一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种菊粉酶发酵生产低聚果糖的方法。
【背景技术】：
[0002] 低聚果糖（Fructooligosaccharides)，简称F0S，又称寡果糖或鹿果三糖族低聚 糖，分子式为：G-F-Fn，n= 1~3(G为葡萄糖，F为果糖）。它是由β-D-果糖基通过β-2, 1 糖苷键连接而成的直链低聚糖。目前，工业上生产低聚果糖的两种方法，酶法转化蔗糖合成 的蔗果低聚糖和由菊粉部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功 能基本一样。都具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降 血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被 誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。所以低聚果糖的工业化生产对促进 我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
[0003] 菊粉（Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经 β -2, 1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构， 聚合度通常在2~60,分子量为3000~5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤 维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广 泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准 菊粉为新资源食品。
[0004] 目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢 杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条 件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之 一。利用重组DNA技术菊粉酶基因酵母菌进行克隆和表达，实现菊粉酶的高效表达。目前 国内江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖所用的酶均来自国外 少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。因此，菊粉酶制剂国产化对于低聚果糖的生产和应用显 得非常重要。
[0005] 酶法转化蔗糖工业化大规模合成的蔗果低聚糖，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制 剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量< 55%~60% (干 基），且工艺复杂、生产成本高。而本专利所涉及到的菊粉酶，可高效水解菊粉长链为低聚 糖，还不增加单糖副产物，低聚果糖含量高达95. 78%以上，工艺简单，是一种生产低聚果糖 的新工艺。
【发明内容】
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[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是，以新鲜菊芋为原料，灭酶打浆后浸提 2_8h，收集清液，清液经碱处理、除杂并脱色后作为反应原液，调节pH 3. 8~7. 9,按每Kg菊 芋添加菊粉酶650000~2000000U，控制温度在20~80°C，搅拌速度在50~200r/min的 条件下反应4~12h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干 燥即为低聚果糖产品；
[0007] 所述菊粉酶氨基酸序列如核苷酸序列表SEQ ID No. 5所示。
[0008] 所述菊粉酶是一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的菊粉酶突变体，所 述突变体是以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板逆转录扩增出菊粉酶基因，经密码子优化后， 继而利用易错PCR等体外分子定向进化技术，对菊粉酶基因 inul进行分子改良，并对获得 的突变位点进行定点突变组合而得。目前报道的文献中，未有采用此方法来提高菊粉酶酶 活。
[0009] 本发明的有益效果如下：
[0010] 1、上述生产高品质低聚果糖的酶解工艺包括最优的菊芋添加量，pH，缓冲液浓度， 酶的添加量，温度，搅拌速度和反应时间。所形成的酶解工艺可以实现低聚果糖占总糖含量 达95. 78%以上的高效生产过程。本发明形成的低聚果糖的酶解工艺是一种新工艺，采用该 工艺制备低聚果糖可以大大降低操作难度，节约经济成本。
[0011] 2、本发明所述使用的菊粉酶具有较高的酶活，30m3体系下发酵液酶活达60000~ 65000U/mL，可显著提高菊粉酶的生产效率，降低生产成本。
【附图说明】：
[0012] 图1不同Mn2+浓度下的易错PCR ;
[0013] 其中，M-GeneRuler Ikb DNA Ladder ; 1-对照；2-7 :分别为不同 Mn2+浓度下 (0· 05mmol/L, 0. lmmol/L, 0. 15mmol/L, 0. 2mmol/L, 0. 25mmol/L, 0. 3mmol/L)的 PCR 产物
[0014] 图2重组质粒的单酶切（Nco I)验证；
[0015] M-GeneRuler Ikb DNA Ladder
[0016] 图3以重组菌的基因组为模板进行的PCR验证；
[0017] 其中，M-GeneRuler Ikb DNA Ladder ; 1-3 :三个不同重组菌的PCR验证图
[0018] 图4.低聚果糖的制备工艺流程图
[0019] 图5.低聚果糖产品的成分分析
