，将该序列连接在引物的末端。其中半巢式 PCR的第一轮两个PCR引物中的一条是Alu靠近5'端的共有序列（AluTC)，另一条是能退 火到Alu的3'端基因组序列的随机碱基引物（SeedPrimer), SeedPrimer的5'端含有测 序平台的引物序列，而3'端含有5个铺定喊基并且紧邻着5个随机喊基（铺定喊基目的 是为了增加引物退火的特异性，根据5mer碱基在基因组上出现的频率统计出8条出现 频率最高的序列命名为SeedPl-8)。半巢式PCR第二轮用到的两个PCR引物中的一条是 PrimerAluGA，如图1所示，PrimerAluGA的3'端能退火到Alu元件上，并且靠近Alu的3' 端序列，PrimerAluGA的5'端包含测序平台的引物序列。第二轮PCR另一条引物PE1. 0使 用测序平台公用引物。
[0034] 1.根据引物设计原则，以illumina测序平台为例，进行引物设计。引物序列如下 (SEQ ID NO. 1-11)：
[0035]
[0036] 下划线表不针对Illumina测序平台相关序列设计的引物序列；粗体表示针对Alu 共有序列设计的引物序列；N表示随机碱基。
[0037] 使用人淋巴细胞（炎黄1号）DNA样品作为实验材料，先用AluTC和8条带有5个 随机喊基和5个喊基铺定序列的引物（Seedl-8)对DNA样品的基因组进彳丁扩增。
[0038] 按照如下体系配置8个相同的反应混合液。
[0039]
[0047] 2.完成步骤1的PCR后用磁珠进行纯化
[0048] 加入 90ul AMPure XP beads (BeckmanCoulter)至 50ulPCR 产物，混匀后加入到新 的1. 5ml离心管中，室温孵育5min。
[0049] 离心管置于磁力架上，2min后弃上清，加入200ul 80%乙醇（保持离心管在磁力 架上）洗涤，30s后弃上清，重复该步骤一遍。室温放置干燥。
[0050] 加入35ul洗脱缓冲液（Qiagen)，室温孵育5min后用磁力架吸附磁珠2min，取上 清置于新的离心管中。
[0051] 3.纯化产物用PrimerAluGA和PEL 0公共引物进行扩增。
[0054] PCR 程序：
[0055] 95 °C 2min ；
[0056] 2〇个循环：
[0058] 扩增产物进行4. 2%琼脂糖凝胶电泳120V，50min，选取200-500bp片段切胶回收。 使用QiagenGelExtractionkit纯化回收胶，纯化后做TA克隆。由于PCR反应使用的聚合 酶具有末端转移的活性，会在3'端加上碱基"A"，把PCR片段与一个具有3' -T的载体DNA 连接转化，便可获得单克隆。选取7个单克隆进行Sanger测序验证，即按照3730测序仪 的操作说明进行测序，获得DNA序列。
[0059] 结果：7个克隆进行Sanger测序后，其中有6个均含有Alu元件。
[0060] 其中6个克隆（seq-Ι至seq-6)序列如下：
[0073] 去掉两端的引物序列后取中间的Alu序列比对到Alu的数据库dbRIP和R印Base， 找到这些序列的子家族如下 ：
[0074]
[0075] 由TA克隆和Sanger测序结果证明，本发明的方法的确能够捕获到各个子家族的 Alu元件，并且捕获到Alu的特异性非常高，随机选取7条序列其中6条序列均为Alu元件。
[0076] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一个具体实施方案"、"示例"、"具 体示例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或 者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表 述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在 任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0077] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种利用半巢式PCR特异性地捕获Alu子家族序列的方法，所述方法包括：利用第 一至第四引物进行半巢式PCR扩增，其中第一轮PCR的引物是第一引物和第二引物，第二轮 