一组糖基转移酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本发明涉及一组新的糖基转移 酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 人参皂苷是从人参及其同属植物（如三七、西洋参等）中分离到的皂苷的总称，属 于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其 中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、 护心、护肝等功能。
[0003] 人参皂苷Rg3、Rf和Rg2均为稀有人参皂苷，分别具有非常强大的上述生理活性。 例如，人参皂苷Rg3具有很好的抗肿瘤活性，可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。 它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果；人参皂苷Rf具有抗肿瘤，抗疲劳 的功效，能够减少子宫收缩，且起到与脑神经细胞有关联的镇痛作用，同时具有调节磷脂 蛋白代谢的生理功能；人参皂苷Rg2对阿尔茨海默病大鼠大脑具有保护作用，可以增强大 鼠学习记忆能力，同时对心肌损伤具有修复作用，此外人参皂苷Rg2还具有保护细胞受到 紫外线伤害的作用。
[0004] 然而，由于这些低度糖基化的稀有人参皂苷在天然人参中非常容易被糖基转移酶 修饰并产生含复杂糖链的人参皂苷，因此，这些具有高生物活性的人参皂苷在人参中含量 极低。
[0005] 目前，生产这类稀有人参皂苷的方法是从人参中的大量人参皂苷出发，通过选择 性水解糖基的方法进行转化后再进行提取和纯化。以人参属植物的总皂苷或原人参二醇类 皂苷为原料，通过化学，酶法转化、分离和提取。由于化学制备方法原料损失较大，操作繁 琐，副产物多，从而导致成本增加，而且难以提高产率。此外，由于人参总皂苷的获得依赖于 人参的种植，所以导致用传统方法生产的稀有人参皂苷单体市场价格高昂。
[0006] 目前本领域尚缺乏一种有效的生产稀有人参皂苷Rg3、Rf和Rg2的方法，因此迫切 需要开发多种特异高效的糖基转移酶。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是提供一组糖基转移酶及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种体外糖基化方法，包括步骤：
[0009] 在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点 上：
[0010] C-3和/或C-6位的第一个糖基上；
[0011] 从而形成糖基化的四环三萜类化合物；
[0012] 其中，所述的糖基转移酶为如SEQ ID NO. :61所示的糖基转移酶或其衍生多肽。
[0013] 在另一优选例中，所述的延伸糖链包括直接延伸或置换延伸。
[0014] 在另一优选例中，所述的直接延伸为在C-3和/或C-6位的第一个糖基上添加一 个糖基以延伸糖链。
[0015] 在另一优选例中，所述的置换延伸为将C-3和/或C-6位糖链的末端糖基置换成 不同的糖基，从在C-3和/或C-6位的第一个糖基上延伸糖链。
[0016] 在另一优选例中，所述的衍生多肽选自：
[0017] 将SEQ ID NO. :61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；或
[0018] 氨基酸序列与SEQ ID NO. :61氨基酸序列的同源性彡85% (较佳地彡90%、91%、 92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 % )，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
[0019] 其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3 和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
[0020] 在另一优选例中，所述的衍生多肽包括选自SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、72、74、 76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94 或 95 的任一所示序列。
[0021] 本发明第二方面，提供了一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：
[0022] (a)具有SEQ ID NO. : 61所示氨基酸序列的多肽；
[0023] (b)将SEQ ID NO. :61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多 肽；
[0024] (C)序列中含有（a)或（b)中所述多肽序列的衍生多肽；
[0025] (d)氨基酸序列与SEQ ID NO. :61氨基酸序列的同源性彡85% (较佳地彡90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)，并具有糖基转移酶活性的衍生多 肽；
[0026] 其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3 和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
[0027] 在另一优选例中，所述的序列（c)为由（a)或（b)添加了标签序列、信号序列或分 泌信号序列后所形成的融合蛋白。
[0028] 在另一优选例中，所述的衍生多肽包括选自SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、72、74、 76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94 或 95 所示氨基酸序列的多肽。
[0029] 在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组 的序列：
[0030] (A)编码权利要求3所述多肽的核苷酸序列；
[0031] (B)编码如SEQ ID NO. :61所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；
[0032] (C)如SEQ ID NO. :60所示的核苷酸序列；
[0033] (D)与SEQ ID NO. :6〇所示序列的同源性彡9〇% (较佳地彡91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%)的核苷酸序列；
