黄酮类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及从药用植物山芝麻中分离得到的黄酮类化合物在制备 抗乙肝病毒药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 据有关统计显示，全世界大约有3亿多人为慢性乙肝病毒（HBV)携带者，我国约占 半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导 致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV 感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217,因此在全世界每年大约有200万人死于 乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相 关的慢性肝病（肝硬化与肝癌）。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻 求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
[0003] 药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前为止能 治愈HBV感染的特效药还在寻找。临床上已获得FDA正式批准使用的α-干扰素和核苷类 药物拉米呋啶只能在某种程度上获得治疗效果，对大多数病人还达不到治愈的目的，停止 治疗后的"反跳"现象是医药工作者最感棘手的问题，所以开发研制高效、低毒、不"反跳"的 抗HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药物 化学工作者把注意力转向了植物来源丰富、价廉易得、毒副作用小、分子结构复杂多样的天 然化合物。
[0004] 山芝麻（Helicteres angustifolia L.)为梧桐科植物，主要分布于岭南地区，其 根或全株药用，具有解表清热、消肿解毒的功能，常用于治疗感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿 痛、头痛、肠炎、痈肿等症，在凉茶配方中也常出现。药理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗 病毒及抗肿瘤等活性。我们的研究表明山芝麻粗提物具有很好的抗HBV活性，但对其抗HBV 的药效物质却缺乏研究，而本发明涉及的黄酮类化合物尚未见抗HBV活性报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供从山芝麻中分离得到的黄酮类化合物在制备抗乙肝病毒药 物中的用途。
[0006] 本发明应用现代药理筛选方法，从梧桐科山芝麻属（Helicteres)植物山芝麻 (H. angustifolia)中提取分离得到黄酮类化合物：5, 7, 8-三羟基-4' -甲氧基黄酮（1)和 翻白叶苷A (2)，并经试验证实所述化合物具有抗HBV活性。
[0007] 本发明所述的活性化合物具有如下的化学结构：
[0008]
[0009] 本发明中，
[0010] 化合物 5, 7, 8-三羟基-4' -甲氧基黄酮（1)，其中，R1 = 0H，R2 = H，R3 = OCH3 ;
[0011] 化合物翻白叶苷A (2)，其中，R1 = H，R2 = 0A，R3 = 0H，且取代基R2中的基团A为：
[0012]
[0013] 本发明的化合物通过下述方法制备：
[0014] 取山芝麻干燥地上部分15kg，95%乙醇回流提取，浓缩后分别用石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，共得I. 05kg，取乙酸乙酯萃取物160g进行硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱，所得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱、MPLC和Sephadex LH-20凝胶柱色谱 等分离纯化手段分离得到化合物5, 7, 8-三羟基-4'-甲氧基黄酮（1)和翻白叶苷A (2)。
[0015] 本发明所述的黄酮类化合物5, 7,8_三羟基_4'_甲氧基黄酮（1)和翻白叶苷A(2) 进行了体外抗HBV实验，结果证实，所述化合物具有显著的抗HBV活性，且有效浓度低，其 中5, 7, 8-三羟基-4' -甲氧基黄酮⑴对HBsAg的IC5。值为49. 3 μ g/ml，对HBeAg的IC5q 值为68. 4 μ g/ml ;翻白叶苷A(2)对HBsAg的IC5。值为14. 6 μ g/ml，对HBeAg的IC5。值为 41. 5 μ g/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶；所述化合物可作为活性成分用于制备抗HBV的 药物。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1提取、分离、制得黄酮类化合物
[0017] 取山芝麻干燥根15kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并浓缩得浸膏l.〇5kg，加水（4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物160g。将乙酸乙酯萃取部 位经硅胶（200-300目）柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脱， 得到11个流份（Fr.l-ΙΙ)，其中流份Fr.3(30g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，I: I)、MPLC (甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脱）和 S印hadex LH-20凝胶柱色谱等手段纯化，分离得到化合物5, 7, 8-三羟基-4' -甲氧基黄酮（1);流份 Fr. 4 (25g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇，30:1，20:1，10:1,5:1,3:1，1:1)、MPLC (甲 醇-水，20:80-80:20梯度洗脱）和S印hadex LH-20凝胶柱色谱等手段纯化，分离得到化合 物翻白叶苷A (2)。
[0018] 其中，5, 7, 8-三羟基 _4' -甲氧基黄酮（5, 7, 8-trihydroxy-4' -methoxyflav one，l)为棕黄色无定型粉末，UV(MeOH) λ _ nm (l〇ge) :360 (2.54) ,324(3. 27) ,300(2 .86), 272(3. 11) ；IR(KBr) : unax(cm :3380, 1664, 1616, 1582 ；ESI-MS m/z : 301 [M+H]+ 〇 1H-NMR (400MHz, DMS〇-d6) δ H：6. 81 (1H, s, H-3), 6. 27 (1H, s, H-6), 8. 11 (2H, d, J = 8. 0Hz, H-2'，6'），7. 11 (2H, d, J = 8. 0Hz, H-3'，5'），12. 34 (1H, s, 5-OH)，3. 85 (3H, s, 4' -OC H3);13C-MMR(100MHz，DMS0-d 6)Sc:56.2(-0CH3)，99.1(C-6)，103.4(C-3)，103.8(C-10)，114 ? 5 (C-3'，C-5'），121. 2 (C-8)，122. 7 (C-Γ )，128. 6 (C-2'，C-6'），149. 5 (C-9)，156. 8 (C-5)，I 57. 2 (C-7)，162. 4 (C-4,），163. 3 (C-2)，182. I (C-4)。
