胱天蛋白酶募集域蛋白9的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术及医药领域，具体涉及脫天蛋白酶募集域蛋白9(CA畑9)的 新用途。
【背景技术】
[0002] 急性膜腺炎（A巧是常见的急腹症之一，常伴发全身炎症反应综合征和多器官功 能障碍综合征，严重危及患者生命。因此，早期诊断和预测膜腺炎的严重程度具有十分重要 的临床意义。
[000引 20世纪70年代初，Ranson在研究了 100名急性膜腺炎患者入院48小时的情况 后，提出了 Ranson评分系统。该评分系统包括入院时的5项临床指标和48小时的6项指 标各项1分，合计11分，评分在3分W上时即为重症膜腺炎。3分W下病死率0. 9%，3-4分 为16%，5-6分为40%，6分W上为100%。Ranson评分系统在重症膜腺炎的诊疗过程中曾 发挥了很大的作用，但对比CT等影像学检查发现其敏感性不高。
[0004] 迄今为止，急性膜腺炎起始和发展的确切发病机制仍未完全阐明。而单核巨瞻细 胞系统的激活已被证实是AP发展的最初事件的启动因子，在多器官功能衰竭发展过程中 是重要的病理生理步骤。CARD9是在巨瞻细胞内高度表达的一种新型衔接蛋白，CARD9在抗 微生物感染的天然免疫反应发挥着重要作用，而重症急性膜腺炎（SA巧病程早期的特点无 菌性炎症，因此CARD9在急性膜腺炎发病期早是否起着作用是未知的。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了脫天蛋白酶募集域蛋白CARD9的新用 途及相应检测急性膜腺炎严重程度的试剂盒。
[0006] 本发明检测了 AP患者外周血单核细胞中的CA畑9mRNA和蛋白的表达，棍奇地发 现，AP外周血单核细胞中CA畑9mRNA和蛋白的表达在入院24小时内高于健康对照组，尤 其是SAP患者CA畑9mRNA和蛋白表达明显高于健康对照组和MAP (轻症A巧组，提示早期检 测CA畑9可能有助于判断AP病情，CA畑9水平越高，病情越严重。
[0007] 本发明首先提供了 CARD9作为生物标志物在制备诊断急性膜腺炎严重程度的试 剂盒中的用途。
[0008] 所述诊断急性膜腺炎严重程度的试剂盒W检测CA畑9的mRNA表达水平或CA畑9 蛋白表达水平为检测指标。
[0009] 当W检测CA畑9的mRNA表达水平为检测指标时，所述试剂盒至少包括CA畑9的特 异性引物、内参引物、阴性对照和阳性对照。
[0010] 进一步的，所述试剂盒还应当包括正常对照。
[0011] 在获得CARD9的特异性引物的情况下，可配合常规的外周血单核细胞提取试剂、 RNA提取试剂、逆转录试剂、real time PCR试剂，通过从样本中分离出外周血单核细胞，进 一步提取外周血单核细胞的RNA，经反转录和real time PCR的方法来检测CA畑9的mRNA 的表达水平。
[0012] 当W检测CARD9蛋白表达水平为检测指标时，所述试剂盒至少包括CARD9的单克 隆抗体。
[001引在获得CA畑9的单克隆抗体的情况下，可配合常规的western blot试剂、SDS-聚 丙帰醜胺凝胶电泳，采用western blot检测CA畑9蛋白表达水平。
[0014] 考虑CA畑9蛋白表达滞后于基因层次表达，且SAP患者CA畑9高表达，虽然治疗 后，mRNA表达有所下降仍高于正常水平，故蛋白表达仍然处于高水平。所W认为选择CARD9 的mRNA表达比蛋白表达能更准确评估急性膜腺炎严重程度。
[0015] 本发明还进一步公开了一种诊断急性膜腺炎严重程度的试剂盒，所述试剂盒包括 CARD9的特异性引物、内参引物、阴性对照和阳性对照。
[0016] 进一步的，所述试剂盒还应当包括正常对照。
[0017] 如实施例列举的，所述CARD9的特异性引物为：
[001引上游引物
[001引下游引物
[0020] 内参选用GAPDH (甘油醒-3-磯酸脱氨酶），所述内参引物为：
[00川上游引物
[0022] 下游引物
[0023] 内参引物亦可选择目-actin的引物。
[0024] 所述阴性对照为；DEPC去离子水
[002引所述阳性对照为；构建的CA畑9基因质粒DNA
[0026] 所述正常对照为；健康成人的静脉血
[0027] 进一步的，所述试剂盒中还可W包括W下试剂中的一项或多项：人外周血单核细 胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、除引物W外的PCR试剂。
