一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号实时荧光pcr的dpo引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号实时荧光 PCR的DPO引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 葡萄卷叶病毒病（Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV)是仅次于葡萄 扇叶病毒病的一种世界性葡萄病毒病，在国内分布也较为普遍，田间感病率较高，对葡萄产 量和品质影响很大，且引起该病的病毒是由多种病毒单独或复合侵染造成。现已报道的葡 萄卷叶伴随病毒有11种，分别为GLRaV-I~9、GLRaV-Dr和GLRaV-De，我国已明确鉴定的 葡萄卷叶伴随病毒种类共有6种，即GLRaV-I~5和GLRaV7。GLRaV已被证明属于典型的 Clostero病毒，仅在韧皮部和叶片存在，其传播不是靠机械，通常是靠感染的母株或接穗等 繁殖材料。GLRaV具有半潜隐性，对葡萄的生长发育有显著影响，通常会导致葡萄植株的生 长衰弱、果实成熟延迟、果粒大小不均、着色不良、含糖量减少和产量下降。
[0003] 目前，检测葡萄卷叶病毒的方法主要基于PCR的方法。但传统引物存在特异性 不强、容易出现加阳性等缺点，而且传统PCR的结果判断需要电泳，增加了检测所需的时 间。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独 立的特异性引物区域，5'端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序列由 6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤 (Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形 成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究 表明5'和3'引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。
[0004] SYBR Green I是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双 链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特 异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBR Green I这一特性建立的实时荧光PCR在 植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物包含两个各 自独立的特异性引物区域，5'端序列由18~25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序 列由6~12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次 黄嘌呤（Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次 黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构， 而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病 毒3号的DPO引物。
[0006] 本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的DPO引物 由SEQ ID No. 1所示的单链DNA分子和SEQ ID No. 2所示的单链DNA分子组成。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随 病毒3号的实时焚光PCR试剂。
[0008] 本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的实时荧 光PCR试剂包括上述DPO引物。
[0009] 上述实时荧光PCR试剂中，所述引物1和所述引物2在所述实时荧光PCR试剂中 的终浓度均为〇· 4 μ mol/L〇
[0010] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随 病毒3号的试剂盒。
[0011] 本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的试剂盒 包括上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂。
[0012] 本发明还有一个目的是提供上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒 的新用途。
[0013] 本发明提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助 检测葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。
[0014] 本发明还提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在制备检测 或辅助检测葡萄卷叶伴随病毒3号产品中的应用。
[0015] 本发明还提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅 助检测待测样品是否感染葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。
[0016] 本发明还提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在制备检测 或辅助检测待测样品是否感染葡萄卷叶伴随病毒3号产品中的应用。
[0017] 本发明还提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅 助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。
[0018] 本发明还提供了上述DPO引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在制备检测 或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的产品中的应用。
[0019] 本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴 随病毒3号的方法。
[0020] 本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的方法包 括如下步骤：
[0021] 用上述DPO引物对待测病毒进行实时荧光PCR，并根据所述实时荧光PCR的扩增曲 线图分析其Ct值大小；
[0022] 若所述实时荧光PCR有荧光信号且Ct值小于等于35且大于0,则所述待测病毒为 或候选为葡萄卷叶伴随病毒3号；
[0023] 若所述实时荧光PCR无荧光信号或有荧光信号且Ct值大于35,则所述待测病毒不 为或候选不为葡萄卷叶伴随病毒3号。
[0024] 上述方法中，所述实时荧光PCR的模板为待测病毒的cDNA。
[0025] 上述方法在检测或辅助检测葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用也属于本发明的保 护范围。
[0026] 本发明根据葡萄卷叶伴随病毒3号的HSP 70基因保守序列设计了特异性DPO引 物，并将该特异性DPO引物和基于SYBR Green I的实时荧光PCR技术相结合，建立了一种葡 萄卷叶伴随病毒3号的检测方法。通过实验证明：本发明的DPO引物特异性强、灵敏度高， 而且运用本发明的葡萄卷叶伴随病毒3号的检测方法可以准确、简便和快速的检测葡萄卷 叶伴随病毒3号，对进出口相关货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意义。
【附图说明】
[0027] 图1为葡萄卷叶伴随病毒3的实时荧光PCR的特异性检测。其中，1 :葡萄卷叶伴 随病毒3号；2 :葡萄卷叶伴随病毒2号；3 :沙地葡萄茎痘伴随病毒；4 :葡萄斑点病毒；5 :葡 萄病毒A ;6:阴性对照。
[0028] 图2为葡萄卷叶伴随病毒3的实时荧光PCR的灵敏度检测。1-5分别为稀释度为 10°、10 \ 10 2、10 3、10 4的葡萄卷叶伴随病毒3的cDNA模板。
[0029] 图3为普通PCR灵敏度的检测。1-5分别为稀释度为KAlO1UO'10 3、10 4的葡 萄卷叶伴随病毒3的cDNA模板。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 下述实施例中的葡萄卷叶伴随病毒3号（Grapevine leafroll-associated virus 3)在文献"王仲，刘命华，李捷，李明骏，程玉琴.3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测 [J].中国果树，2012, 04:43-46. "中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。
[0033] 下述实施例中的葡萄卷叶伴随病毒2号（Grapevine leafroll-associated virus 2)在文献"赵静静，乾义柯，颉超，郭庆元，胡白石，陆平.引起葡萄黄化类症状的病毒 和类病毒RT-PCR检测[J].新疆农业科学，2015, 06:1099-1104"中公开过，公众可从伊犁 出入境检验检疫局获得。
[0034] 下述实施例中的沙地葡萄莖痘伴随病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus)、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus)及葡萄病毒 A (Grapevine virus A)均在文献"梁巧玲，乾义柯，张娜，陆平，刘绪斌.新疆三种葡萄病毒RT-PCR 检测及序列分析[J].植物保护学报，2015, 03:376-381. "中公开过，公众可从伊犁出入境 检验检疫局获得。
[0035] 实施例1、检测葡萄卷叶伴随病毒3号的DPO引物及试剂盒
[0036] 一、DPO引物的设计
[0037] 根据葡萄卷叶伴随病毒3号的HSP 70基因，设计了检测葡萄卷叶伴随病毒3号的 DPO引物，扩增片段大小为115bp，引物由上海生工生物技术有限公司合成。具体序列如下：
[0038] 上游引物 PF-F :5' -ATGGACACTGCGGAGTTGGCIIIIICATTGAGG-3'(序列 1);
[0039] 下游引物 PF-R :5' -TCATGAGAGCACTCTGAGATTTGTCIIIIITACTGATA-3'(序列 2);
[0040] 其中，I为次黄嘌呤。
[0041] 二、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的检测试剂盒及其使用方法
[0042] I、RNA的提取及cDNA的合成
[0043] 参照试剂盒操作（植物总RNA提取试剂盒，货号为DP432,天根生物科技有限公 司）提取感染了