检测犬恶丝虫病的elisa诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 犬恶丝虫（亦称犬心丝虫）是心肺心丝虫病的病原体，主要寄生于温带、热带地区 的家养犬猫及野生哺乳动物体内。作为一种以蚊媒形式传播的人畜共患传染病病原，该虫 可导致人的犬恶丝虫病。此外，一些血清制品也可能会导致人的犬恶丝虫病。通常，狗作为 犬恶丝虫的天然宿主，其成虫大多寄生在狗的肺动脉和右心室，而其微丝蝴则分散与狗的 血液循环系统。患病狗常因感染少量虫体而不表现出病状，但是其血液中的微丝蝴或循环 性犬恶丝虫抗原却是目前诊断该病的主要依据；并且在一些没有微丝蝴的隐性感染情况 下，抗原检测被认为是最敏感的检测方法。因此鉴定和筛选一种犬恶丝虫特异的、敏感的分 子诊断抗原将对该虫病的防控奠定基础。
[0003] 发明专利CN102798716公开了一种犬恶丝虫ELISA检测试剂盒及其制备方法，利用 从犬恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白同源为 88 %的MTFP基因，并在大肠杆菌质粒中表达获得的MTFP蛋白作为抗原，通过间接ELISA法检 测犬的犬恶丝虫感染。该方法可快速检测犬恶丝虫感染，但是，其灵敏度有待进一步的提 高，特别是对单一的雌虫或雄虫感染，其检测结果并不准确。
[0004] 因此，亟需一种检测灵敏度高的ELISA检测试剂盒。
[0005] 自肿瘤蛋白（TCTP)从小鼠埃利希腹水瘤细胞和红白血病细胞内被最次描述以来， 该蛋白已在不同的生物，如哺乳动物、植物、较低的真核生物和原核生物内被发现和报道。 此外，在寄生虫中，tctp基因还被发现存在于恶性疟原虫、约氏疟原虫、布氏锥虫、秀丽隐杆 线虫、马来丝虫及班氏丝虫体内。重要的是，由于丝虫肿瘤蛋白的钙结合特性和组胺释放功 能，该蛋白目前已被认定与犬恶丝虫的致病性以及其在宿主体内的存活息息相关。当前，相 关研究对于TCTP在寄生虫中的生理角色已有了详细了解，然而对于该蛋白质在丝虫寄生虫 阶段是否具有免疫原性仍知之甚少。有报道称在马来丝虫的微丝蝴和成虫体内均可检测到 高水平的TCTP蛋白质表;并且作为一种分泌蛋白，马来丝虫肿瘤蛋白（Bm-TCTPs)在其微丝 蝴的分泌、排泄物中含量丰富，可引起宿主免疫反应。鉴于上述研究结果，本发明的发明人 推测丝虫的TCTP同系物在丝虫病的检测上应该具有潜在免疫诊断价值。
【发明内容】
[0006] 本发明解决的技术问题是提供检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒。
[0007] 本发明检测犬恶丝虫病的ELI SA诊断试剂盒，包括ELI SA板、洗涤液、封被液、酶标 二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到 的蛋白，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如 SEQ ID No.l所示；
[0008] 所述洗涤液为PBST，所述PBST为磷酸盐吐温缓冲液；
[0009]所述封被液为3wt%牛血清蛋白；
[0010]所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG;
[0011] 所述显色物为3,3'，5,5'_四甲基联苯胺;所述终止液为2.5N H2S〇4。
[0012] 其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：
[0013] a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA;
[0014] b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQ ID No.2所示;所述下游引物如SEQ ID No.3所示；
[0015] c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；
[0016] d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。
[0017] 进一步的，所述PCR扩增体系为:2XTaq PCR MasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下 游引物lyL，模板DNA lyL，ddH20 9.5yL;反应条件为：94°C预变性5min; 94°C变性35sec， 53.8°C 退火 35sec，72°C 延伸 35sec，35 个循环；最后 72°C 延伸 lOmin。
[0018] 所述表达载体为pET_28a( + )。
[0019] 本发明解决的第二个技术问题是提供检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，该方 法可以检测血清以及血清制品中是否存在犬恶丝虫。
[0020] 本发明检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，包括如下步骤：