[0034] (E)在SEQ ID NO. :60所示核苷酸序列的5'端和/或3'端截短或添加1-60个 (较佳地1-30,更佳地1-10个）核苷酸所形成的核苷酸序列；
[0035] (F)与（A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0036] 在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、 73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
[0037] 在另一优选例中，序列如 SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、 83、85、87、89、或91所示的多核苷酸编码氨基酸序列分别如SEQIDN0.:26、28、55、57、59、 61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94 或 95 所示的多肽。
[0038] 在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有第三方面所述的多核苷 酸。较佳地，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
[0039] 在本发明的第五方面，提供了本发明第一或第二方面所述分离的多肽的用途，它 被用于催化以下一种或多种反应，或被用于制备催化以下一种或多种反应的催化制剂：将 来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位或C6位的第一个糖基上以延伸糖 链；优选地，
[0040] 它被用于催化以下一种或多种体外反应，或被用于制备催化以下一种或多种反应 的催化制剂：
[0041] (i)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位的第一个糖基上， 延伸糖链；
[0042] (ii)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的第一个糖基上， 延伸糖链；
[0043] (iii)将来之糖基供体的糖基与四环三萜类化合物的C-6位糖链的末端糖基进行 置换，从在C-3和/或C-6位的第一个糖基上延伸糖链。
[0044] 在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的核苷二磷酸糖：UDP-葡萄糖， ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，⑶P-葡萄糖，UDP-乙酰基葡萄糖，ADP-乙酰基葡 萄糖，TDP-乙酰基葡萄糖，⑶P-乙酰基葡萄糖，⑶P-乙酰基葡萄糖，UDP-木糖，ADP-木糖， TDP-木糖，CDP-木糖，⑶P-木糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半 乳糖醛酸，⑶P-半乳糖醛酸，⑶P-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖， CDP-半乳糖，⑶P-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖， ⑶P-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，⑶P-鼠李糖，或其他 核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。
[0045] 在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的尿苷二磷酸（UDP)糖：UDP-葡 萄糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，或其他尿苷 二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。
[0046] 在另一优选例中，所述分离的多肽用于催化下述一种或多种反应或被用于制备催 化下述一种或多种反应的催化制剂：
[0047] (A)
[0048] CN 105177100 A 说明书 4/32 页
[0049] 其中，Rl为糖基；R2和R3为OH或者H ;R4为糖基或者H ;R5为糖基，R5-R1-0为 C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQ ID NO. :61所示的多肽或其衍生多肽；优 选地，选自 26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95或其衍生多 肽。
[0050] R1-R4经取代后的化合物如下表所示：
[0052] 即当Rl为葡萄糖基；R2为H，R3为0H，R4为H，式⑴化合物为Rh2。
[0053] Rl为葡萄糖基；R2为H，R3为0H，R4为葡萄糖基，式⑴化合物为F2。
[0054] 当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物（I)化合物为Rh2,则产物式（II)化合物 为Rg3 ;底物（I)化合物为F2,则产物式（II)化合物为Rd ;
[0055] 当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物（I)化合物为Rh2,则产物式（II)化合物为 3-〇-β-(D-xylopyranosyl)-P-(D-glucopyranosyl)-PPD ;底物（I)化合物为 F2,则产物 式（II)化合物为 3-〇-0-(D-xylopyranosyl)-0-(D-glucopyranosyl)-CK。
[0057] 其中，Rl和R2为H或者糖基，R3和R4为糖基。R3-R4-0为C6第一个糖基衍生的 糖基，所述的多肽选自SEQ ID NO. :61所示多肽或其衍生多肽，优选地，为SEQ ID NO. :55， 57, 59, 78,82,92,94或者95或其衍生多肽。
[0058] 当Rl和R2为H，R3为葡萄糖基时，式（III)化合物为Rhl。
[0059] 当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物（III)化合物为Rhl，则产物式（IV)化合 物为Rf ;
[0060] 当以UDP-鼠李糖作为糖基供体时，底物（III)化合物为Rhl，则产物式（IV)化合 物为Rg2。
