猪胞内劳森氏菌的lamp与pcr非诊断检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检 测方法。
【背景技术】
[0002] 猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于猪感染胞内劳 森氏菌引起的一种急性传染性肠道出血性的消耗性疾病，在1931年Bieste和Sohwarce首 次报道了该病，1974年Rowland等证实了该病，是当今世界上流行最广的猪病之一。虽然， 感染PPE引起的死亡率不高，但由于其主要发病为慢性，使得患病猪的生长缓慢，平均日增 重和饲料利用率明显下降，且淘汰率上升，给猪场造成了严重的经济损失。猪增生性肠炎是 近年来世界各国养猪的常见病，在养猪业发达的国家和地区，由于饲料中禁用或限用抗生 素，导致PPE发病率逐年上升。在我国，临床PPE疑似病例有逐渐增多的趋势，但我国对此 病的研究还处于起步阶段，缺乏对该病的整体掌握。
[0003] 虽然我国早已证实本病的存在，但我国对该病仍未有足够的认识，关于该病的研 究仍然比较薄弱，处于起始阶段。随着我国养猪业的养殖方式及规模的变化，该病对养猪业 的危害日趋严重，亟需对该病给与高度的重视，因此建立一种适用于基层、野外的快速、方 便、准确的检测方法显得尤为重要。
[0004] 目前，对猪增生性肠炎的诊断方法主要有用适宜的细胞系，如IEC-18大鼠肠细胞 或IPEC-12猪肠细胞来分离病原菌，或是利用PCR、组织病理学诊断及ELISA等技术对病 猪血清和粪便进行诊断。其中PCR是目前最常用的猪增生性肠炎活体诊断方法，它具有灵 敏度高、特异性好的特点，但是它所需的费用及对操作人员的技术、实验仪器设备的要求较 高。Elanco公司的FIRST试剂盒虽然能够快速、精准的检测粪便中胞内劳森氏菌的存在，但 是其成本昂贵，且未在中国上市。然而，环介导等温扩增（LAMP)作为一种崭新的DNA扩增 方法，具有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的特点，具有替代PCR方法的 可能性。本发明就使用LAMP、PCR方法检测PPE的反应体系和反应条件进行探讨，最终建立 快速检测PPE的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，设计一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与 PCR非诊断检测方法，能够简单有效的检测，用于快速诊断检测猪胞内劳森氏菌的感染，具 有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的特点，能够加快猪胞内劳森氏菌的检 测效率和减低成本，减少猪胞内劳森氏菌在猪养殖过程中造成的损失。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种猪胞内劳森氏菌的LAMP 与PCR非诊断检测方法，该方法通过在线软件，根据引物设计原理，针对胞内劳森氏菌 AM18025. 2. 1基因序列设计了 PCR和LAMP特异性引物，进行胞内劳森氏菌的LAMP与 PCR检测。通过对灵敏度试验、临床样本检测试验和复核检测试验进行对比，结果表明， 建立的LAMP方法灵敏度可达I. S^lOkopies/μ 1，而建立的PCR检测方法灵敏度仅为 I. 39xl04C〇pieS/μ 1，特异性和重复性检测结果表明，该两种方法均具有良好的特异性和 较高的重复性，表明建立的PCR方法和LAMP方法简便、快速、准确，可以用于猪胞内劳森氏 菌的临床检测。
[0007] 本发明中，针对胞内劳森氏菌AM18025. 2. 1基因序列设计和筛选2对LAMP引物， 分别是内引物FIP和BIP、外引物F3和B3 ;FIP由F2和Flc构成，Flc与Fl互补；BIP由B2 和Blc构成，Blc与Bl互补；
[0008] 特异性扩增引物包括以下引物：
[0011] 本发明中根据Genbank上已发表的猪胞内劳森氏菌特异性序列（登录号：gb/ AM18025. 2. 1)，设计一对特异性引物扩增一段329bp的目的片段。LAMP技术稳定性的 关键因素在于2对特异性引物，根据LAMP引物设计原理，本试验采用Primer Explorer V4(http://primerexplorer. jp/e/)在线软件，针对胞内劳森氏菌AM18025. 2· 1基因序列 设计和筛选2对LAMP引物。所有引物经BLAST序列分析，由上海生工生物工程股份有限公 司合成，按合成说明书进行引物稀释，_20°C保存备用。
[0012] 优选的，LAMP 检测的反应体系为 25μ1 :MgCl2(25mM)4yl，ThermoPol buffer(10x)2· 5 μ 1，甜菜碱（8Μ)2· 5 μ l，dNTP(10mM) I. 5 μ l，Bst DNA 聚合酶（8U) 1 μ 1，内 引物 FIP (50 μ Μ)、BIP (50 μ Μ)各 1 μ I，外引物 F3 (5 μ Μ)、Β3 (5 μ Μ)各 0· 5 μ I，质粒 DNA 模 版1 μ 1，加 ddH20补至25 μ I ;反应温度为63°C，反应时间为50min，80°C终止反应10min ;将 反应产物经过1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，通过是否产生清晰的条带判断是否含有猪胞内劳 森氏囷。
