用于i亚群禽腺病毒检测的lamp引物组及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及禽腺病毒检测方法，具体的，设及一种基于LAMP技术的用于I亚群禽腺 病毒检测的LAMP引物组及检测方法。
【背景技术】
[0002] 禽腺病毒(fowl adenovirus,FAV)属于腺病毒科禽腺病毒属，既可水平传播，也可 垂直传播，还可引起轻度呼吸道症状、产蛋下降和膜腺萎缩、坏死等。I亚群禽腺病毒为线状 双链DNA病毒，具有共同的群抗原，共12个血清型(FAV1-FAV12)。
[0003] 快速诊断和及时监测是腺病毒感染防控的重要环节，腺病毒病原学诊断中可W采 用病毒分离及生物学特性的鉴定的方法，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培 养，试验周期较长、操作繁琐，不能满足临床疾病防控工作的需要。其他的实验室检测方法 还有双向免疫扩散(DID)试验、酶联免疫吸附巧LISA)试验、DNA原位杂交(ISH)、聚合酶链式 反应(PCR)、免疫巧光（IF)等。然而上述方法在操作过程中都需要借助复杂的检测仪器，在 一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等溫扩增化oop-mediated isothermal amp I i f i cat i on，LAMP)能在等溫(60~65 °C)条件下，短时间内进行核酸扩增的方法。与常规 PCR相比，不需要模板的热变性、在恒溫条件下即可完成扩增，反应结束后可通过目视、电 泳、紫外激发观察等多种方法对结果进行判定。该技术具有简单、快速、特异性强的特点，在 灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于常规PCR技术。但是迄今为止，还没有开发出能够 灵敏特异的检测I亚群禽腺病毒的LAMP检测技术。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能够灵敏特异的检测I亚群禽腺病毒的LAMP引物组及 检测方法。
[0005] 本发明的上述目的是通过W下技术方案实现的：
[0006] 本发明的发明人通过研究I亚群禽腺病毒的结构蛋白功能发现，六邻体化exon)是 I亚群禽腺病毒的主要结构蛋白，具有型、群和亚群特异抗原决定簇，是中和抗体的祀目标， 因此，依据编码该蛋白基因建立起来的检测方法对于该病毒引起的疫病有重要应用价值。 因此针对该蛋白的编码基因设计了一种用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组，其中，所述 LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成;其中，外引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示；内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;环引物对的 序列如沈Q ID NO.5和沈Q ID NO.6所示。
[0007] 本发明还提供了所述LAMP引物组在制备检测或诊断I亚群禽腺病毒的制剂中的用 途。
[000引本发明还提供了一种I亚群禽腺病毒检测方法，所述方法包括使用本发明所述的 LAMP引物组进行LAMP扩增反应。
[0009] 其中，LAMP扩增反应的条件包括:61-65°C下反应55-65min，80°C作用1.5-5min结 束反应。
[0010]其中，每25化的LAMP扩增反应的反应体系中，含有外引物对的正向引物和反向引 物各1 Opmo 1，内引物对的正向引物和反向引物各20pmo 1，环引物对的正向引物和反向引物 各IOpmol。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，LAMP扩增反应的反应体系包括:Reaction Mix 12.5 化，沈Q ID N0.1(10pmol)1.0iiL，SEQ ID N0.2(10pmol)1.0化，沈Q ID N0.3(10pmol)2.0y L，沈Q ID N0.4(10pmol)2.0化，SEQ ID N0.5(10pmol)1.0化，沈Q ID N0.6(10pmol)1.0yL， Enzyme Mix I.OuL，待检样品2.OuL，补充Distilled Water至总体系为25化。
[0012] 在本发明的一种实施方式中可W通过W下所列举的方法进行结果检测，
[OOU] (1)直观检测：
[0014]显色法:在反应液中加入IiiL巧黄绿素，阳性反应结果显示黄绿色，阴性反应保持 原黄色不变，在紫外光激发下，阳性样品显示明亮巧光；
[001引目视浊度法:将反应物离屯、，阳性反应结果可观察到沉淀，阴性反应无沉淀；
[0016] 巧光实时监测法:加入SYBR Green显色剂，然后置于巧光定量仪实时观察；