[0062] 其中，Rl为糖基；R2和R3为OH或者H ;R4为糖基或者H ;R5为糖基，R5-R1-0为 C3第一个糖基衍生的糖基；R6为糖基，R6-R1-0为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽 选自SEQ ID NO. :61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQ ID NO. :26、28、59、76、84、86或88 所示的多肽。
[0063] Rl为两个葡萄糖基，R2为H，R3为0H，R4为H，式（V)化合物为Rg3。
[0064] Rl为两个葡萄糖基，R2为H，R3为0H，R4为葡萄糖基，式（V)化合物为Rd [0065]当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物（V)化合物为Rg3,则产物式（VI)化合物为 3-〇-β - (D_xylopyranosyl)-0 - (D-glucopyranosylJ-PFO ;底物（V)化合物为 Rd，则产物 式（VI)化合物为 3-〇-0-(D_xylopyranosyl)-0-(D-glucopyranosyl)-CK〇
[0066] 在另一优选例中，所述的糖基选自：葡萄糖基、半乳糖醛酸基、木糖糖基，半乳糖 基、阿拉伯糖基、鼠李糖基，以及其他己糖基或戊糖基。
[0067] 在另一优选例中，所述反应式（I)、或（III)化合物包括（但不限于）：S构型或R 构型的达玛烷型四环三萜类化合物、羊毛脂烷型四环三萜类化合物、apotirucallane型四 环三萜、甘遂烷型四环三萜类化合物、环阿屯烷（环阿尔廷烷）型四环三萜类化合物、萌芦 烷四环三萜类化合物、或楝烷型四环三萜类化合物。
[0068] 在另一优选例中，所述的多肽选自下组：
[0069] (a)具有 SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、 93、94或95中任一条所示氨基酸序列的多肽；
[0070] (b)将 SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、 93、94或95中任一条所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
[0071] (c)序列中含有（a)或（b)中所述多肽序列的衍生多肽；
[0072] (d)氨基酸序列与 SEQ ID NO :26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、 88、90、92、93、94或95中任一条中所示氨基酸序列的同源性多85%或多90%(较佳地 多95% )，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。
[0073] 在另一优选例中，编码所述多肽的核苷酸所述的多核苷酸为选自下组的序列：
[0074] (A)编码本发明第二方面所述多肽的核苷酸序列；
[0075] (B)编码如 SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、 92、93、94或95所示多肽的核苷酸序列；
[0076] (C)如 SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91 所示的核苷酸序列；
[0077] (D)与 SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或 91所示序列的同源性多85% (较佳地较佳地多90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99% )的核苷酸序列；
[0078] (E)在 SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91 所示核苷酸序列的5'端和/或3'端截短或添加1-60个（较佳地1-30,更佳地1-10个） 核苷酸所形成的核苷酸序列；
[0079] (F)与（A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补（较佳地完全互补）的核苷酸序列。
[0080] 在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、 73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
[0081] 在另一优选例中，序列如 SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、 83、85、87、89、或91所示的多核苷酸编码氨基酸序列分别如SEQIDN0.:26、28、55、57、59、 61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94 或 95 所示的多肽。
[0082] 在本发明的第六方面，提供了一种进行糖基转移催化反应的方法，包括步骤：在本 发明第二方面所述的多肽或其衍生多肽存在的条件下，进行糖基转移催化反应。
[0083] 在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
[0084] 在糖基供体以及如本发明第二方面所述多肽及其衍生多肽的存在下，或式（I)化 合物转化为所述的式（II)化合物，或式（III)化合物转化为所述的式（IV)化合物，或式 (V)化合物转化为所述的式（VI)化合物；
[0085] 在另一优选例中，所述的方法还包括将所述的多肽及其衍生多肽分别加入催化反 应；和/或
[0086] 将所述的多肽及其衍生多肽同时加入催化反应。
[0087] 在另一优选例中，所述的方法还包括将编码糖基转移酶的核苷酸序列与达玛稀二 醇和/或原人参二醇和/或原人参三醇合成代谢途径中的关键基因和/或其他糖基转移酶 基因在宿主细胞中共表达，从而获得所述的式（II)、（IV)、或（VI)化合物。
[0088] 在另一优选例中，所述的宿主细胞为酵母菌或大肠杆菌。
[0089] 在另一优选例中，所述的多肽为具有 SEQ ID NO. :26、28、55、57、59、61、72、74、76、 78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示氨基酸序列的多肽及其衍生多肽。
[0090] 在另一优选例中，编码所述多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. :25、27、54、56、58、 60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
[0091 ] 在另一优选例中，所述方法还包括：向反应体系中提供用于调节酶活性的添加物。
[0092] 在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添