79]barF:AGTCGACCGTGTACGTCTCC
[0080]barR:GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
[0081]gus-plusF:CACGGTGCCGGCCTATCTGA
[0082]gus-plusR:GCTTGCGACCACTTTGCCTTCCT
[0083]0smiR156F:CACCACAGTTTAATTTATTTCTTGG
[0084]0smiR156R:CTAGGCAGAAAATTTAACAGGAG
[0085]PCR的扩增条件为:95°C，2min ;接着进行30个循环，每个循环的条件为。94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C, 30s ;最后 72°C，1min0
[0086]所述的多基因遗传转化效率通过PCR检测包含外源基因/序列(hph、nptll、COMT-RNA1、bar、gus-plus和0smiR156)的植株数目:农杆菌侵染前的愈伤组织块数目计算获得。
[0087]使用实例I中筛选获得的部分单一基因型高质量胚性愈伤系检测的柳枝稷多基因遗传转化效率大于30%，其中实例I中农杆菌侵染最高的愈伤系的多基因遗传转化效率为60%，能够同时转化至少6个外源基因至柳枝稷中，每人每年可转化200个基因载体，产生大于3000棵含有多个不同外源目的基因的转基因柳枝稷植株。
[0088]本发明技术方案不仅适用于柳枝稷，还适用于芒草等自交不亲和的禾本科能源草和牧草的多基因遗传转化体系建立。
[0089]最后所应说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，因此任何对本发明方案的修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于它的内容包括: 单一基因型尚质量尚农杆菌侵染率的胚性愈伤系的建立; 含有不同双元载体的农杆菌侵染上述愈伤系，并通过双抗筛选获得含有多个不同外源基因的转基因植物阳性植株。2.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述的单一基因型高质量胚性愈伤系的外部特征为淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽，其建立的方法包括:植物成熟种子的单一基因型愈伤系建立，高质量胚性愈伤系通过目视法筛选和愈伤系再生率评价法获得，最终获得的所有单一基因型高质量胚性愈伤系的再生率均大于.90%。3.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述的用于农杆菌侵染效率评价的植物愈伤组织来自上述筛选所获得多个单一基因型的高质量胚性愈伤系，其中，来自每个愈伤系中的所有细胞均具有相同的基因背景，农杆菌侵染效率评价具体方法为将含有PANIC6A双元载体农杆菌菌液与单一基因型高质量胚性愈伤系进行共孵育，选择侵染效率大于30%的愈伤系即为单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤系，然后进行继代扩繁，并用于后续的多基因高效遗传转化方法的建立。4.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述的农杆菌菌株为EHA105或AGL1。5.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述的双元载体分别含有潮霉素和双丙氨膦抗性基因，并且适合本发明使用的质粒含有一个或一个以上的不同目的基因。6.根据权利要求5所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于目的基因是耐除草剂基因、细胞壁调控基因、分蘖数目决定基因、茎杆粗细控制基因、开花基因或逆境抗性基因。7.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述的植物为单子叶禾本科自交不亲和植物。8.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于所述双抗性筛选的试剂为潮霉素和双丙胺磷。9.根据权利要求1所述的一种植物多基因遗传转化的方法，其特征在于它的具体步骤包括植物成熟种子愈伤组织诱导、单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系的获得以及农杆菌介导的多基因遗传转化步骤； 所述的植物成熟种子愈伤组织诱导，把植物的成熟种子消毒清洗后接种于愈伤组织诱导培养基上，培养箱温度25 ± 2°C，暗培养6-7周，获得愈伤组织； 所述的种子愈伤组织诱导培养基MSD5为MS基本培养基添加30g/L蔗糖、5mg/L2，4_D和7.5g/L琼脂，高压灭菌15min，pH = 5.8 ； 所述的单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系的获得:把所获得的愈伤组织采用目视法进行筛选，选择其中淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的胚性愈伤组织为高质量胚性愈伤组织，将获得的高质量胚性愈伤组织分出一半愈伤组织接种到MSK2培养基上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/8h暗，培养4-5周，获得再生芽，并进行再生效率的评估，然后选择再生率大于90 %的愈伤系进行继代，培养箱温度25 ± 2°C，暗培养3-4个周，然后用于农杆菌侵染效率的评估，最后选择农杆菌侵染效率大于30%的愈伤系即为单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系，然后进行扩繁，培养箱温度.25±2°C，暗培养，每3-4周继代一次； 所述的农杆菌介导的多基因遗传转化，把所述的扩繁的单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系中的愈伤组织分成小块，然后置于三通干燥皿中抽真空，使用含有不同双元载体的农杆菌菌液对所述的单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织进行共孵育，然后去除残留的农杆菌菌液，25±2°C，黑暗中共培养3天，将共培养后的愈伤组织转接于抗性愈伤组织筛选培养基MSD3HB进行筛选，培养箱温度25±2°C，暗培养，每3个周转接一次，直到抗性愈伤组织长出，将获得的抗性愈伤组织转接到抗性愈伤组织筛选培养基MSK2HB上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/8h暗，每4个周转接一次，直到抗性芽长出；获得的抗性再生芽转接至生根培养基MSRHB上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/Sh暗；获得的再生苗按照常规方法移栽到土中，2周后再生苗成活； 所述的抗性愈伤组织筛选培养基MSD3HB为MS基本培养基添加30g/L蔗糖、3mg/L2, 4-D、30mg/L潮霉素、2.4mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞肟钠和7.5g/L琼脂，高压灭菌.15min，pH = 5.8 ； 所述的抗性芽再生培养基MSK2HB为MS基本培养基添加30g/L蔗糖、2mg/L激动素、.10mg/L潮霉素、1.2mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞肟钠和7.5g/L琼脂，高压灭菌15min，pH=5.8 ； 所述的抗性芽生根培养基MSRHB为1/2MS基本培养基添加15g/L蔗糖、10mg/L潮霉素、.1.2mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞H亏钠和7.5g/L琼脂，高压灭菌15min，pH = 5.8。
【专利摘要】本发明公开了一种植物多基因遗传转化的方法，属于植物生物工程技术领域。它的内容包括单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤系的建立；含有不同双元载体的农杆菌侵染上述愈伤系，并通过双抗筛选获得含有多个不同外源基因的转基因阳性植株。主要用于解决植物难于遗传转化和多性状综合改良的难题。实验数据表明，采用本发明的方法能够在4-5个月内成功获得具有单一基因型背景的阳性转基因植物，遗传转化效率最高可达60％,能够实现每人每年转化200个基因载体，产生大于3000棵独立的含有多个不同外源目的基因的阳性转基因植株的工作效率。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN105177042
【申请号】
【发明人】付春祥, 吴风燕, 曹英萍, 王增裕, 周功克
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月25日