一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法，属于发酵工艺优化技术领域。
【背景技术】
[0002] 雄烯二酮是从精巢或尿液中提取出的具有雄性激素作用的一种留类化合物，单 纯的依靠化学方法生产雄烯二酮远远达不到市场的需求。植物留醇可用作留体激素药中 间体，可以作为留体激素药物半合成的原料，目前市场需求量较大[1]。但是，植物留醇侧 链利用化学手段难以降解，长期以来一直被当作废物处理，而通过微生物选择性降解甾醇 侧链，可得到制备留体激素类药物的重要中间体雄烯二酮（雄留-4-烯-3, 17-二酮， androst-4-ene-3，17-dione，简称AD)。因此采用微生物发酵生产生产AD具有产品纯度 高、生产成本低、周期短等特点，是当前的一大趋势。
[0003] 但目前雄烯二酮发酵生产中还存在一定的困难，留醇利用率低，泡沫大，成本高。
【发明内容】
[0004] 本发明在原有的工艺基础上对配方进行优化，有效的增加了留醇溶解度，提高了 甾醇利用率，减少了发酵过程中产生的泡沫，提高了产量，降低了发酵染菌率，降低了生产 成本。
[0005] -.原配方如下： 原种子配方为（g/L):葡萄糖30,黄豆饼粉10,柠檬酸3,硫酸铵，15,磷酸二氢钾0. 5， 七水硫酸镁〇. 1，硫酸亚铁〇. 01，碳酸钙2,玉米浆5,泡敌0. 2, pH值8. 0。;原发酵配方为（g/ L):葡萄糖25,黄豆饼粉27,尿素 1. 0,柠檬酸4,磷酸氢二钾3,硫酸镁0. 5,硫酸亚铁0. 05， 碳酸钙6,植物甾醇30,卵磷脂2,泡敌2, pH值8.0。二.根据更适宜发酵生产的原则进行 优化 优化后的发酵配方为（g/L):葡萄糖25,黄豆饼粉27,尿素1.0,柠檬酸4,磷酸氢二钾 3,硫酸镁0. 5,硫酸亚铁0. 05,碳酸钙6,植物甾醇30,吐温7,豆油15,泡敌2, pH值8. 0。 [0006] 三.培养工艺与原工艺基本相同 (1)摇瓶工艺 种子瓶培养条件为：转速200r/min，培养72±6h，培养温度为30 土 rc，湿度30%-60%。 发酵瓶培养条件为：转速220r/min，培养7-8d，培养温度为30 土 1°C，湿度30%-60%。发酵 过程中补加葡萄糖和甘油溶液，补料工艺如下：4ml 25%硫酸铵溶液加入到50ml 32%甘油 溶液中，混合均匀，从48h后，每隔24h补加 I. 5ml上述混合溶液。
[0007] (2)罐上工艺 一级种子罐工艺：温度30 土 1°C，罐压0. 05-0. 07MPa，搅拌转速100-300rpm，空气流量 1:1，培养周期72±6h，溶氧> 30%。
[0008] 移种条件：pH值6. 8-7. 2, 0D600>15,无菌正常，菌体量大，接种量10%。
[0009] 二级种子罐工艺：温度30 土 1°C，罐压0· 05-0.1 MPa，搅拌转速100-300rpm，空气流 量1:1，培养周期64±6h，溶氧> 30%。
[0010] 移种条件：pH值6. 8-7. 2, 0D600>15,无菌正常，菌体量大，接种量10%。
[0011] 发酵瓶培养工艺为：温度30土 1°C，罐压0. 05-0.1 MPa，搅拌转速根据溶氧情况调 节，溶氧> 30%，空气流量1: 0· 5,转速：100-120rpm， pH值用10%浓度氨水溶液控制在7. 2左右，培养过程中补加甘油控制在5-10g/L。
[0012] 培养周期为180小时左右，放罐。 本发明的优点及效果 1. 豆油和吐温两种溶剂使得留醇溶解度更好，更有利于菌体转化。
[0013] 2.豆油是油性物质，能够有效的减少发酵过程中产生的泡沫。
[0014] 3.卵磷脂昂贵，生产成本较高，且市场供应量不大，用普通的豆油和吐温替代后， 原料供应稳定，可降低生产成本。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过摇瓶和1吨罐实验例子对本发明做进一步说明，下述实例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
