检测腹地病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测腹地病毒的实时荧光定量 RT-PCR(逆转录PCR)检测试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 腹地病毒（Hearstlands Virus)属于布尼亚病毒科腹地病毒组成员，最近被分到 白蛉病毒属中。该病毒于2012年在两名密苏里州的公民因为发烧和头痛而住院就诊时，这 种传染病才被第一次记述。人和家畜可被携带有该病毒的蜱虫叮咬而感染，出现中枢神经 系统症状，不但造成人类疾病和死亡，更会造成家畜死亡，导致经济损失，引起公共卫生问 题。
[0003] 目前，腹地病毒检测的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长、 实验条件要求高、在实际工作中难以推广应用。近年来应用广泛的常规核酸扩增及实时荧 光定量PCR在病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，鉴于蜱虫样本中病原载量较低等原 因，建立一种快速、灵敏的检测技术，更利于蜱中载量较低的病毒检测。
【发明内容】
[0004] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测腹地病毒的引物对和核 酸序列；本发明还提供一种用于检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方 法。本发明利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，建立一种快速、敏感的检测方法，应用于腹 地病毒的监测检测。
[0005] 本发明采用以下技术方案：
[0006] -种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列如 序列表中序列1和序列2所示。
[0007] -组检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作 为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和序列表中序列2所 示，所述探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述作为阳性对照的扩增产物包含有 如序列表中序列4所示的核苷酸序列。
[0008] -种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒主要包括该试剂盒 包括：2XRT-PCR反应液、25XRT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探针、阴性对照和阳 性对照；具体组成如下：
[0009] 2 X RT-PCR 反应液（2 X RT-PCR buffer);
[0010] 25 X RT-PCR 酶混合液（25 X RT-PCR Enzyme Mix);
[0011] 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0012] 下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0013] 探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探针的5 '端连接荧光基团，3 ' 端连接淬灭基团；
[0014] 阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
[0015] 阳性对照：包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。
[0016] 如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3中任意一种，所述淬灭基团 为BHQl、TAMARA和BHQ2中任意一种。
[0017] -种利用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法检测腹地病毒的非诊断性方法， 该方法包括以下步骤：
[0018] (1)从样品中提取病毒RNA ;
[0019] (2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制： I X RT-PCR 反应液（I X RT-PCR Buffer)，I X RT-PCR 酶混合液（I X RT-PCR Enzyme Mix)， 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所 示；探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探针5 '端连接荧光基团，3 '端连接淬 灭基团；上下游引物和探针浓度为〇. 01~1 μΜ，样品RNA ;同时设置无核酸酶灭菌超纯水 为阴性对照；
[0020] 实时荧光RT-PCR反应程序：
[0022] (3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3~15个循环 的荧光信号，以阈值线超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
[0023] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判 断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明建立了比较高效、灵敏的腹地病毒的快速检测方法，提供实时荧光RT-PCR 检测试剂盒。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病毒分 离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的 污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。本发明的检测试剂盒最低检出限为14. 9Χ 10 1Vg/ μ L0
【附图说明】
[0026] 图1为腹地病毒普通PCR检测的电泳图。
[0027] 图2为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增曲线。
[0028] 图3为腹地病毒荧光定量PCR特异性扩增曲线。
[0029] 图4为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增标准曲线。
[0030] 图5为利用本发明试剂盒对样品的检测结果。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的 实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说 明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发 明的保护范围。
[0032] 实施例1 :普通PCR检测腹地病毒
[0033] 在本发明引物和探针设计中，筛选腹地病毒S基因片段的保守序列，设计一对寡 聚核苷酸序列（引物）和探针，利用引物可特异地扩增腹地病毒的S基因片段，引物扩增片 段大小为113bp，核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0034] 序列 4 :
[0035] GTGAGAGCAAATACAATGATGTACTTCACATCATTCCTCCAGTTCTCACCCCCCCTCTCACGAAGCAGC CCAAAGATCACAGCAGGATCCAGGCCCTCATAAGCTATCTCCT。
[0036] 设计的引物和探针如下：
[0037] HRTV-F (序列表中序列 1) :5，-GTGAGAGCAAATACAATGA-3，
[0038] HRTV-R(序列表中序列 2) :5，-AGGAGATAGCTTATGAGG-3，
[0039] HRTV-FAM(序列表中序列 3) :5' -TCACATCATTCCTCCAGTTCTCACC-3'
[0040] 应用设计的引物对腹地病毒进行普通PCR扩增，采用25 μ L反应体系： HRTV-F、HRTV-R 引物终浓度各为 0. 4Χ 103nmol/L ;Mg2+终浓度 2mmol/L ;dNTP 终浓度为 0.8 X IO6 μ mol/L;l X RT-PCR 反应液（IX RT-PCR Buffer) ;Taq 聚合酶用量 1 单位（unit)， 模板2 yL。
[0041 ] PCR扩增反应条件为：
[0042] 95°C预变性3分钟，接着进行循环反应：95°C变性30秒，49°C退火30秒，72°C延伸 30秒，共进行40个循环；最后72°C延伸10分钟；
[0043] 对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为携带有如序列表序 列4所示序列的质粒DNA，起始浓度为14. 9X10 3ng/μ L，并按10倍比进行梯度稀释。结果 如图1所示，可以看到所设计的引物可有效扩增腹地病毒。
[0044] 实施例2 :腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的制备
[0045] 腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括以下成分：
[0046] 2 X RT-PCR 反应液（2 X RT-PCR Buf fer);
[0047] 25 X RT-PCR 酶混合液（25XRT-PCR Enzyme Mix);
[0048] 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0049] 下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0050] 探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示；
[0051] 阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
[0052] 阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如序列表中 序列4所示。
[0053] 其中，所述2XRT-PCR反应液和25XRT-PCR酶混合液可选用ABI公司 AgPath-IDTM One-stepRT-PCR Kit;引物、探针、质粒委托上海英骏生物技术有限公司合 成，探针在合成时探针5 '端连接FAM荧光基团和3 '端连接BHQl淬灭基团。
[0054] 实施例3 :腹地病毒实时荧光RT-PCR检测的方法
[0055] 本发明检测腹地病毒方法包括以下步骤：
[0056] (1)病毒RNA提取
[0057] 病毒RNA提取可选用QIAamp Viral RNA提取试剂盒进行提取。
[0058] (? RT-PCR 扩增
[0059] 采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。
[0060] 表1反应体系
[0065] (3)收集荧光信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3~15个循环的荧光信 号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
[0066] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判 断为阳性，即样品中含有腹地病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。<