残余酶 活，以未处理的上清液酶活为100%，计算酶活残留率，具体结果见表2。
[0100] 表2在体外模拟动物胃、肠环境下脂肪酶AFLip的酶活残留情况
[0102] 从表2的数据可以看出，本发明提供的脂肪酶AFLip对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白 酶均具有较好的耐受性，从而说明脂肪酶AFLip能有效适应动物的胃、肠道环境，并能保持 较高的酶活水平，为其在饲料中的应用奠定基础。
[0103] 实施例6脂肪酶AFLip对肉鸡生产性能的影响
[0104] 1.材料与方法
[0105] I. 1试验动物与分组
[0106] 六和种鸡场提供的罗斯肉雏鸡300只，随机分为3个处理，每个处理10个重复，每 个重复10只肉鸡。具体分组设计见表3。
[0107] 表3试验分组设计
[0109] 1.2试验样品
[0110] 本试验选用本发明实施实例4制备得到的脂肪酶AFLip。
[0111] 1.3测定指标
[0112] 分别在肉鸡0d、7d、21d、35日龄时，对各栏试验鸡统一进行称重并记录采食量，计 算日增重（ADG)、日采食量、料肉比（FCR)和体重（BW)等指标。
[0113] 1. 4数据处理与分析
[0114] 试验数据采用SPSS13. 0统计软件中ANOVA方法进行分析，所有指标以每个重复为 试验单位，用Duncan's多重比较进行检验。结果用均值及平均标准差表示，P〈0. 05为差异 显著。
[0115] 2.结果与分析
[0116] 本发明提供的脂肪酶AFLip对0-35日龄肉鸡生产性能影响
[0117] 表4脂肪酶AFLip对0-35日龄肉鸡生产性能的影响
[0119] 注：表中数字右上角字母有相同字母或没有标注者者表示差异不显著（P > 〇· 05)，字母不同表示差异显著（P < 0· 05)
[0120] 由表4肉鸡0-35d试验结果可知，全期来看试验组肉鸡日增重在正对照组基础 上提高了 4. 73%，在负对照组基础上提高了 6. 82%，料肉比在负对照组基础上降低了 4. 65%。试验组肉鸡日增重、采食量均高于正对照组和负对照组。在此阶段负对照组即降低 油脂组，在采食量、日增重和料肉比等方面均不及其它组。总体来看试验组优势较为明显。 试验全期增重料肉比均较好，优于其它各组。
[0121] 上述实验结果表明，本发明提供的脂肪酶AFLip能显著提高饲料中油脂类物质的 利用率。在日粮中降低油脂的添加量后添加脂肪酶AFLip，肉鸡的生产性能不仅优于负对 照，还明显优于正对照，因此，使用本发明提供的脂肪酶能够显著减少油脂的添加，从而降 低饲料成本，增加养殖户的经济效益。
【主权项】
1. 一种脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶包含有： 1) 氨基酸序列为SEQIDNO:1的脂肪酶； 2) 在1)中的脂肪酶氨基酸序列上发生取代、缺少或添加一个或几个氨基酸，且具有1) 中的脂肪酶酶学性质的酶。2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的脂肪酶。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。4. 一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2或3所述的基因。5. -种重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌为携带有权利要求4所述的重组 质粒的宿主菌。6. 如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述的宿主菌为里氏木霉 (Trichodermareesei)〇7. 权利要求1所述的脂肪酶在制备畜禽饲料中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO：1。本发明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3.0-4.0，pH6.0-7.0范围内能保持50％以上的酶活，具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条件下具有很强的耐受性；最适作用温度为40-50℃，且能在30-50℃范围内保持85％以上的酶活。本发明提供的脂肪酶AFLip对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，能有效适应动物的胃、肠道环境，并能保持较高的酶活水平，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶AFLip能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能，增加经济效益，应用前景广泛。
【IPC分类】C12N15/80, C12R1/885, C12N1/15, A23K1/165, C12N9/20, C12N15/55
【公开号】CN105176945
【申请号】
【发明人】李宾, 张青, 王华明, 黄亦钧
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月21日