PCR的引物是第三引物和第四引物，所述第一至第四引物是， (1) 第一引物，针对Alu共有序列的5'端基因组序列进行设计，其中所述共有序列在 15bp以上，并且具有一定的碱基复杂度和40% -60 %的GC含量； (2) 第二引物，能退火结合到Alu共有序列的3'端基因组序列的随机碱基引物，该引物 5'端含有测序平台的引物序列，而3'端含有5个锚定碱基并且紧邻着5-6个随机碱基； (3) 第三引物，所述引物的3'端能退火到Alu共有序列上，并且靠近Alu共有序列的 3'端序列，所述引物的5'端包含测序平台的引物序列； (4) 第四引物，测序平台公用引物，所述引物连接有测序平台的接头序列。2. 如权利要求1所述的方法，所述测序平台为高通量测序平台。3. 如权利要求2所述的方法，所述高通量测序平台选自Illumina HiSeq2000、 HiSeq2500、MiSeq、MiSeqDx、NextSeq500、Hiseq X ten、Life SOLiD、Ion Torrent PGM、 Proton、Roche 454和单分子测序平台中的至少一种。4. 如权利要求1-3所述的任一种方法，所述第一引物是SEQ ID NO. 1，或与其有80%以 上，优选90 %以上，更优选95 %以上的序列同一性的序列。5. 如权利要求1-4所述的任一种方法，所述第二引物选自SEQ ID NO. 2-9,或与其有 80 %以上，优选90 %以上，更优选95 %以上的序列同一性的序列。6. 如权利要求1-5所述的任一种方法，所述第三引物是SEQ ID NO. 10,或与其有80% 以上，优选90 %以上，更优选95 %以上的序列同一性的序列。7. 如权利要求1-6所述的任一种方法，所述第四引物是SEQ ID NO. 11，或与其有80% 以上，优选90 %以上，更优选95 %以上的序列同一性的序列。8. 用于特异性地捕获Alu子家族序列的半巢式PCR引物，所述引物包括： (1) 第一引物，针对Alu共有序列的5'端基因组序列进行设计，其中所述共有序列优选 在15bp以上，并且优选具有一定的碱基复杂度和40% -60 %的GC含量； (2) 第二引物，能退火结合到Alu共有序列的3'端基因组序列的随机碱基引物，优选该 引物5'端含有测序平台的引物序列，而3'端含有5个锚定碱基并且紧邻着5-6个随机碱 基； (3) 第三引物，所述引物的3'端能退火到Alu共有序列上，并且靠近Alu共有序列的 3'端序列，所述引物的5'端包含测序平台的引物序列； (4) 第四引物，测序平台公用引物，所述引物连接有测序平台的接头序列； 所述第一引物优选是SEQ ID NO. 1，或与其有80%以上，优选90%以上，更优选95%以 上的序列同一性的序列； 所述第二引物优选选自SEQ ID N0.2-9,或与其有80%以上，优选90%以上，更优选 95%以上的序列同一性的序列； 所述第三引物优选是SEQ ID NO. 10,或与其有80%以上，优选90%以上，更优选95% 以上的序列同一性的序列。 所述第四引物优选是SEQ ID NO. 11，或与其有80%以上，优选90%以上，更优选95% 以上的序列同一性的序列。9. 如权利要求8所述的半巢式PCR引物，所述测序平台为高通量测序平台。10. 如权利要求9所述的半巢式PCR引物，所述高通量测序平台选自Illumina HiSeq2000、HiSeq2500、MiSeq、MiSeqDx、NextSeq500、Hiseq X ten、Life SOLiD、Ion Torrent PGM、Proton、Roche 454和单分子测序平台中的至少一种。
【专利摘要】本发明提供了一种新的方法，根据Alu绝大多数子家族(除了AluYd3、AluYd3a1、AluJo和AluJb这四个含量低于1％并且在基因组中不活跃的子家族之外，余下的Alu子家族，覆盖达99％以上)共有序列设计引物，利用半巢式PCR特异性地捕获到几乎全部Alu子家族的序列。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105524982
【申请号】CN201410513148
【发明人】徐礼钦, 李贵波, 蒋润泽, 何家伟
【申请人】深圳华大基因科技有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月29日