[0013] 优选的，PCR 检测方法中，PCR 反应条件为：94°C 5min ;93°C 45s、57°C 45s、 72°C 45s、35个循环；72°C IOmin终止反应。
[0014] 本发明的优点和有益效果在于：
[0015] 猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，能够简单有效的检测，用于快速 诊断检测猪胞内劳森氏菌的感染，具有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的 特点，能够加快猪胞内劳森氏菌的检测效率和减低成本，减少猪胞内劳森氏菌在猪养殖过 程中造成的损失。
[0016] 试验结果表明，本发明建立的LAMP方法灵敏度可达I. SgxlOkopies/y 1，而建立 的PCR检测方法灵敏度仅为I. 39X104c〇pieS/ μ 1，特异性和重复性检测结果表明，该两种 方法均具有良好的特异性和较高的重复性，表明建立的PCR方法和LAMP方法简便、快速、准 确，可以用于猪胞内劳森氏菌的临床检测。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例中PCR引物验证结果，其中M:DNA相对分子质量标准DL500 ; 1 :阳性对照；2 :阴性对照。
[0018] 图2是本发明实施例中LAMP引物验证结果，其中M:DNA相对分子质量标准DL500 ; 1 :阳性对照；2 :阴性对照。
[0019] 图3是本发明实施例中LAMP反应温度的优化结果，其中M :DNA相对分子质量标准 DL500 ;1 :60°C扩增产物；2 :61°C扩增产物；3 :62°C扩增产物；4 :63°C扩增产物；5 :64°C扩 增产物；6 :65°C扩增产物；7 :阴性对照。
[0020] 图4是本发明实施例中LAMP反应时间的优化结果，其中M :DNA相对分子质量标准 DL500 ;1 :反应30分钟扩增产物；2 :反应40分钟扩增产物；3 :反应50分钟扩增产物；4 :反 应60分钟扩增产物；5 :阴性对照。
[0021] 图5是本发明实施例中内外引物浓度比例的优化结果，其中M :DNA相对分子质量 标准DL500 ;1 :外引物/内引物为1 :1 ;2 :外引物/内引物为1 :2 ;3 :外引物/内引物为1 : 4 ;4 :外引物/内引物为1 :6 ;5 :外引物/内引物为1 :8 ;6 :外引物/内引物为1 :10 ;7 :外 引物/内引物为1 :12 ;8 :外引物/内引物为1 :14。
[0022] 图6是本发明实施例中dNTP浓度的优化结果，其中M :DNA相对分子质量标准 DL500 ;1 :dNTP 终浓度为 0. 3mM ;2 :dNTP 终浓度为 0. 4mM ;3 :dNTP 终浓度为 0. 5mM ;4 :dNTP 终浓度为〇. 6mM ;5 :dNTP终浓度为0. 7mM ;6 :dNTP终浓度为0. 8mM。
[0023] 图7是本发明实施例中Mg2+浓度的优化结果，其中M :DNA相对分子质量标准 DL500 ; I :Mg2+ 终浓度 2mM ;2 :Mg2+ 终浓度 3mM ;3 :Mg2+ 终浓度 4mM ;4 :Mg2+ 终浓度 5mM ;5 : Mg2+终浓度6mM ;6 :Mg2+终浓度7mM ;7 :阴性对照。
[0024] 图8是本发明实施例中反应中甜菜碱的作用验证结果，其中M :DNA相对分子质量 标准DL500 ;1 :反应体系中加入0 μ 1的甜菜碱；2 :反应体系中加入0. 5 μ 1的甜菜碱；3 :反 应体系中加入1. 5 μ 1的甜菜碱；4 :反应体系中加入2. 5 μ 1的甜菜碱；5 :反应体系中加入 3. 5 μ 1的甜菜碱；6 :反应体系中加入4. 5 μ 1的甜菜碱。
[0025] 图9是本发明实施例中胞内劳森氏菌LAMP检测确立图，其中M :DNA相对分子质量 标准DL500 ;1 :LAMP反应产物；2 :阴性对照产物。
[0026] 图10是本发明实施例中胞内劳森氏菌LAMP可视化检测结果：A为浑浊度检测，B 为SYBR Green I荧光染料检测；其中I :LAMP阳性反应产物；2 :阴性对照。
[0027] 图11是本发明实施例中PCR退火温度的优化检测结果；其中M :DNA相对分子质量 标准 DL500 ;1 :52Γ ;2 :53Γ ;3 :54Γ ;4 :55Γ ;5 :56Γ ;6 :57Γ ;7 :58Γ ;8 :5%~。
[0028] 图12是本发明实施例中胞内劳森氏菌的灵敏度试验结果，其中A为胞内劳森氏菌 LAMP灵敏度试验，B为胞内劳森氏菌PCR灵敏度试验；其中M :DNA相对分子质量标准DL500 ; 1:1.39叉106拷贝；2:1.39叉10 5拷贝；3:1.39叉104拷贝；4 :1.39叉103拷贝；5:1.39叉102拷贝； 6 :1. 39X101拷贝；7 : L 39x10 °拷贝；8 :阴性对照。
[0029] 图13是本发明实施例中特异性试验结果，其中A为L