[0020] 其中，1-果二糖2-果果三糖3-蔗果三糖4-果果四糖5-蔗果四糖6-果果五 糖7-蔗果五糖。
【具体实施方式】：
[0021 ] 实施例中涉及到的培养基配方（单位为w/v)如下：
[0022] (I)LB液体培养基：蛋白胨1 %，酵母提取物0· 5%，NaCl 1 %，pH 7. 0。
[0023] (2) PDA培养基：马铃薯200g切小块，煮沸后再煮30min，纱布过滤后定容IL使用。 使用时按葡萄糖20g/L，琼脂20g/L加入。
[0024] (3)ΥΗ)培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，制作平板时加入琼脂粉 2%。121°C高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0. 25mg/mL~ 2. Omg/mL，即 YPD-G418 平板。
[0025] (4)MD培养基：无氨基酵母氮源L 34%，生物素4X10 5%，葡萄糖2%，琼脂粉 2%〇
[0026] (5)BMGY培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，无氨基酵母氮源1.34%，生物素 4X10 5%，甘油1%，磷酸钾溶液100mmol/L。
[0027] (6)BMMY培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，无氨基酵母氮源1.34%，生物素 4X 10 5%，甲醇 0· 5%，磷酸钾溶液 100mmol/L。
[0028] (7) BMMYI培养基：BMMY培养基里加 2 %的菊芋和2 %琼脂粉。
[0029] (8)BSM培养基：磷酸（85% )2. 67%，硫酸钙0. 118%，硫酸钾1.82%，硫酸镁 0. 727%，氢氧化钾0. 413%，甘油4%。
[0030] 实施例1 :inul基因的克隆及密码子优化
[0031] 重组质粒的构建：采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉NRRL3135的总RNA。以 总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo (dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然 后分别以第一链cDNA为模板，以引物Fl (SEQ ID NO: 6)和Rl (SEQ ID NO: 7)进行PCR扩增 出黑曲霉菊粉酶基因 inul。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用EcoR I和Not I进行酶切、 纯化，再进行连接，转化Escherichia coli JM109感受态细胞。筛选阳性转化子，并提取其 质粒进行酶切验证。再将酶切验证正确的重组质粒进行测序（序列SEQ ID NO: 1)，构建正 确的重组质粒命名为pPIC9K-inuI。
[0032] 密码子优化：以上述构建正确的重组质粒pPIC9K_inuI为基础，通过网站http:// www. jcat. de/，优化菊粉酶编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术（牛丹丹等。应 用与环境生物技术学报，2007, 13(4) :515-518)，获得密码子优化的编码菊粉酶的新基因 inul'（序列SEQ ID N0:2)，其氨基酸序列与SEQ ID N0:3相同。将inul'克隆入表达载体 PPIC9K的EcoR I、Not I位点中，获得相应的重组表达质粒pHY-inuI'。
[0033] 实施例2 :利用易错PCR方法构建黑曲霉菊粉酶突变文库
[0034] 在体外利用易错PCR技术向密码子优化的黑曲霉菊粉酶基因 inul'引入核苷酸突 变（图1)。易错PCR的反应条件如下：
[0035] CN 105177084 A 说明书 4/7 页
[0036] 其中，引物 F2(SEQ ID N0:8)和 R2(SEQ ID N0:9)序列（5, -3'）分别为：
[0037] 上游引物 F2 ：CCGGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTTCATAC
[0038] 下游引物 R2 ：ATAAGAATGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCCGC
[0039] PCR 扩增条件：94°C 3min ;94°C lmin，58°C lmin，72°C I. 5min，30 个循环；72°C 10min〇
[0040] 易错PCR扩增产物经DNA纯化回收试剂盒纯化后，用限制性内切酶EcoR I和Not I对其进行酶切，并与经过相应酶切的质粒PPIC9K进行连接，转化至E. coli JM109感受态 细胞，涂布于含100 μ g/mL的氨苄青霉素 LB固体培养基平板上。37°C、200rpm培养12h后， 将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得突变质粒，。
[0041] 将突变质粒经限制性内切酶Sal I线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。 将转化液涂布于MD平板上，30°C培养2天，构成突变文库。
[0042] 按照上述的方法，以突变体基因组为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。
[0043] 实施例3 :高酶活菊粉酶突变体的筛选
[0044] 用灭菌牙签将MD平板上生长出的Hi S+转化子复制到YH)和含有BMMYI平板的相 同位置，同时将对照菌GS115/pPIC9K-inuI'（不经过易错PCR，制备过程同实施例2的产 物）接种至BMMYI平板上。30°C培养2天，并保存生长好的YPD平板。
[0045] 平板初筛：将突变菌株在BMMYI平板上诱导2~3天。平板上菌落周围的透明圈 比对照菌GS115/pPIC9K-inuI'大的菌株为初筛目的突变菌株。
[0046] 96孔板复筛：向1.8mL/孔（平底）的96孔板中加入300 μ L BMGY培养基，121°C灭 菌20min。向其中