人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光 标记复合扩增试剂盒及其应用，可应用于建库排查、亲权鉴定及DNA家谱构建等方面。
【背景技术】
[0002] STR遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由 2~6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序 列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通 过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
[0003] Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。 目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220多个，将已发现的Y染色体STR遗传 标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有 两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体 遗传多态性。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将 其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家 谱构建等。
[0004] 法医上将突变率高于1 %的基因座称为快速突变基因座（Rapidly Mutating Y-STR)。快速突变基因座具有较高的相关男性区分能力，而且一般具有较高的多态性，但基 因座突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排查。
[0005] 目前法医上利用Y-STR进行建库，主要功能是家系排查，缩小嫌疑人范围，而非认 定嫌疑人。在中国，特别是农村，主要是家族聚居的方式，在Y-STR建库的实际操作过程中， 往往只对一个大家族中一个或者几个成员进行采样建库，这样在花费较小的情况下就能利 用Y-STR快速缩小侦查范围，然后通过比对常染色体STR，对嫌疑人进行认定。由于Y-STR 建库米样的一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息，这就存在一种不利的情况：嫌 疑人属于此家系一员，但与建库对象Y-STR有3个或更多基因座分型不一致，此时容易将嫌 疑人所属的真实家系排除。如果建库试剂盒中快速突变基因座较多，那么这种可能性会变 得非常高。另一方面，由于Y-STR建库主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因 而快速突变基因座的优势在这里用处不大。所以，不建议在这种情况下使用快速突变率的 基因座。然而，低突变率基因座往往多态性较低，不利于家系之间的区分。因此，需要基因 座的数量要多，同时基因座的多态性要高，以保证Y-STR试剂盒具有足够高的整体多态性。
[0006] 目前，市面上主流试剂盒有 YfUer3i. ,YHkriO Plus、PowerPlex》' Y23、Goldeneye Y26、AG⑶Database Y24等荧光检测试剂盒（见表1)，基因座数量分别为17个、27个、23 个、26个、24个。法医学常用的Ymaf的基因座数量较少，累积个体识别率较低，Yffler働已 被确认在某些特定的人群中具有非常低的多态性。'Yfiler? Plus、PowerPtex? Y23分别含 有7个和2个快速突变基因座。AG⑶Database Y27拥有27个低突变率基因座，为市面上 基因座数量最多的Y-STR试剂盒之一，同时是5色荧光系统，相比同为27个基因座（6色荧 光系统）的Yfikr⑩Plus，应用门槛更低。相比AG⑶Database Y24,不仅基因座数量更多， 基因座Marker覆盖的等位基因范围更大，减少了等位基因越界的风险，而且其他方面的性 能也有较大改善。
[0007] 表1.市面上主流Y-STR荧光检测试剂盒
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【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增 试剂盒及其应用，该试剂盒具有高分辨率、低突变率的特点，能够满足Y-STR建库进行家系 快速排查的需求。
[0011] 本发明为实现上述目的，采用如下技术方案实现：
[0012] 通过对Y染色体STR基因座的基因多态性和突变率统计的研究，选择低突变率 (小于1 % )，同时多态性高的基因座，并综合考虑其他因素，最后筛选出DYS392、DYS389I/ II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/ b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、 DYS444、DYS643,共27个Y染色体STR基因座。
[0013] 首先针对上述27个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。 引物设计采用01ig〇7软件，每条引物Tm值接近60°C。扩增产物长度在75-500bp之间，对 每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形尖锐峰高正常的扩增峰。再经过复合扩增测 试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。引物序列、其对应编 号以及扩增系统中各条引物浓度见表2 :
[0014] 表 2. AGCU Database Y27 引物信息
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[0017] DYS389I 和 DYS389II、DYS527a 和 DYS527b、DYS385a 和 DYS385b 的扩增引物相同。
[0018] 根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方 法：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522 为第一组；DYS391、DYS456、 DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b 为第二组；DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、 DYS458 为第三组；DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643 为第四组。每组分 别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有 重叠。
[0019] 将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条 (例如，表2中引物序列编号为奇数的全部标记焚光，而编号为偶数的全部不标记焚光）， 标记在引物的5'端。蓝色标记可选择6-FAM(6-羧基荧光素）或相近光谱的荧光素分子， 绿色标记可选择HEX (六氯-6-甲基荧光素），或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选 择TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明）或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧 基-X-罗丹明）或相近光谱的荧光素分子。试剂盒设有内标，内标由一组大小固定且不同 的DNA片段组成，内标用SIZ作为橙色荧光标记物。将4组27个基因座复合扩增，根据产 物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30%以上。得到的引 物混合物可以用于上述27个基因座复合扩增。
[0020] Y染色体STR基因座的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用毛细管 电泳或聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳。聚合酶链式反应的扩增程序为：95°C 2min ;94°C 30S、 59°C lmin、72°C lmin，共 29 个循环；60°C 30min。
[0021] 本发明的荧光标记复合扩增试剂盒，不同基因座引物之间的相互干扰少，扩增特 异性和扩增灵敏度高；本发明的荧光标记复合扩增试剂盒具有较好的温度耐受性，使用不 同质量的PCR扩增仪均可获得较好的扩增结果。
[0022] 除了特异性的荧光引物，本试剂盒还包含表3所示的以下成份。
[0023] 表 3 :
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[0025] 本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测 试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。最终扩 增程序如下：
[0026] 95 〇C 2min ；
[0027] 94°C 30S，59°C lmin，72°C Imin 29 循环；
[0028] 60 °C 30min ；<