同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重pcr引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于本发明属于植物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用双重PCR 技术检测两种葡萄溃疡病菌的方法的建立及其应用。
【背景技术】
[0002] 由葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae)真菌引起的葡萄溃疡病（grape Botryosphaeria dieback)近年来在世界范围内危害日益加重，已经成为威胁葡萄品质和 产量的重要因素之一 (Pascoe I. Trunk diseases of grapevines-perspective from a tour of California. The Australian Grapegrower and Winemaker. 1998,417:68-71. Van Niekerk JM，Fourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp. as grapevine trunk disease pathogens. Phytopathologia Mediterranea. 2006, 45(4) :43-54. Urbez-Torres JR. The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines. Phytopathologia Mediterrianea. 2011，50:5-45.) D截至目前，报道显示在葡萄座腔菌科 中有17个种可引起葡萄溃疡病（Auger J，Esterio M，Ricke G，et al.Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv.Red Globe caused by Botryosphaeria obtusa in Chile. Plant Disease. 2004, 88 (11) : 1286. URbez-Torres J RjPeduto FjStriegler R K，et al. Characterization of fungal pathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri. Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler ff D.Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California. Plant Disease. 2009, 93(6):584-592.)〇 在我 国已发现并报道的葡萄溃疡病病原菌有Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum 和 Diplodia seriata 四个种(Li X Hj Yan J Yj Kong F Fj et al.Botryosphaeria dothidea causing canker of grapevine newly reported in China [J]. Plant Pathology. 2010, 59 (6) : 1170. Yan J YjPeng Y LjXie Y，et al.First Report of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeria obtusa in China [J]. Plant Disease. 2011, 95 (5) : 616. Yan J YjLi X HjKong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeria rhodina in China [J]. Plant Disease. 2011, 95 (2) : 219. Yan J Yj Xie Y，Zhang Wj et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diverisi ty. 2013, 61:221-236. )D 研究表明，在我国 Neofusicoccum parvum 主 要分布在亚热带季风气候区，Botryosphaeria dothidea则在温带季风气候区和亚热带 季风气候区均有分布，病原菌侵染葡萄后带来严重的损失（Yan J Y，Xie Y，Zhang W，et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diverisity. 2013, 61:221-236.) D 在实际生产中，葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) 和小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)两种病原菌常混合侵染，带来更为严重的损失。 [0003] 准确的早期诊断能够为病害有效防控提供依据。由于葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭抱（Neofusicoccum parvum)常混合侵染，且侵染 葡萄后引起的症状相似，很难区分，导致传统的早期诊断方法无法快速的得到准确结果。而 常规的分子生物学技术--聚合酶链式反应（Polymerase chain react ion, PCR)技术则 可以快速、准确的检测到微量病原菌的存在，已被广泛应用于动植物病害的诊断及病原菌 的鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一组能够用于同时检测两种葡萄溃疡病菌-葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭抱（Neofusicoccum parvum)的双重 PCR 引物以及 一种操作简便、结果可靠的上述两种葡萄溃疡病菌的双重PCR检测方法。
[0005] 基于上述发明目的，根据葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭 孢（Neofusicoccum parvum)EF延伸因子和β -tubulin序列上的差异位点，分别设计了上 述两种病原菌的特异性引物，通过对PCR反应程序、体系的反复摸索，建立了这两种病原 菌的双重PCR检测体系，能够将葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢 (Neofusicoccum parvum)快速准确的区分开来，对开展苗木带菌检测和葡萄园病原菌动态 监测具有重要意义。
[0006] 本发明所提供的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物，由序列表中序列1所示的核 苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示 的核苷酸组成。其能够同时用于检测葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭 抱（Neofusicoccum parvum)〇
[0007] 本发明的另一目的是提供一种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭抱（Neofusicoccum parvum)的试剂盒，包括所述 的双重PCR引物组。
[0008] 在本发明的一个技术方案中，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂；所述PCR反应试 剂包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、浓缩PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。其中，浓缩PCR缓冲液 即为 10XPCR缓冲液，是由 lOOmmol/L Tris-HCl ρΗ8· 3, 500mmol/L KCl，15mmol/L ]\%(：12组 成的溶液。
[0009] 上述双重PCR引物组以及包括该引物组的试剂盒在检测葡萄溃疡病菌中的葡萄 座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭抱（Neofusicoccum parvum)中的应用也 属于本发明的保护范围。所述的检测优选为同时检测。
[0010] 本发明还提供一种检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)的双重PCR检测方法，包括使用上述引 物扩增待测样品。所述扩增过程中还使用PCR反应试剂。PCR反应试剂可以从商业途径获 得，也可以自己配置。
[0011] 本发明的技术方案包括以下步骤：
[0012] 1)提取待测样品DNA，以该DNA为模板，用权利要求1所述的引物双重PCR扩增；
[0013] 2)鉴定步骤1)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个324bp的 DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)的样品， 将扩增产物中含有一个212bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)的样品。
[0014] PCR反应体系为25 μ L，包括：待测样品DNA(约5ng，终浓度(λ 2ng/ μ L)，d-F/ Β· d-R 和 Ν· p-F/N. p-R 引物（10 μ mol/L)各 0· 5 μ L (即终浓度为 0· 2 μ mol/L)，dATP、 dCTP、dGTP、dTTP 的终浓度均为 2. 5mmol/L，2. 5 μ L 10XPCR 缓冲液（lOOmmol/L Tris-HCl 口!18.3,500臟〇1/11((：1，15臟〇1/1]\%(：12)和0.25 4 1^了39 0嫩聚合酶（51]/^1^，添加终浓度 为0. 05U/ μ I)，其余部分用ddH20补足；
[0015] PCR 条件为：94°C预变性 4min ;30 个循环的 94°C 30s，58°C 30s 和 72°C 20s ;72°C 延伸5min〇
[0016] 步骤2)中所述鉴定步骤I)PCR扩增产物的大小的方法是取5 μ L PCR产物用质量 百分浓度为2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据有无扩增产物判 定结果。
[0017] 上述双重PCR引物可应用于检测引起葡萄溃疡病的病原菌Neofusicoccum parvum和Botryosphaeria dothidea，其中，本发明的双重PCR引物中的序列1和序列2能 够在葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)特异性的扩增出324bp的产物，序列3和序列 4能够在小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)特异性的扩增出212bp的产物。而且，本发明 的双重PCR