[0017] (2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性反应呈现特有的 梯状条带，阴性反应测无条带出现。
[0018] 本发明还设及一种I亚群禽腺病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述 的LAMP引物组。
[0019] 本发明所述的试剂盒还包括LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂内含React ion Mix、Enzyme Mix和Distilled Water及显色剂。
[0020] Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water均可按照常规现有方法制备，所述 引物可按照现有方法制成冻干粉，经HPLC纯化，显色剂优选为巧黄绿素。
[0021] 本发明通过研究I亚群禽腺病毒的结构蛋白功能，找到了适用于12个血清型检测 的祀位点，设计了具有高灵敏度和特异性的LAMP引物组，利用本发明提供的LAM巧I物组检 测病原一般仅需60min左右，而常规PCR方法则需要4-化，且LAMP方法灵敏度高，最小核酸浓 度为8.4Xl(T 9ngAiL，其灵敏度较常规PCR方法高IO4倍，不需要昂贵仪器，检测结果易于观 察，安全性好。适用于在基层兽医疾病防控机构或普通养殖场推广。
【附图说明】
[0022] 图1为LAMP体系优化结果，
[0023] 图1A中1~5分别为反应混合物的反应溫度分别为6rC、62°C、63°C、64°C、65°C，M 为DL2000-plus marker;
[0024] 图IB中I~4分别为反应混合物的反应时间分别为2〇111111、4〇111111、6〇111111、8〇111111，5为 阴性对照，M为DL2000-plus marker。
[0025] 图2为LAMP特异性试验
[00%] 1 ~12 分别为FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8、 尸八(1￥-9少4(1￥-10少4(1￥-11立4(1￥-12，13为阴性对照，14~18分别为产蛋下降综合征病毒、禽 呼肠孤病毒、禽传染性法氏囊病病毒、禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒，M为化2000-plus marker。
[0027] 图3为LAMP敏感性试验，I~12为10倍梯度稀释的FAdV DNA(8.4ng/iiL~8.4 X l〇- 口雌/化），13为阴性对照，M为DL2000-plus marker。
[002引图4为敏感性试验，常规PCR检测结果，1~12为10倍梯度稀释的FAdV DNA(8.4ngAi L~8.4 X 10-12雌/化），13为阴性对照，M为DL2000-plus marker。
[0029] 图5为在反应体系中加入显色剂，反应结束后置于紫外灯下照射，1为加入腺病毒 模板的反应液发出明亮巧光，2为阴性对照。
【具体实施方式】
[0030] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0031] 实施例1
[0032] 1试验材料和方法
[0033] 1.1主要试剂
[0034] I亚群禽腺病毒12个血清型标准毒株禽腺病毒1型~12型，购自中国兽医药品监察 所，产蛋下降综合征病毒化DSV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽传 染性支气管炎病毒（IBV)、新城疫病毒(ND)、禽腺病毒分离毒株(FAdV)等，均为实验室保存 的本领域常规毒株。
[OO%] DNA恒溫扩增试剂盒购自安洁优科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit购 自北京全式金生物技术有限公司；SYBR Green I购自Invihogen公司；巧黄绿素购自日本 荣研公司。
[0036] 1.2引物设计
[0037] 针对I亚群禽腺病毒hexo基因的保守区域设计6条引物，分别是外引物(FAdV-F3 (沈QIDNo.l所示）和FAdV-B3(SEQIDNo.2所示）），内引物(FAdV-FIP(SEQIDNo.3所示） 和尸4(1￥-81?(569 10齡.4所示））和环引物化4(1￥-口^(569 10齡.5所示巧阳4(1￥-1^8(沈9 10 齡.6所示））（表1)。
[003引表1 LAMP因组
[0040] 1.3 DNA提取
[0041] 取I亚群禽腺病毒12个血清型标准毒株，4株禽腺病毒分离毒株，使用北京全式金 生物技术有限公司Easy化re Viral DNA/RNA Kit试剂盒，按照说明书从20化L病毒液中提 取病毒DM,最后溶于30化RNase-free