[0019] 翻白叶苷 A(potengriffioside A, 2)为黄色无定形粉末，(c 0. 25,Me0H) ；UV (MeOH) Anax nm(log ε ) :360 (3. 21), 315 (3. 47), 302 (2. 95), 276 (3. 43 )；IR(KBr) : υ nax(cm :3385, 1660, 1606, 1512, 1448, 1366, 1167, 1077, 844 ；ESI-MSm/ z: 595 [M+H]+。1H-NMR (400MHz, DMS0-d6) δ H: 8. 07 (2H, d, J = 9. 0Hz, H-2'，6'），7. 49 (1H, d, J =15.6Hz，H-7 " ，），7.38(2H，d，J = 8.4Hz，H-2 " ，，6 " ，），6.90(2H，d，J = 9.0Hz，H-3'，5'），6.88(2H，d，J = 9.0Hz，H-3 " ，，5 " ，），6.36(lH，d，J = 2. 4Hz, H-8)，6. 20 (1H, d, J = 2. 4Hz, H-6)，6. 17 (1H, d, J = 15. 6Hz, H-8 " '），5. 34 (1H, m，J =4. 2Hz, H-I " ), 4. 41 (1H, dd, J = 12. 0, 11. 4Hz, H-6 " b), 4. 30(1H, dd, J = 11·4，12·0Ηζ，Η-6" a) ;13C-NMR(100MHz，DMS0-d6) Sc:158.6(C-2)，135.5(C-3)，179.6(C-4 )，163. 2 (C-5)，100. 2 (C-6)，166. I (C-7)，95. I (C-8)，159. 6 (C-9)，105. 9 (C-IO)，123. 0 (C-l '），132.5(C-2，，6，），116.3(C-3，，5，），161.4(C-4，），104.3(C-1")，76.1(C-2")，78.3(C-3" )，72. 0(C-4" )，76. 0(C-5" )，64. 7(C-6" ),127. 3(C-1" '），131. 5(C-2" '，6" '），117. 0(C-3 "，，5"，），161.8(C-4"，），146.8(C-7"，），115.0(C-8" '），169. I (C-9"，）。
[0020] 实施例2体外抗HBV实验
[0021] 应用!fep G2的2. 2. 15细胞株（教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室， 上海），以每孔IOX IO5个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1 G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、链霉素各lOOμg/ml，在5% CO2孵箱中37°C培 养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设3~5个浓度，每个浓度 设4个平行孔，继续培养9天（每3天换液一次），收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg 含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法 测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶（3TC)。结果证实本发明所述化合物具有显著 的抗HBV活性，且有效浓度低，其中5, 7, 8-三羟基-4' -甲氧基黄酮（1)对HBsAg的IC5。 值为49. 3 μ g/ml，对HBeAg的IC5。值为68. 4 μ g/ml ;翻白叶苷A(2)对HBsAg的IC5。值为 14. 6 μ g/ml，对HBeAg的IC5。值为41. 5 μ g/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶（表1)。
[0022] 表1.化合物1和2对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0023]
[0025] / :当细胞毒性> 25%时不进行抑制率测试
[0026] 本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。
【主权项】
1. 具有下列结构的黄丽类化合物在制备抗己肝病毒药物中的用途，所述的化合物为5, 7, 8-H居基-4'-甲氧基黄丽（1)和翻白叶巧A (2)， 其中， 化合物5, 7, 8- H居基-4' -甲氧基黄丽（1)，其中，Ri = 0H，Rz = H，Rs = 0邸3 ; 化合物翻白叶巧A (2)，其中，Ri = H，Rz = 0A，Rs = 0H，且取代基R2中的基团A为：2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物通过下述方法制备：取山芝麻 干燥根，粉碎，用95 %己醇回流提取3次，每次化，合并提取液并浓缩得浸膏，加水混悬，分 别W等体积石油離、己酸己醋和正了醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得己酸己醋萃取 物； 将己酸己醋萃取部位经硅胶200-300目柱色谱分离，依次W二氯甲焼-甲醇50:1-0:1 梯度洗脱，得到11个流份化.1-11，其中流份化.3再经硅胶柱色谱（二氯甲焼-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，1:1)、MPLC (甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脱）和 Se5phadex LH-20凝胶柱色谱纯化，分离得到化合物5, 7, 8- H居基-4' -甲氧基黄丽（1);流份化.4 再经硅胶柱色谱（二氯甲焼-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水， 20:80-80:20梯度洗脱）和Se地adex LH-20凝胶柱色谱纯化，分离得到化合物翻白叶巧 A似。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。本发明从山芝麻属Helicteres植物山芝麻H.angustifolia中提取分离得到黄酮类化合物5,7,8-三羟基-4ˊ-甲氧基黄酮(1)和翻白叶苷A(2)，并经试验证实其具有抗乙肝病毒活性；与阳性对照拉米呋啶药理试验结果显示，该黄酮类化合物具有显著的抗乙肝病毒作用，其中5,7,8-三羟基-4ˊ-甲氧基黄酮(1)对HBsAg的IC50值为49.3μg/ml，对HBeAg的IC50值为68.4μg/ml；翻白叶苷A(2)对HBsAg的IC50值为14.6μg/ml，对HBeAg的IC50值为41.5μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶，所述的化合物可作为活性成分用于制备抗乙肝病毒的药物。
【IPC分类】A61K31/352, A61K31/7048, A61P31/20
【公开号】CN105640933
【申请号】
【发明人】陈道峰, 殷翔, 史训龙, 朱海燕, 卢燕
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月18日