[0016] 1.摇瓶试验： 将成熟斜面接种到一级种子瓶中，装量为l〇〇ml/500ml，30土rc，转速200r/min，湿 度30%-60%培养72h，菌体量大，pH值达到8. 0左右，转入发酵瓶，接种量10%。
[0017] 发酵瓶培养条件为：装量30ml/250ml，转速220r/min，培养7-8d，培养温度为 30土1°C，湿度30%-60%。发酵过程中补加葡萄糖和甘油溶液，补料工艺如下：4ml 25%硫酸 铵溶液加入到50ml 32%甘油溶液中，混合均匀，从48h后，每隔24h补加 I. 5ml上述混合溶 液。
[0018] 8天后放瓶，原配方为对照，修改后的配方为试验，对比两种配方的转化率和效价， 结果如下： 2. 罐上试验： 一.种子制备： 将成熟斜面接种到一级种子瓶中，装量为500ml/2000ml，30土 1°C，湿度30%-60%培养 72h，菌体量大，pH值达到8. 0左右。一次制备2000ml种子液接种到1吨种子罐中，一级种 子培养基为300ml。
[0019] 二.种子罐培养： 一级种子罐工艺：温度30 土 1°C，罐压0. 05-0. 07MPa，搅拌转速100-300rpm，空气流量 1:1，培养周期74h，溶氧> 30%。
[0020] 移种条件：pH值7. 2, 0D600>15,无菌正常，转入二级种子罐，接种量10%。二级种 子罐培养基为300ml 二级种子罐工艺：温度30土 1°C，罐压0. 05-0.1 MPa，搅拌转速100-300rpm，空气流量 1:1，培养周期68h，溶氧> 30%。
[0021] 移种条件：pH值7. 0, 0D600>15,无菌正常，转入发酵罐，接种量10%。发酵罐培养 基为500ml。
[0022] 三.发酵培养： 温度30 土 1°C，罐压0. 05-0.1 MPa，搅拌转速根据溶氧情况调节，溶氧> 30%，空气流量 1:0. 5,转速：100-120rpm， pH值用10%浓度氨水溶液控制在7. 2左右，培养过程中补加甘油控制在5-10g/L。
[0023] 培养周期为178h，放罐。
[0024] 四.以原配方工艺为对照，修改后的配方为试验，对比两种配方的效果，结果如 下：
由表可知，优化后的配方更适宜发酵生产。
【主权项】
1. 一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法，其特征在于：发酵配方为（g/L):葡萄糖25,黄 豆饼粉27,尿素I.O，柠檬酸4,磷酸氢二钾3,硫酸镁0. 5,硫酸亚铁0. 05,碳酸钙6,植物甾 醇30,吐温7,豆油15,泡敌2,pH值8.0。2. 根据权力要求1所述的一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法，其特征在于：所用的吐 温数量为7g/L。3. 根据权力要求1所述的一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法，其特征在于：所用的豆 油数量为15g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种优化雄烯二酮发酵工艺的方法，其特征在于：发酵配方为(g/L)：葡萄糖25，黄豆饼粉27，尿素1.0，柠檬酸4，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，碳酸钙6，植物甾醇30，吐温7，豆油15，泡敌2，pH值8.0。本发明有效的增加甾醇溶解度，提高了甾醇利用率，减少了发酵过程中产生的泡沫，提高了产量，降低了发酵染菌率，降低了生产成本。
【IPC分类】C12P33/02
【公开号】CN105177101
【申请号】
【发明人】李瑾, 于新令, 余洪智
【申请人】山东方明药业集团股份有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年6月5日