一种川贝母的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)系百合科贝母属多年生草本药用植物，入药部位为地下鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，是治疗咳嗽的重要良药。川贝母与暗紫贝母(Fr i t i I I a r i a unibracteata Hsiao e t K.C.H s i a )、甘肃贝母(Fritillariaprzewalskii Maxim)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi Franch.)等同为《中国药典》(2005年)中规定的著名中药材川贝的主要来源。川贝母主产于四川、西藏、云南等省区，喜寒凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜阴蔽的特性，气温达到30°C或地温超过25°C，植株就会枯萎，在海拔低，气温高的地区不能生存。川贝母在自然环境下靠种子繁殖，生长周期长，一般4-5年才可采收，因其种子存在形态和生理后熟的特性，繁殖系数低，产量也低。人工引种川贝进行生产主要靠鳞茎繁殖，鳞茎通过筛选，大鳞茎入药，小鳞茎做种，小鳞茎栽种后因其大小不同又需要2-3年才能收获，这样一方面浪费了宝贵的鳞茎资源，另一方面又增加了生产成本，且产量不高，不能满足川贝的市场需求。目前，川贝母用药很大程度上依赖于野生资源，经过多年的采挖，野生资源破坏严重，产量减少，资源非常紧缺，因此寻找新的途径以解决其资源问题是非常迫切的。
[0003]植物组织培养技术可以从根本上解决川贝母的种苗问题，其成本低，见效快，繁殖率高，又能保持品种的优良性状。另外，通过组培可以研究川贝母愈伤组织的药效，利用愈伤组织生产药效物质可能成为有效的替代技术。因此，对川贝母组培方法的研究在药用植物开发利用和生产中都具有重要的实践意义。在现有专利中关于贝母的组织培养已有报道，但数量不多，涉及的品种有暗紫贝母、湖北贝母、伊犁贝母、平贝母、黄花贝母、皖贝母、甘肃贝母等，其中，有关川贝母(Fritillaria cirrhosaD.Don)的报道较少，王跃华等以川贝母的根为外植体进行了愈伤组织的诱导研究。薛刚等报道了从川贝母肉质化幼叶上直接诱导产生贝母鳞茎的方法，以及以幼嫩叶鞘为外植体诱导川贝母愈伤组织和胚状体产生。本发明利用组织培养技术以川贝母的鳞茎为外植体，通过两种途径(即不同状态的愈伤组织)获得小鳞茎的再生，并实现大量繁殖。与其他贝母的组织培养方法相比，本发明具有较高的增殖率，可以从很大程度上提高川贝母的扩繁速度。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)的组织培养方法，本方法利用组织培养技术，可短时间内生产大量种苗，提高繁殖效率，大量繁殖川贝母，有利于加快川贝母的繁殖推广。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0006]—种川贝母的组织培养方法，包括以下步骤:
[0007](I)外植体的选择与处理:选取健康新鲜的川贝母鳞茎，在自来水下冲洗，用软毛刷洗净泥土，并去除鳞茎基部的根，再蘸取少量洗洁精稀释溶液(Ig洗洁精溶于10ml蒸馏水)清洗外植体，并用自来水冲洗干净，约冲洗30分钟;对鳞瓣和鳞心结合比较紧密的鳞茎，将整个鳞茎表面清洗干净，若鳞瓣与鳞心间有缝隙，为了洗干净里面的泥土，需将鳞瓣与鳞心掰开来清洗，洗净备用；
[0008](2)外植体消毒:将洗净的鳞茎放入小烧杯中，转至超净工作台上，倒入75 %乙醇溶液并轻轻摇晃，浸泡8-lOs，倒掉乙醇，用无菌水洗2次，并将鳞茎从烧杯中转到经过高温灭菌的无菌瓶中，再加入0.1%升汞溶液(lg Hgcl2溶于100ml蒸馏水)浸泡、震荡，灭菌8-1Omin，倒掉升萊，用无菌水洗6次，每次2min，最后留部分无菌水浸泡外植体备用；
[0009](3)愈伤组织诱导:将消毒好的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分，在无菌条件下切割成0.5-0.8cm的小块，接种于初代愈伤组织诱导培养基中，诱导贝母愈伤组织。培养室的培养温度为23 ± 1°C，空气相对湿度70%-80%，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx。经过15天开始形成愈伤组织，该愈伤组织为致密的块状(川贝母愈伤组织有两种:一种为致密的块状愈伤组织，一种为疏松颗粒状愈伤组织)。
