一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法。
【背景技术】
[0002] 树突状细胞(Dendritic Cell，DC)对于激发和维持T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应 至关重要。然而，肿瘤可通过削弱DC细胞功能从而逃避免疫系统的杀伤作用。有研究表明DC 细胞内的内质网压力感受因子XBP1的激活导致DC细胞抗肿瘤免疫活性降低，最终导致肿瘤 的进展。XBP1可调控DC细胞内的脂质代谢，脂质过氧化反应的副产品可以激发DC细胞内三 酰甘油的生物合成反应，导致异常的脂质堆积，最终抑制DC的功能，不能有效激发出抗肿瘤 活性的T细胞。因此，若能有效抑制DC细胞内XBP1基因的表达，将为肿瘤的靶向治疗提供有 效的途径。
[0003] 目前抑制DC细胞内XBP 1基因的表达是采用传统siRNA法对XBP 1基因进行抑制，但 是只能抑制大约50%的XBP1基因表达，抑制效率较低。因此，如果能找到一种新的抑制DC细 胞内XBP1基因表达方法将有重要的生物学和医学意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种DC细胞中XBP1基因的敲除 方法，旨在解决DC细胞中由于XBP1基因的存在并被激活而导致DC细胞抗肿瘤免疫活性降低 的不利现象。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种DC细胞XBP1基因敲除方法。本发明实 施例DC细胞XBP1基因敲除方法包括如下步骤：
[0006] 以内质网压力感受因子XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计，并根据所述 CRISPR靶向序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0007] 将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应处理形成双链寡核 苷酸；
[0008] 酶切pCas9/gRNAl载体获得线性化载体；
[0009] 将所述双链寡核苷酸与所述线性化载体在连接反应体系中进行连接反应处理，获 得连接产物；
[0010] 将所述连接产物转化感受态细胞，并将被转化后的细胞进行扩大培养后进行质粒 提取处理，获得pCas9/gRNAl -XBP1质粒；
[0011]与现有技术相比，本发明DC细胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系 统，以XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计并制备出pCas9/gRNAl-XBPl质粒，使其对DC 细胞进行转染，从而能高效的敲除DC细胞内的XBP1基因，从而有效保证了DC细胞的免疫刺 激作用，有效发挥了 DC细胞抗肿瘤免疫作用。
[0012] 进一步地，通过向转染培养体系中还加入L189试剂，该L189试剂能够与CRISPR/ pCas9基因敲除系统发挥增效作用，显著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系统敲 除XBP1基因的效率。
【附图说明】
[0013]图1为改进CRISPR/Cas9系统作用原理示意图；
[0014] 图2为pCAS9/gRNAl质粒载体图谱；
[0015] 图3为实施例2、3中NC-DC、XBP1 -DC和XBP1 /LI 89-DC三组DC细胞中XBP1基因的表达 水平柱状图；
[0016] 图4为NC-DC-T、XBP1-DC-T和XBP1/L189-DC-T三种DC-T细胞对RB视网膜母细胞瘤 细胞的杀伤效率图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0018] 本发明实施例提供了一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法。在一实施例中，该本 发明实施例DC细胞XBP1基因敲除方法包括如下步骤：
[0019] 步骤S01.基因敲除靶点和寡核苷酸设计：以内质网压力感受因子XBP1为靶基因进 行CRISPR靶向序列设计，并根据所述CRISPR靶向序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷 酸序列；
[0020] 步骤S02.寡核苷酸退火反应处理:将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列 进行退火反应处理形成双链寡核苷酸；
[0021 ]步骤S03.酶切线性化载体:酶切PCas9/gRNAl载体获得线性化载体；
[0022]步骤S04.线性化载体与双链寡核苷酸连接反应:将步骤S02中获得的双链寡核苷 酸与步骤S03中获得的所述线性化载体在连接反应体系中进行连接反应处理，获得连接产 物；
[0023]步骤S05.转化感受态细胞:将步骤S04中获得的所述连接产物转化感受态细胞，并 将被转化后的细胞进行扩大培养后进行质粒提取处理，获得pCas9/gRNAl-XBPl质粒；
[0024] 步骤S06.DC细胞XBP1基因敲除：将所述pCas9/gRNAl-XBPl质粒对DC细胞进行转染 培养处理。
