弃。吸附后的树脂经一步洗涤，洗涤剂为45%甲醇，流速均 为1~1. 5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用80 %异丙醇解析，流速为lBV/h，分段收集 解析液。解析液出口单位小于10 μ g/ml时，解析完成，合并有效部分，进行减压浓缩，真空 度0. 09Mpa以上，温度控制不超过55°C，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸 乙酯相，乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度-0. 〇9Mpa以上，温度控制不超过55°C，浓缩至乙 酸乙酯尽干得4-OH环孢素油膏。
[0061] 4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为50% 乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。
[0062] 5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0. 09Mpa以上，温度控制不超 过55°C，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯 相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0. 〇9Mpa以上，温度控制不超过55°C，浓缩至乙 酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用100ml结晶溶剂（结晶 溶剂为丙酮：异丙醚=10:90)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异 丙醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在50°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小时，得到无定形4-OH环孢素精粉。HPLC测定如图7,4-OH环孢素的纯度达到了 97%。其 XRD图如图2所示，DSC图如图3所示、TGA图如图4所示、拉曼光谱图如图5所示，红外光 谱图如图6所示。
[0063] 实施例2
[0064] 1)取4-OH环孢素发酵液25L，含4-OH环孢素8. 2g，加入20L乙醇浸泡5小时，板 框过滤，收集浸提液41L，效价为189 μ g/ml。
[0065] 2)将收集到的浸提液，用1L RX-01T树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h， 收集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。
[0066] 3)将收集到的脱色液，使用1L HZ816柱进行吸附，上样流速为lBV/h，吸附完毕后 检测下柱液效价为1 μ g/ml，废弃。吸附后的树脂经两步洗涤，洗涤剂1为45%甲醇-碱 (lg/L NaOH)，洗涤剂2为45%甲醇，流速均为1~1. 5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用 82%乙醇解析，流速为lBV/h，分段收集解析液。解析出口单位小于10 μ g/ml时，解析完成， 合并有效部分。将收集到的解吸液，进行减压浓缩，真空度〇.〇9Mpa以上，温度控制不超过 55°C，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相进行减压浓缩， 真空度0. 09Mpa以上，温度控制不超过55°C，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素油膏。
[0067] 4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为70% 乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。
[0068] 5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0. 09Mpa以上，温度控制不超 过55°C，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯 相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0. 〇9Mpa以上，温度控制不超过60°C，浓缩至乙 酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用100ml结晶溶剂（结晶 溶剂为丙酮：异丙醚=2:98)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异丙 醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在40-60°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小时，得到无定形4-OH环孢素精粉，HPLC测定如图8,4-OH环孢素的纯度达到了 98. 3%。
[0069] 实施例3
[0070] 1)取4-OH环孢素发酵液28L，含4-OH环孢素9. 8g，加入25L甲醇浸泡5小时，板 框过滤，收集浸提液50L，效价为185 μ g/ml。
[0071] 2)将收集到的浸提液，用1L RX-02T树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h， 收集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。
[0072] 3)将收集到的脱色液，使用1L HZ816柱进行吸附，上样流速为lBV/h，吸附完毕后 检测下柱液效价为3 μ g/ml，废弃。吸附后的树脂经两步洗涤，洗涤剂1为45%甲醇-碱 (lg/L NaOH)，洗涤剂2为45%甲醇，流速均为1~1. 5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用 80% -85%甲醇解析，流速为lBV/h，分段收集解析液。解析出口单位小于10 μ g/ml时，解 析完成，合并有效部分。将收集到的解吸液，进行减压浓缩，真空度〇. 〇9Mpa以上，温度控制 不超过55°C，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相进行减 压浓缩，真空度-0. 〇9Mpa以上，温度控制不超过55°C，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素 油膏。
[0073] 4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为65% 乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。
[0074] 5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0. 09Mpa以上，温度控制不超 过55°C，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯 相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0. 〇9Mpa以上，温度控制不超过55°C，浓缩至乙 酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用80ml结晶溶剂（结晶 溶剂为丙酮：异丙醚=5:95)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异丙 醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在40-60°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小时，得到无定形4-OH环孢素精粉，HPLC测定如图9,4-OH环孢素的纯度达到了 99. 2%。
【主权项】
1. 高纯度4-羟基环孢素的提纯制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 4-羟基环孢素的提取 向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液； (2) 脱色介质脱色 脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液； (3) 吸附介质富集 脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行 解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用； (4) 高压层析制备 将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢素； (5) 结晶纯化 所得4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽 滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中所用洗涤剂依次为45%甲醇一 碱（lg/L NaOH)、45%甲醇；所用解析剂为80%-85%甲醇。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中所用填料为120A 10 μ m C18。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中所用流动相配比为乙腈：水 =50~70 :50~30。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中所用流动相配比为乙腈：水 =65:35〇6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚 =0 ~10:100 ~90 〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚 =5:95〇8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)中4-羟基环孢素的真空干燥温度 为 40-65 °C。 9. 4-羟基环孢素，其特征在于其XRD图如图2所示。 10. 4-羟基环孢素，其特征在于制备方法包括以下步骤： (1) 4-羟基环孢素的提取 向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液； (2) 脱色介质脱色 脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液； (3) 吸附介质富集 脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行 解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用； (4) 高压层析制备 将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢素； (5) 结晶纯化 所得4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽 滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。
【专利摘要】本发明公开一种高纯度4-羟基环孢素及其提纯制备方法，包括如下步骤：？4-羟基环孢素的提取；脱色介质脱色；吸附介质富集；高压层析制备；结晶纯化。本发明采用离子交换树脂脱色，大孔吸附树脂富集，高压层析纯化的方法，各阶段选择特定工艺并互相配合取得了良好的技术效果。
【IPC分类】C07K1/16, C07K7/64
【公开号】CN105646672
【申请号】
【发明人】魏增辉, 胡帅珂, 刘莹, 王乔波, 董国豪, 康志飞, 刘建明, 张志军
【申请人】石家庄中天生物技术有限责任公司, 河北鲲翔济世医药科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月4日