[0021] a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，过夜，再使用PBST彻底清洗四次；
[0022] b、将已包被的ELISA板用100yL的3%牛血清蛋白封被lh，再使用PBST彻底清洗四 次；
[0023] c、加入待测血清100yL到孔内，室温处理lh，再加入HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应 1 h后，使用PBST彻底清洗四次；
[0024] d、加入3,3'，5,5'_四甲基联苯胺进行显色;显色反应由2.5N H2S〇4终止，在波长为 450nm的光波下读取吸光度；
[0025] e、根据吸光度值判断检测结果。
[0026] 其中，a步骤所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被浓度为2.5yg/mL;c步骤 所述的HRP标记的羊抗狗IgG二抗稀释度为1:5000。
[0027] 其中，d步骤所述的显色时间为5~30min，优选显色时间为10min。
[0028] e步骤所述的根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为:若吸光度值大于或等于 0.294，则血清中存在犬恶丝虫，若吸光度值小于0.294，则血清中不存在犬恶丝虫。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] (1)新基因筛选方法先进:本发明是通过高通量测序技术从犬恶丝虫的转录组数 据中筛选到的Di-TCTP基因。
[0031] (2)敏感性高：以Di-TCTP蛋白作为抗原，不仅能检测单一的雌虫感染，而且还能检 测所有的雄虫感染。因此优于CN201110419523.6公开的以MTFP蛋白作为抗原建立的ELISA 检测试剂盒。
[0032] (3)特异性强：本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒分别评估感染有犬钩 虫，犬弓蛔虫和豆状带绦虫3种不同寄生虫的6份犬血清，均为阴性，表明该试剂盒特异性 强。
【附图说明】
[0033] 图1为Di-TCTP基因二级结构。
[0034]图2为预测的Di-TCTP蛋白三级结构，其中，深色粗线为α-螺旋，浅色粗线为延伸 链，其余细线为无规卷曲。
[0035] 图3a为Di-TCTP蛋白SDS-PAGE电泳图；图3b为Di-TCTP蛋白免疫印迹图；图中，箭头 表明Di-TCTP蛋白位置。
【具体实施方式】
[0036]本发明借助第二代测序技术所产生的犬恶丝虫成虫转录组中20810个独特的转录 表达基因（unigenes)和15698个编码序列(CDS)数据集，鉴定和筛选出来一个犬恶丝虫肿瘤 蛋白基因（以下简称Di-TCTP)，基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0037] Di-TCTP是在筛选组装的犬恶丝虫转录组数据中鉴定的。根据Nr注释信息，该基因 (Unigene ID 881)表现出与罗阿丝虫的TCTP高的同源性。0RF分析表明，Di-TCTP含有一个 可编码181个氨基酸的01^(546&?)，其假定的分子质量为20.73961^) &，？1为4.62。相似性分 析表明，Di-TCTP和罗阿丝虫的受翻译调节肿瘤蛋白（TCTP)(基因库:EF028099.1)在蛋白水 平享有最高的相似点（97%)，其次是和班氏丝虫的TCTP(GenBank:AAK71499.1)(96%)和马 来丝虫的TCTP(GenBank: EDP33421.1) (95% )。信号PV4.0分析表明，在Di-TCTP中不存在信 号肽。Di-TCTP编码的蛋白有显著的亲水性（图1)。用不同方法预测的Di-TCTP蛋白的二级结 构表现出明显的不同。例如，用Garnier-Robson方法预测，有两个α螺旋和两个无规则卷曲， 而用Chou-Fasman的方法，Di-TCTP推断的氨基酸序列预测则有10个阿尔法螺旋，8个片层和 11个无规则卷曲。用Karplus Schulz方法预测，Di-TCTP有13个可变区。图2为预测的Di-TCTP蛋白三级结构。该预测是利用在线分析工具(http: //swissmodel. expasy · org/)预测 的三级结构。
[0038] 利用Di-TCTP编码的蛋白具有良好的免疫原性，可用于制备检测犬恶丝虫病的 ELISA诊断试剂盒。
[0039]本发明检测犬恶丝虫病的ELI SA诊断试剂盒，包括ELI SA板、洗涤液、封被液、酶标 二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为利用Di-TCTP基因编码 得到的蛋白；所述洗涤液为磷酸盐吐温缓冲液(PBST)，即在PBS溶液中加入Twen-20配制而 成，优选为含〇 . 〇5wt %吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述封被液为3wt %牛血清蛋白； 所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG;所述显色物为3,3'，5,5'_四甲