[0010](4)块状愈伤组织的增殖和分化:川贝母鳞茎切块经过(3)诱导后，形成块状愈伤组织，该组织排列紧密，呈浅绿色，淡黄色。将该愈伤组织切成0.6cm左右的小块，接种于继代培养基中，可实现愈伤组织的增殖，并同时出现贝母小鳞茎的分化。培养条件:温度23±10C，空气相对湿度70%-80%,光照时间12小时/天，光照强度2000Lx。该过程30天继代一次，可继代多次，得到更多的小鳞茎；
[0011](5)疏松颗粒状愈伤组织的诱导及增殖:经步骤(4)继代后的块状致密愈伤组织，可由初代愈伤诱导培养基诱导产生疏松的颗粒状愈伤组织，该愈伤组织细胞高度分化，增殖速度快，接种到增殖培养基中可实现短时间大量繁殖。培养条件:光照500-1200LX，温度21°C左右，湿度70%-80%，光照时间12小时/天，增殖过程中，继代时间最佳25天；
[0012](6)胚状体的分化和生长:步骤(5)中所得的愈伤组织多为胚性愈伤组织，其在光照条件下经过一定的时间可在MS培养基中培养得到川贝母小鳞茎胚状体，该胚状体继续培养能长成健康的小鳞茎。培养条件:光照强度1500-2000LX，光照时间10-15小时/天，培养温度19-22 °C，湿度70%-80%。
[0013](7)生根培养:将步骤(4)和步骤(6)中得到的小鳞茎一个个切下，接种于生根培养基中，可诱导生根。培养室的培养温度为23 ± TC，空气相对湿度70 % -80 %，光照时间12小时/天，光照强度2000LX。待小鳞茎长至5cm高，根系比较健壮，且长出6-10条根时，即可进行下一个阶段；
[0014](8)炼苗移栽:将步骤(7)得到的生根无菌苗在出瓶前转至温室苗床上，保持环境温度20-250C，湿度80%~85%，光照强度5000Lx左右，培养I周，逐渐打开瓶口，培养3_4天，增强对外界环境的适应能力。再将生根苗从瓶中取出洗净基部的培养基，然后移栽到事先准备好的由腐殖土:珍珠岩:蛭石= 4:2:1组成的基质中，定期浇施MS营养液，覆盖薄膜，一周后揭膜，揭膜20天统计成活率。
[0015]上述步骤(3)所述诱导培养基为:MS+0.5-lmg/L6-BA+0.5-1.5mg/L NAA+l_2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+4.5_5g/L琼脂(pH5.8，121°C 灭菌25分钟)。
[0016]上述步骤(4)所述增殖分化培养基为:MS+0.3-2mg/L 6-BA+0.1-lmg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+4.5-5g/L琼脂(pH5.8，121°C 灭菌25分钟)。
[0017]上述步骤(5)所述颗粒状愈伤组织的增殖培养基为:MS+0-1.5mg/L 6-BA+0-
0.5mg/L2，4-D+0-0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5_5g/L琼脂(pH5.8，121°C 灭菌25分钟)。
[0018]上述步骤(6)所述胚性愈伤组织诱导小鳞茎胚状体分化和生长培养基为:MS+0-
0.5mg/L 6-BA+30-40g/L蔗糖+4.5_6g/L琼脂(pH5.8，121°C 灭菌25分钟)。
[0019]上述步骤(7)所述生根培养基为:MS+0.2-0.5mg/LΙΒΑ+0-0.2mg/L KT+30mg/L蔗糖+5g/L琼脂(pH5.8，121°C灭菌25分钟)。
[0020]本发明的优点是以川贝母鳞茎为外植体，通过外植体的消毒、两种状态的愈伤组织的诱导、增殖和分化、鳞茎生根培养、炼苗移栽等过程获得了川贝母离体再生植株，建立了有效的川贝母组培快繁体系。
【附图说明】
[0021]图1为块状和疏松颗粒状川贝母愈伤组织照片；
[0022]图2为块状和疏松颗粒状川贝母小鳞茎的分化照片；
[0023]图3为川贝母小鳞茎的生根培养照片。
【具体实施方式】
[0024]以下结合实施例及附图1-3对本发明作进一步说明，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0025]实施例1
[0026](I)外植体的选择与处理:选择新鲜的，健康的川贝母鳞莖为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取少量洗洁精稀释溶液(Ig溶于10ml蒸馏水)清洗外植体表面，用自来水冲洗干净，约冲洗30分钟;对鳞瓣和鳞心愈合比较紧密的鳞茎，将整个鳞茎表面清洗干净，若鳞茎的鳞瓣与鳞心间有缝隙，为了洗净里面的泥土，需将鳞瓣与鳞心掰开来清洗，洗净备用；
[0027](2)外植体消毒:以川贝母鳞茎为外植体，用自来水冲洗贝母鳞茎，洗净泥土，去除须根，在超净工作台上，用75 %的乙醇浸泡I Os，无菌水冲洗2次，0.1 %升汞溶液浸泡8min，无菌水冲洗5次，每次2分钟。最后，留部分无菌水浸泡外植体备