[0025] 具体地，上述步骤S01中的CRISPR靶向序列设计是以基于CRISPR/pCas9基因敲除 系统。
[0026]其中，该CRISPR/pCas9基因敲除系统中的CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重 复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 〇CRISPR/Cas是在 大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。 CRISPR/Cas系统首先产生与靶标序列对应的RNA序列，与病毒或质粒的DNA进行互补作用， 然后引导Cas内切酶对互补的序列进行双链切割。其中Cas基因家族中的Cas9广泛地应用于 该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有两个酶切活性结构域:HNH核酸酶结构域和 Ruv-Clike结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过程需要另外两个RNA的帮助，分别为 CRISPR RNA(crRNA)和反式CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA，tracrRNA)，人们已经 将这两种RNA改造融合成一个向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，单个sgRNA足以帮助 Cas9实现定点切割的效果。
[0027] 经过人工改造的CRISPR/Cas系统一般分为两种，一种主要由Cas9、tracrRNA和 crRNA三部分构成；另一种主要由Cas9和sgRNA两部分构成。载体的构建过程简便快捷，仅需 人工合成一段和靶标序列相同的序列，连接至载体特定位点即可，具有高通量高效率的特 点。
[0028] CRISPR/Cas9系统作用原理如图1所示，其平台是从化脓链球菌（Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系统优化而来，由SpCas9核酸酶和gRNA构成。其中SpCas9核酸酶识 别基因组中的PAM(Protospacer adjacent motif ,ΡΑΜ)序列，gRNA中的长约20bp的引导序 列决定革G向特异性。当基因组上位于PAM5'端的前体间隔序列(Protospacer)与gRNA中的引 导序列互补时，Cas9核酸酶启动对DNA双链进行切割，形成DNA双链断裂缺口（Double-strand breaks,DSBs)〇
[0029] DSBs能激活细胞内非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源 重组(Homology directed repair ,HDR)两种DNA修复机制。NHEJ修复过程可以引入碱基的 随机插入或者缺失（Insertion or deletion);而在外源模板存在的情况下，细胞也可以通 过HDR的方式对基因组进行精确修复。细胞内发生HDR的频率比NHEJ低，只发生于细胞分裂 的S期和G2期，而NHEJ发生于整个细胞周期。HDR与NHEJ在细胞内同时存在，但在NHEJ存在缺 陷的细胞内HDR发生频率更高，因此抑制NHEJ可提高HDR的发生频率。
[0030] NHEJ包含两种类型的途径：（1 )DNA连接酶IV依赖性NHEJ(经典NHEJ，C-NHEJ)途径， 主要用于末端连接；（2)选择性NHEJ(a 1 t-NHEJ/A-NHEJ/A-EJ)途径，需要DNA连接酶I/III， C-NHE J途径缺失时可诱发。
[0031 ]因此，CRISPR/Cas9基因敲除系统的靶点由19个碱基构成。靶点前面为转录起始信 号G，靶点后面为PAM序列NGG。这样可作为靶点的序列为GN20GG。基于此，上述步骤S01中是 以内质网压力感受因子XBP1为革E1基因，通过在线软件(http://crispr.mit. edu)针对XBP1 基因进行CRISPR靶向序列设计和脱靶位点预测。那么根据所述CRISPR靶向序列设计寡核苷 酸序列。
[0032] 在一实施例中，该过综合分析最终选择的CRISPR靶向序列如下述SEQ ID NO: 1中 下划线所示：
[0033] "··.CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAA AGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAG CCCAGAGAGGGGC..."(SEQ ID NO：1)
[0034] 在进一步实施例中，根据所述CRISPR靶向序列设计的寡核苷酸序列包括正向寡核 苷酸序列和反向寡核苷酸序列，在一具体实施例中，所述正向寡核苷酸序列如下述SEQ ID NO: 2所示：
[0035] 5，GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT CCGTT3'（SEQ ID N0:2)
[0036] 反向寡核苷酸序列如下述SEQ ID N0:3所示：
[0037] 5 ' AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGT GTTTC3'（SEQ ID N0:3)
[0038] 上述步骤S02中的退火反应处