[0028] 所述人外周血单核细胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、除引物W外的PCR 试剂均为现有技术。
[0029] 所述人外周血单核细胞提取试剂可采用常规，如Ficol 1淋己细胞分离液、PBS缓 冲液、细胞培养基等。
[0030] 所述RNA提取试剂可采用常规，如TriZO1 (或RNAISO Plus)、氯仿、异丙醇、75 %的 己醇、去离子水等。
[0031] 所述逆转录试剂可采用常规，如PrimeScript 1st Strand C化a Synthesis Kit 等。
[0032] 所述除引物W外的PCR试剂一般包括；Taq酶、dNTPs、英光染料（如SYBR Green 染料等）、Mg2+及PCR缓冲液等。均为常见组分，其用量亦为常规。
[003引 W上PCR试剂可与引物一起配置成PCR扩增反应液，也可直接W市售的不含引物 的通用PCR扩增反应液加入引物及染料配置获得。
[0034] 具体的，基于本发明，可采用下列方法诊断急性膜腺炎严重程度：
[0035] (1)提取人外周血单核细胞；使用Ficol 1淋己细胞分离液按照密度梯度离必法 分人外周血单核细胞。
[0036] 似提取外周血总RNA ;使用Trizol提取外周血单核细胞中总RNA。
[0037] 做逆转录：
[00測 （4)英光定量PCR。
[003引 妨根据英光定量PCR检测的CARD9水平，相比健康对照，CARD9水平越高则急性 膜腺炎越严重。
[0040] 本发明基于CARD9的表达与急性膜腺炎严重程度的关联的掲示，提供了早期检测 急性膜腺炎严重程度的新方法。采用本发明的方法及试剂盒诊断急性膜腺炎严重程度，相 比RANSON评分的敏感性更高。
【附图说明】
[0041] 图1离必管中PBMC沉淀加入1ml PBS液吹打均匀后接种于O 60mm玻璃培养平皿 (40 X 10倍镜下）
[0042] 图2CA畑9蛋白在急性膜腺炎中的表达。*SAP组与正常组相比P<0. 05 ;#MAP组入 院第H天与SAP组相比P<0. 05, ##MAP组入院第五天与SAP患者相比P<0. 05。
[0043] 图3CA畑9mRNA在急性膜腺炎的表达。*与正常组相比P<0. 05 ;#AP患者入院第五 天与第一天相比P<〇. 05 ;##SAP与MAP入院第一天相比P<0. 05。
[0044] 图4AP患者入院后第一天CA畑9mRNA表达水平、RANSON评分、LDH、血淀粉酶的ROC 曲线
【具体实施方式】
[0045] W下列举具体实例W进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保 护范围。
[0046] 实施例1试剂盒的制备
[0047] 将W下试剂装配成试剂盒：
[004引 1) CA畑9的特异性引物对：
[0049] 上游引物
[0050] 下游引物
[0051] 2)内参引物对：
[0052] 上游引物
[0053] 下游引物
[0054] 3)阴性对照；DEPC去离子水
[005引 4)阳性对照；构建CA畑9基因质粒DNA
[0056] 4. 1引物设计：
[0057] 从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。
[0058] 引物序列为：
[0059] 上游引物
[0060] 下游引物
[0061] 模板来源：正常人外周血单核细胞 [00的]PCR扩增目的片段：
[0063] 使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：
[0065] PCR反应条件；98°C 10砂55°C 5砂72°C I分钟Ab 30个循环
[0066] 4. 2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：
[0067] 目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比， 目标片段大小为：62. 3化，判断目的片段扩增成功。
[006引 4. 3胶回收目的片段：
[0069] 把目的片段条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
[0070] 4. 4线性化表达载体的制备：
[0071] 用限制性内切酶使用EcoRI和BamHI双酶切（构建好W后的Card9的C端带有 SFl